树鼩胸主动脉血管内皮细胞的分离培养与鉴定

目的 体外分离、培养树鼩(Tupaia belangeri)胸主动脉血管内皮细胞(vascular endothelial cells, VECs),并对培养细胞进行初步鉴定, 为新型实验动物树鼩的应用研究提供体外模型。方法 无菌取幼龄树鼩胸主动脉,采用组织块培养法和胰蛋白酶、胶原酶连续消化法分别进行树鼩胸主动脉血管内皮细胞分离,经完全培养液培养,倒置显微镜观察细胞形态,并用抗Ⅷ因子抗体进行荧光染色鉴定细胞。结果 经组织块培养法分离培养的血管内皮细胞,3 d有细胞贴壁,7 d后细胞从组织块中大量长出,15 d汇合为单层;酶消化法所得细胞12 h即贴壁,3～7 d生长较快,12 d汇合成单层,镜下观察发现细胞呈典型的铺路石状;两种方法分离所得原代细胞经体外培养传代,6代内,细胞生长均良好;利用血管内皮细胞标志分子Ⅷ因子进行免疫荧光鉴定后确定为阳性。结论 本研究采用简便的方法成功分离到了树鼩胸主动脉血管内皮细胞,为血管内皮细胞相关研究提供了实验模型。     

树鼩小肠上皮细胞的体外分离培养与鉴定

目的从树鼩小肠分离小肠上皮细胞,探索分离培养方法和条件,为药物开发和病原感染机制研究提供体外细胞模型,并且为建立树鼩小肠上皮细胞系奠定基础。方法采用胶原酶Ⅺ和中性蛋白酶Ⅰ及DTT联合消化树鼩小肠组织块,得到的细胞经完全培养液培养,用相差显微镜观察细胞形态,通过MTT法测定细胞生长曲线,并采用细胞角蛋白荧光染色等方法鉴定细胞。结果经优化分离法得到的肠上皮隐窝细胞团在24 h后贴壁,6 d汇合成片,在显微镜下观察发现细胞团延辐射状向外长出铺路石样和多角状的细胞;第二代后,每隔2~3 d可传代1次;细胞接种3~6 d为对数生长期;细胞角蛋白18进行免疫荧光鉴定后确定为小肠上皮细胞。结论本实验成功地从树鼩小肠分离到了小肠上皮细胞,并且建立了树鼩小肠上皮细胞体外培养的方法。     

人视网膜色素上皮细胞生长特性及可见光对其影响

 研究体外培养的人视网膜色素上皮细胞的生长特性及可见光对其影响.用倒置相差显微镜和透射电镜观察人视网膜色素上皮(hRPE)细胞形态和超微结构,用计数法和噻唑蓝(MTT)法绘制生长曲线.从光照时间、光照时有无血清、光照后是否换液、光照后培养时间这4方面考查可见光对hRPE细胞的损伤情况.实验结果表明,体外培养的hRPE细胞为多角形,有极性,细胞器正常,生长旺盛.(8423±359)lx的可见光光照2h就能对hRPE细胞造成显著损伤.光照时间为5h,光照时培养液中含10%胎牛血清,光照后不换培养液,光照后培养时间为24h,此条件下hRPE损伤率为58%.体外培养的hRPE细胞具有正常的形态结构和生长规律.可见光可对hRPE细胞造成损伤,并且损伤程度有时间积累效应.因此,在日常生活中应尽可能避免阳光直射,减少光照时间,以降低视网膜光损伤发生率,保护眼睛.     

