耐辐射菌Micrococcus luteus SC1204总蛋白双向电泳体系的建立

以耐辐射藤黄微球菌Micrococcus luteus SC1204为研究对象,建立总蛋白双向电泳体系.结果表明,采用液氮研磨-酚/超高速离心法提取总蛋白,裂解液Ⅱ(8 mol/L尿素、2mol/L硫脲、60mmol/L DTT、4%CHAPS、40mmol/L Tris、1%pH 3~10NL IPG buffer、0.002%BPB)溶解蛋白,使用24cm、pH 4~7的IPG胶条,上样量250μg及等电聚焦7h(56000Vh),可获得满意分辨率的双向电泳图谱,适用于后续的质谱及差异蛋白质组分析.     

九龙牦牛肉质性状测定及肌肉蛋白质双向电泳的初步分析

肉质性状是畜禽最主要的经济性状.为阐明九龙牦牛(Bos grunniens)肉质的特性,对不同年龄和性别的九龙牦牛(n=107)肉的部分性状进行了测定.结果表明,0.5岁犊牦牛背最长肌的蛋白质、肌内脂肪(IMF)和肌红蛋白(Mb)含量、剪切力等均显著低于成年牦牛,而这些指标在成年公牦牛与成年母牦牛之间差异不大.不同年龄成年九龙牦牛背最长肌IMF含量接近,提示其IMF沉积受年龄影响相对较小.另外,牦牛背最长肌剪切力存在较大的个体间差异.与成年黄牛相比,牦牛背最长肌IMP含量低,蛋白质含量高,熟化后p H下降幅度小.本研究还建立了九龙牦牛肌肉双向电泳方法,为阐明肌肉差异表达蛋白提供了方法.九龙牦牛肉的蛋白质、IMF和Mb含量以及剪切力等与黄牛有明显差异.     

蚯蚓蛋白质组学研究中3种总蛋白提取方法的比较

双向电泳(2-DE)技术在现阶段的蛋白质组学研究当中,由于其价格相对便宜,仪器设备相对简单而被广泛应用.合适的总蛋白质样品制备方法,可以提高双向电泳蛋白点的数目和分辨率以保证蛋白质组信息的完整性,是整个实验的关键.蚯蚓作为土壤污染和土壤生态毒理学研究的重要生物,其总蛋白质提取的方法学研究还不完善.通过对已发表的文献中的蛋白提取方法进行筛选和优化,利用SDS-PAGE电泳和双向电泳的结果,对三氯乙酸-丙酮沉淀法、裂解液法和酚抽提法对蚯蚓总蛋白提取结果进行了评价,建立了适合蚯蚓蛋白质组学研究的总蛋白样品制备方法.     

适用于小麦叶片总蛋白分析的双向电泳技术

双向电泳技术越来越成为植物蛋白质组研究中的关键技术,样品制备、固相预制胶条水化、等电聚焦及SDS—PAGE都是影响双向电泳结果的重要步骤,本研究以晋麦47号小麦叶片为研究材料,在样品除盐、预制胶条水化方式、第二向SDS—PAGE电压选择方面进行了探索与优化,通过比较双向电泳图谱,建立适用于小麦叶片总蛋白质分析的双向电泳技术体系．结果表明：样品经多步除盐并加长除盐时间后进行双向电泳,蛋白能较好地被分离,2-DE图谱蛋白点较多,分辨率较高;IPG胶条先后经被动水化与主动水化比仅主动水化的2-DE图谱蛋白点损失少;第二向SDS—PAGE中电压选择120V较200V的2．DE图谱蛋白点拖尾少,纹理现象少．     

小鼠肾脏组织的双向电泳

对小鼠肾组织双向电泳(2-DE)实验中的样品保存、裂解液、胶条泡胀和染色等步骤研究发现：在-73℃，以液态保存的样品仍需尽量以相同的保存时间用于对比，或使用新处理的样品使2-DE图谱反映样品原先的蛋白质组成；优化的裂解液组成是尿素9．8mol／L、Tris 40mmol／L、CHAPS 40g／L、DTT 23mmol／L、CA 5g／L、PMSF 1mmol／L和EDTA 1mmol／L；胶条泡胀采用主动方式有利于大分子量蛋白质的2-DE分离；银染色过程中采用充分的水洗步骤使之获得背景鲜明的2-D图谱。在优化条件下，高分子区及碱性区蛋白质均得到理想分离，获得蛋白质点数达1491个，明显优于已有文献方法。     

金钗石斛花芽蛋白质提取及其双向电泳体系优化

通过对蛋白质提取方法、水化方式、等点聚焦程序、IPG胶条选择等方面的优化，建立金钗石斛花芽蛋白质双向电泳体系.结果表明，采用酚抽提法提取蛋白，样品与水化液1∶〖KG-*2/3〗40复溶；被动水化，等点聚焦程序B2；选用24 cm pH 3～10NL 胶条和12% 的凝胶；采用考马斯亮蓝G-250染色，获得了可识别1 422个蛋白质斑点的双向电泳图谱，且重复性好、分辨率高，为进一步开展金钗石斛花芽在蛋白质组学水平上的分析提供了技术支持.     