人心房成纤维细胞体外组织块贴壁培养与鉴定

从建立体外循环将进行心脏手术的风湿性心脏病患者体内无菌下取心脏停跳前右心耳组织，采用组织块贴壁法进行心房成纤维细胞的分离培养，通过光学显微镜观察培养后的细胞形态，并通过免疫细胞化学的方法鉴定所分离培养的细胞。贴壁4—6d后可见长梭形贴壁生长的细胞游离出组织块，细胞生长迅速，2—3d后即呈融合状态，细胞排列紧密，有的交叉重叠生长，胞体较大，细胞浆透明，细胞核较大，呈椭圆形，无自发性搏动。免疫细胞化学检测显示所培养细胞波形蛋白呈阳性反应。通过组织块贴壁法顺利分离人心房成纤维细胞。     

乌龟脑和肝组织细胞的体外培养

以乌龟脑和肝组织为材料,用φ=20%胎牛血清的DMEM培养液进行体外培养,同时也对肾、心肌、脾脏、尾部肌肉等组织进行了体外培养,结果表明:原代培养的脑细胞(TBCs)和肝细胞(TLCs)生长良好,传代TBCs前3代生长稳定,第4代出现聚集生长,第5代出现"自发转化"现象,至12代,"转化"后的细胞体系生长旺盛;TLCs传代后不易增殖,第3代出现衰退;肾脏细胞在培养过程中有少量贴壁;心肌、脾脏、尾部肌肉的细胞培养都不成功。     

兔和牛角膜上皮、基质及内皮细胞体外培养和增殖的研究

目的：研究兔和牛角膜上皮、基质及内皮细胞等3种细胞体外培养的生物学特性，探索和改进这3种细胞体外培养的方法，为组织工程角膜奠定基础。方法：采用消化法分离培养兔和牛角膜上皮、内皮和基质细胞，观察细胞贴壁生长情况，同时对生长良好的原代细胞进行消化传代，进一步观察传代细胞的形态和生长情况。结果：角膜上皮、内皮和基质细胞均在培养48～72h贴壁生长，培养6～9d能形成良好单层，细胞形态典型，进行多次传代后细胞仍维持原有形态和功能，获得的细胞能进行长期培养。结论：为兔和牛角膜上皮、内皮和基质细胞体外培养，提供了简单高效经济的方法。     

兔血管平滑肌细胞和聚羟基丁酯（PHB）的细胞相容性实验研究

探索血管平滑肌细胞和新型可降解材料聚羟基西酯（PHB）的细胞相容性,为组织人工血管的构建寻找理想的支架材料。将组织法体外培养的兔血管平滑肌细胞种植在PHB膜片和PHB三维微孔支架上,在相差显微镜下观察细胞的粘附和生长情况,用MTT法测定细胞粘附率和细胞增殖指数,复合培养7d后进行扫描电镜观察并用流式细胞仪（FCM）测定细胞周期、DNA指数。结果兔血管平滑肌细胞在PHB膜片上粘附率为77％,细胞增殖符合细胞的生长曲线,在PHB三维微孔支架上生长情况良好,并被证实为二倍体细胞。结论是兔血管平滑肌细胞和聚羟基西酯（PHB）的细胞相容性较好,但细胞与材料间的粘附有待进一步改善。     

条斑星鲽连续性鳍细胞系的建立与鉴定

为了建立条斑星鲽鳍细胞系,为其细胞工程及病毒学研究奠定基础,对经Ⅱ型胶原酶和透明质酸酶联合消化法所得鳍组织碎块分别用DMEM/F12、L-15和M199培养液(pH7.2)在18～26℃进行了鳍组织的体外培养,并在所筛选出的最适培养液和培养温度下通过添加羧甲基壳寡糖、碱性成纤维样生长因子(bFGF)和I型胰岛素样生长因子(IGF-I)启动了鳍细胞的原代培养。体外培养结果显示,条斑星鲽鳍细胞的最适培养液为DMEM/F12培养液,最适培养温度为22℃,原代培养鳍细胞的生长分裂状态旺盛,细胞形态主要为成纤维样,20d后便可形成汇合细胞单层,经过连续的继代培养已建立了条斑星鲽的连续性鳍细胞系,目前已传至第135代;生长特性检测结果显示,第60代鳍细胞系细胞的群体倍增时间为56.9h,其生长分裂状态依然十分旺盛;染色体分析结果显示,第60代鳍细胞系细胞虽然出现了染色体的非整倍性,但其特征性染色体数目仍为46条,并具有2sm+44t的正常二倍体核型,证明所建立的细胞系确为条斑星鲽连续性鳍细胞系。该细胞系为条斑星鲽的细胞工程育种和病毒-细胞相互作用提供了一个理想的体外研究体系,具有重要的理论意义和应用价值。     

血清饥饿法诱导人角质细胞HaCaT细胞周期同步化的研究

探讨血清饥饿法对人表皮细胞HacaT细胞周期的影响．采用无血清和低血清浓度的DMEM培养基饥饿HaCaT细胞,分别培养6h,12h,22h时,用倒置显微镜观察细胞形态,并且收集各组细胞,用流式细胞仪分析细胞周期各个时相细胞百分比．结果发现HaCaT细胞系在含0．2％FBS的DMEM培养基中培养12h,细胞仍然贴壁生长,并且可以使G0／G1期细胞百分率达到66．5％．因此,血清饥饿法可以应用于人表皮细胞HaCaT同步于G0／G1期,从而为后期药物筛选打下基础．     

培养方法及胎牛血清浓度对人胎儿成纤维细胞体外生长的影响

采用单细胞培养法和组织块培养法从原代培养人胎儿成纤维细胞,并在不同体积分数胎牛血清(FBS)(0%、4%、8%、10%、12%)的条件下观察人胎儿成纤维细胞培养的状况并采用台盼蓝染色法进行活细胞计数.结果表明,早期由组织块培养法原代培养获取的细胞形态要比单细胞培养法原代培养获取的细胞稍好些,且在细胞传代后极少出现无法贴壁的死细胞.FBS对hFFs生长影响比较明显.在实际应用中,在体积分数8%FBS下,采用组织块培养法进行人胎儿成纤维细胞体外培养,效果良好.     

人胎肺细胞培养液中类血小板生成素的初步研究

人正常胎肺细胞用含１０％小牛血清的ＭＥＭ培养液原代培养,后用无血清的１９９培养液继续培养．硝酸纤维膜的斑点酶联免疫印迹法测定显示所收集的无血清培养液中含有能与人重组血小板生成素单抗结合的蛋白质．免疫细胞化学检测发现培养的肺细胞与血小板生成素单抗有明显阳性反应．用小鼠骨髓乙酰胆碱酯酶阳性细胞法测定肺细胞在不同培养时间所收集的培养液促血小板生成活性的大小,结果显示收集的培养液有明显刺激活性并且其活性与肺细胞的密度有相关性．     

Differentiation of a bipotential glial progenitor cell in a single cell microculture

Although it is known that most cells of the vertebrate central nervous system (CNS) are derived from the neuroepithelial cells of the neural tube, the factors determining whether an individual neuroepithelial cell develops into a particular type of neurone or glial cell remain unknown. A promising model for studying this problem is the bipotential glial progenitor cell in the developing rat optic nerve; this cell differentiates into a particular type of astrocyte (a type-2 astrocyte) if cultured in 10% fetal calf serum (FCS) and into an oligodendrocyte if cultured in serum-free medium. As the oligodendrocyte-type-2 astrocyte (0-2A) progenitor cell can differentiate along either glial pathway in neurone-free cultures, living axons clearly are not required for its differentiation, at least in vitro. However, the studies on 0-2A progenitor cells were carried out in bulk cultures of optic nerve, and so it was possible that other cell-cell interactions were required for differentiation in culture. We show here that 0-2A progenitor cells can differentiate into type-2 astrocytes or oligodendrocytes when grown as isolated cells in microculture, indicating that differentiation along either glial pathway in vitro does not require signals from other CNS cells, apart from the signals provided by components of the culture medium. We also show that single 0-2A progenitor cells can differentiate along either pathway without dividing, supporting our previous studies using 3H-thymidine and suggesting that DNA replication is not required for these cells to choose between the two differentiation programmes.     