白藜芦醇诱导HepG2细胞凋亡中线粒体差异蛋白鉴定

为研究线粒体在白藜芦醇诱导人肝癌细胞系HepG2细胞凋亡中的作用机制。分离提取白藜芦醇处理的HepG2细胞及对照组细胞的线粒体蛋白质,双向电泳分离差异蛋白质,飞行时间质谱鉴定差异蛋白点,摸索并建立了一种有效分离提取细胞线粒体蛋白质和双向电泳的方法。初步分析鉴定了四个显著性差异蛋白,着丝粒蛋白Kinesin protein和CENP-E降低,证明白藜芦醇对细胞周期及细胞骨架的调节作用,Peptidase (mitochondrial processing)表达降低,线粒体核糖体蛋白L7/L12（Mitochondrial ribosomal protein L7/L12, MRP L7/L12）表达升高,表明白藜芦醇诱导HepG2细胞与其对线粒体功能的影响有关。     

橡胶草叶片蛋白质提取方法的选择及双向电泳体系的优化

目的为了建立起橡胶草叶片组织的蛋白双向电泳体系。方法采用5种不同方法提取橡胶草叶片蛋白,并通过蛋白提取率和单向SDS-PAGE电泳的比较,筛选出改良TCA-丙酮沉淀法、酚-乙酸铵沉淀法、Tris浸提法3种方法进行2-DE电泳。结果表明选择改良TCA-丙酮法为最合适的蛋白质提取方法。为进一步优化体系,比较了不同染色方法、上样量和固相p H梯度预制胶条(IPG)的p H范围对双向电泳结果的影响,电泳结果表明使用17 cm p H 3-10的IPG胶条、上样量为1200μg、考马斯亮蓝染色法能分离得到更多的蛋白点,是橡胶草叶片双向电泳体系的最优条件。结论本研究初步建立了橡胶草叶片蛋白质双向电泳体系,为深入研究橡胶草蛋白质组学提供依据。     

大鼠骨组织蛋白质组样品提取方法的建立

蛋白质组学是目前研究的重要热点．该拟建立大鼠骨组织蛋白质样品提取的最佳方法．用于双向电泳分离．为进一步进行蛋白组学分析奠定基础．实验对3种不同方法制备的样本进行同一条件的二维电泳(2-DE)图谱．比较2-DE的结果．结果发现，丙酮沉淀法最佳．这些结果提示．只有结合骨组织成分特征与双向电泳的具体要求．选择恰当的样品提取液．采用合理的提取步骤，获得蛋白质样品，才能得到清晰高分辨率的电泳图谱，满足蛋白质组学分析需要。     

甘蔗叶片蛋白质组双向电泳技术优化

为了建立适合甘蔗叶片蛋白质组研究的双向电泳技术,对甘蔗叶蛋白质的溶解方法、IEF电泳、上样量等关键步骤进行了优化.结果表明:裂解液中有2 mmol/L的硫脲才能更充分地溶解蛋白;上样量1.0 mg时得到质量较好的凝胶图谱;甘蔗叶片蛋白质主要分布在pH4～7范围.通过对甘蔗叶片蛋白双向电泳技术的优化,提高了双向电泳图谱分...     

缺铁逆境胁迫下水稻叶蛋白质组的双向电泳分析

水稻幼苗经缺铁胁迫诱导处理1、3、5d后，用酚法和TCA／丙酮法提取叶的可溶性蛋白，进行双向电泳(2-DE)分析．结果显示：(1)三种缺铁胁迫的可溶性蛋白，在不同的pH范围中2-DE图谱上的比较．使用pH3～10宽范围、线性(L)的IPG胶条，经电泳分离后利用Z3图象分析软件，可在SDS-PAGE凝胶上检测到450个左右的蛋白点，酸性蛋白占89％．选用pH4～7窄范围、线性(L)的IPG胶条，经电泳后可在SDS-PAGE凝胶上检测到600个左右的蛋白点，其中缺铁诱导上调表达的有29个点，减弱表达的有1个点，诱导特异表达的有5个点．(2)不同方法提取可溶性蛋白的差异．酚法提取的蛋白再溶性好，纯度较高．TCA／丙酮法简单易操作，蛋白损耗少，在2-DE图象上．碱性端显示的蛋白点较多，但此法的缺点是再溶性差，对2-DE成功分离蛋白有影响．     

对B.t毒素敏感与抗性的昆虫细胞的差异蛋白质肽质指纹分析

采用2-DE技术分析了粉纹夜蛾TnH5对B.t CrglAC毒素敏感和抗性2种细胞总蛋白质,建立了TnH5细胞双向电泳图谱,获得了一些差异蛋白质.对部分差异蛋白质点采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/MS)测定了其胶内酶解后的肽质指纹图谱(PMF),查询数据库,结果表明,部分差异斑点分别与胞质外周蛋白、脂多糖生物合成蛋白、一种脱氢酶和类免疫球蛋白等类似.     

蒙古沙冬青根蛋白的提取及双向电泳体系的建立

以蒙古沙冬青根为实验材料,采用TCA/丙酮沉淀法和Tris-饱和酚提取法分别提取根可溶性蛋白.用Bradford法测定蛋白质浓度,计算蛋白提取率,并对所提取的蛋白样品进行双向电泳检测及电泳体系优化.结果表明,选择Tris-饱和酚法提取蛋白,采用24cm、pH5～8的IPG胶条,上样量900μg,可获得分辨率高、重现性好的双向电泳凝胶图.     

麦洼牦牛肉和高山牦牛肉品质差异性的比较分析

为探究不同地区牦牛肉食用品质及营养品质之间的差异,以四川红原县麦洼牦牛和西藏当雄县高山牦牛背最长肌为试验材料,测定分析了两种牦牛肉的食用品质、营养品质、氨基酸以及脂肪酸含量.结果表明:宰后成熟过程中,两种牦牛肉p H、L*值和a*值均无显著差异,麦洼牦牛肉b*值显著高于高山牦牛肉(P 0. 05);高山牦牛肉嫩度和保水性均优于麦洼牦牛肉;两种牦牛肉水分、蛋白质以及灰分含量均无显著差异,且麦洼牦牛肉脂肪含量显著低于高山牦牛肉(P 0. 05);与高山牦牛肉相比,麦洼牦牛肉具有更好的氨基酸组成和更高的营养价值,且重要脂肪酸含量或比例也均极显著高于高山牦牛肉(P 0. 01).综上所述,麦洼牦牛肉虽然食用品质不及高山牦牛肉,但其具有更高的营养价值.     

微乳液毛细管电动色谱法测定雷公藤炮制品中雷公藤甲素的含量

利用微乳液毛细管电动色谱法测定不同雷公藤炮制品中雷公藤甲素的含量.在含1%(w/v)十二烷基硫酸钠(SDS),3%(v/v)正丁醇,1%(v/v)乙酸乙酯和96%(v/v)5mmol/L硼砂-10mmol/L磷酸二氢钠溶液(pH 8.5)的微乳体系下,雷公藤炮制品中的雷公藤甲素在10min内得到良好的分离与检测.不同雷公藤炮制品中雷公藤甲素含量的测定结果:其中生品中的含量最高,为2.008 5g/g,其余炮制品雷公藤甲素的含量分别为清炒品1.716 6g/g,酒炙品1.541 2g/g,水煮品1.758 4g/g.     

毛细管电泳分析牦牛肉中肌苷酸含量方法的优化

为提高毛细管电泳(CE)测定牦牛肉中肌苷酸(IMP)含量的效率,用高氯酸法提取3岁公牦牛(n=8)背最长肌中的IMP,然后用短毛细管柱(有效长度30 cm)检测IMP含量.结果表明,短毛细管柱与长毛细管柱(有效长度50 cm)相比,测定的IMP含量十分接近,而且短柱获得的峰形更尖锐,检出时间缩短到3.5 min,在IMP浓度为10μg/ml~160μg/ml范围内具有良好的线性关系(R2=0.9974);通过精密度、加标回收率测定,以及IMP与其他几种核苷酸一磷酸的分离,均显示短毛细管柱对IMP的分离定量与长毛细管柱相近.建立了一种快速、低成本检测牦牛肉中IMP含量的方法.     