鸡胚胎干细胞的分离、培养与鉴定的初步研究

采用饲养层培养法,以高糖DM EM为基础培养基,同时添加胎牛血清以及5 ng/m l SCF,l0 ng/m l bFGF和1 000 IU/m l mL IF等细胞因子与鸡胚浸出液等,对鸡的X期胚盘细胞进行离体培养,并利用形态学鉴定、AKP染色、体外分化实验等方法对所获得的细胞克隆进行鉴定。实验结果表明,本实验建立的培养体系培养出了具有多分化潜能的类胚胎干细胞。     

人胎儿骨髓间充质干细胞的分离及生物学鉴定

通过原代细胞培养,从引产胎儿骨髓组织中分离干细胞,然后进行生物学鉴定,旨在体外建立培养胎儿骨髓干细胞的有效方法,为进一步研究干细胞奠定基础．本研究对四个月的引产胎儿骨髓组织进行原代细胞培养,采用贴壁筛选法,在含有15％胎牛血清的L-DMEM／IMDM(1:1)混和培养液中培养,7 d后细胞可长满瓶底．显微镜下观察,细胞形态均一,呈长梭形．传代后,在8代以内的细胞贴壁能力较强,生长速度较快．将其命名为BMMS-03．在第3代时,对培养的细胞进行了于细胞标志物的生物学鉴定,采用流式细胞仪对经免疫荧光染色的细胞进行检测．结果显示:97．2％的细胞呈CD105阳性反应,66．0％的细胞呈CD106阳性反应, 9．2％的细胞呈CD34阳性反应．阴性对照组阳性反应为0．5％．生物学鉴定的初步结果提示,从胎儿骨髓组织中分离培养成功的细胞为骨髓间充质干细胞,其细胞形态学特征、CD105 、CD106 和CD34-的检测结果均符合间充质干细胞的特征．本研究成功地建立了体外培养胎儿骨髓间充质干细胞的有效方法,所获得的间充质干细胞纯度较高,增殖较快,适用于干细胞生物学和组织工程学的研究．     

文昌鱼(Branchiostoma belcheri)离体细胞原代培养初步研究

分别以不同类型的培养液和盐度条件培养文昌鱼尾部、鳃、肝盲囊组织细胞. 观察显示经培养文昌鱼三类组织块在贴壁后24 h内细胞开始从组织块内迁移出来,并迅速增殖形成细胞晕,鳃组织细胞为圆球形状,尾部组织细胞为多边形上皮样细胞,肝盲囊组织细胞为圆球形状. 其中肝盲囊细胞和鳃组织细胞在含0.45% NaCl、15%小牛血清的Eagle's MEM培养粉中生长较其他培养条件好,而尾部组织细胞则在含0.9% NaCl、15%小牛血清的Eagle's MEM培养粉中生长较其他培养条件好. 这样的细胞能存活近40天,从而为文昌鱼体外细胞培养及建细胞系提供了依据.     

A glial progenitor cell that develops in vitro into an astrocyte or an oligodendrocyte depending on culture medium

We have identified a cell type in 7-day-old rat optic nerve that differentiates into a fibrous astrocyte if cultured in the presence of fetal calf serum and into an oligodendrocyte if cultured in the absence of serum. In certain culture conditions some of these cells acquire a mixed phenotype, displaying properties of both astrocytes and oligodendrocytes. These observations suggest that fibrous astrocytes and oligodendrocytes develop from a common progenitor cell and provide a striking example of developmental plasticity and environmental influence in the differentiation of CNS glial cells.     

建立人输卵管上皮细胞无血清培养

人输卵管上皮细胞（HOEC）可以体外较长时间无血清培养,DMEM／F12培养液的培养效果优于Ham’sF10,在加有多种因子和胎球蛋白的培养液中,HOEC可贴壁生长,生长能力达到合质量分数15％FCS的对照组的30％～40％,一般可传代2次,最长培养可维持38d,细胞形态与有血清培养差别不大,虽然无血清培养HOEC的生长速度、密度、传代成功率远不及有血清培养,但能抑制成纤维细胞生长,维持较纯的上皮细胞。