肝癌细胞株HepG2的G1期、G2/M期细胞蛋白质组表达差异的研究

通过TdR(胸腺嘧啶核苷)调控人肝癌细胞株HepG2的细胞周期,运用双向电泳-图像分析-质谱技术研究肝癌细胞株HepG2的G1期、G2/M期全细胞蛋白质组表达的差异,探索参与肝癌细胞株HepG2的G1期、G2/M期调控相关的蛋白.以TdR诱导肝癌细胞株HepG2,分别得到同步化的G1期、G2/M期细胞,流式细胞术检测.采用比较蛋白质组学的研究技术(双向电泳、质谱分析)筛选G1期、G2/M期差异表达的蛋白质.结果流式细胞术检测显示TdR诱导后,分别获得(63.62±2.82)%的G2/M期同步化细胞,(75.24±0.17)%的G1期同步化细胞,通过双向电泳-图像分析-质谱技术得到21个差异表达的蛋白.其中G2/M期表达,G1期未见表达有10种蛋白;存在三倍以上的差异点11个:2种在G2期表达上调,9种在G1期表达上调.说明TdR阻断法能够获得很好的同步化细胞.质谱鉴定得到的这些差异表达的蛋白质涉及到细胞周期调控、DNA结合、转录调控、mRNA剪接、肽链合成起始、折叠以及细胞代谢等方面.     

沙田柚和酸柚花粉壁蛋白的双向电泳分析

采摘沙田柚(Citrusgrandisvar.shatinyuHort)以及野生酸柚(CitrusgrandisL.)盛花期的雄花,将两者的花粉放入冷的pH6.7,1%NaCl缓冲液[10%蔗糖,0.45mmol/LCa2+(CaCl2·6H2O),1.63mmol/LB(H3BO3)],分别在5,10,20,30,40,50,60,180min时间提取后抽滤,滤液含壁蛋白.双向电泳(IEF/SDS-PAGE)对沙田柚和酸柚花粉壁不同时间蛋白提取物进行比较分析.结果表明,两者的蛋白质分布格局明显不同:沙田柚花粉壁的蛋白质斑点主要分布于pH7.2～5.8之间,而酸柚的花粉壁蛋白质斑点密集于pH8.0～6.5和pH5.8～4.0两个区域范围之间;就相对分子质量分布区域而言,沙田柚花粉壁的蛋白质斑点主要密集于14.4～43.0ku,而酸柚在20.1～43.0ku和66.2～97.4ku两个区域内分布有较多的蛋白质斑点.     

七筋菇基因组DNA提取方法的比较研究

目的对七筋菇基因组DNA提取和ISSR-PCR扩增模板浓度进行优化。方法以常规的CTAB法为基础,对七筋菇基因组DNA提取进行了优化:提取液中加入PVP(6%(w/v)),β-巯基乙醇的浓度提高至5%(w/v);第一次抽提后,重新加入提取液及抗坏血酸(20%(w/v)),65℃水浴30 min。结果所提样品DNA,A260/280,A260/230的平均光吸收值分别为1.78,1.99,浓度为105 ng/μL左右,ISSR扩增带多且清晰明亮,稳定性及多态性高,表明DNA纯度高;对扩增反应的最佳模板浓度进行研究表明,所提DNA模板稀释2倍效果最好(浓度为50 ng/μL)。结论改良后的CTAB法适于提取七筋菇植物的基因组DNA。     

适合杨树叶片蛋白质组学样品制备方法的比较（英文）

【目的】为了提高植物叶片中低丰度蛋白质的检测效率,建立有效的杨树叶片蛋白质组学分析的蛋白质提取方法。【方法】利用三氯乙酸-丙酮结合PEG分级提取方法和SDS-酚结合PEG分级提取方法对杨树叶片蛋白质进行提取,并采用SDS-PAGE和双向凝胶电泳(2-DE)对提取结果进行评价。【结果】SDS-PAGE实验结果显示,三氯乙酸-丙酮结合PEG方法优于SDS-酚结合PEG分级方法。三氯乙酸-丙酮结合PEG分级和非结合PEG分级提取蛋白质的双向电泳结果表明,PEG分级能有效地去除高丰度蛋白质Rubisco,提高低丰度蛋白质的检测。三氯乙酸-丙酮结合PEG分级法检测的蛋白质比非结合PEG分级法多90个蛋白质点。【结论】以LTQ-Orbitrap XL分析三氯乙酸-丙酮结合PEG分级分离的一些蛋白质显示,三氯乙酸-丙酮结合PEG分级对于2-DE和MS鉴定低丰度蛋白质是一种有效的分离方法。