油菜双向电泳技术体系的优化

为建立一套可以较好地分离油菜不同器官(花蕾、化药、叶片)的双向电泳技术体系,对IPG胶条的pH范围、凝胶染色的方法以及蛋白质的上样量进行优化.结果表明,以pH=4~7,17cm的IPG胶条进行双向电泳,胶体考马斯亮蓝染色,蛋白质上样量为800μg时,油菜的花蕾、化药以及叶片蛋白质均可得到很好的分离,获得的2-DE凝胶图谱清晰.为检验优化后的双向电泳技术体系与质谱的兼容性,选取10个蛋白质点进行肽质量指纹图谱分析,发现这些蛋白质点经质谱分析后均可得到成功鉴定.表明该分离体系与质谱兼容性较好,蛋白质点鉴定成功率较高.     

金钗石斛花芽蛋白质提取及其双向电泳体系优化

通过对蛋白质提取方法、水化方式、等点聚焦程序、IPG胶条选择等方面的优化，建立金钗石斛花芽蛋白质双向电泳体系.结果表明，采用酚抽提法提取蛋白，样品与水化液1∶〖KG-*2/3〗40复溶；被动水化，等点聚焦程序B2；选用24 cm pH 3～10NL 胶条和12% 的凝胶；采用考马斯亮蓝G-250染色，获得了可识别1 422个蛋白质斑点的双向电泳图谱，且重复性好、分辨率高，为进一步开展金钗石斛花芽在蛋白质组学水平上的分析提供了技术支持.     

小鼠肾脏组织的双向电泳

对小鼠肾组织双向电泳(2-DE)实验中的样品保存、裂解液、胶条泡胀和染色等步骤研究发现：在-73℃，以液态保存的样品仍需尽量以相同的保存时间用于对比，或使用新处理的样品使2-DE图谱反映样品原先的蛋白质组成；优化的裂解液组成是尿素9．8mol／L、Tris 40mmol／L、CHAPS 40g／L、DTT 23mmol／L、CA 5g／L、PMSF 1mmol／L和EDTA 1mmol／L；胶条泡胀采用主动方式有利于大分子量蛋白质的2-DE分离；银染色过程中采用充分的水洗步骤使之获得背景鲜明的2-D图谱。在优化条件下，高分子区及碱性区蛋白质均得到理想分离，获得蛋白质点数达1491个，明显优于已有文献方法。     

橡胶草叶片蛋白质提取方法的选择及双向电泳体系的优化

目的为了建立起橡胶草叶片组织的蛋白双向电泳体系。方法采用5种不同方法提取橡胶草叶片蛋白,并通过蛋白提取率和单向SDS-PAGE电泳的比较,筛选出改良TCA-丙酮沉淀法、酚-乙酸铵沉淀法、Tris浸提法3种方法进行2-DE电泳。结果表明选择改良TCA-丙酮法为最合适的蛋白质提取方法。为进一步优化体系,比较了不同染色方法、上样量和固相p H梯度预制胶条(IPG)的p H范围对双向电泳结果的影响,电泳结果表明使用17 cm p H 3-10的IPG胶条、上样量为1200μg、考马斯亮蓝染色法能分离得到更多的蛋白点,是橡胶草叶片双向电泳体系的最优条件。结论本研究初步建立了橡胶草叶片蛋白质双向电泳体系,为深入研究橡胶草蛋白质组学提供依据。     

缺铁逆境胁迫下水稻叶蛋白质组的双向电泳分析

水稻幼苗经缺铁胁迫诱导处理1、3、5d后，用酚法和TCA／丙酮法提取叶的可溶性蛋白，进行双向电泳(2-DE)分析．结果显示：(1)三种缺铁胁迫的可溶性蛋白，在不同的pH范围中2-DE图谱上的比较．使用pH3～10宽范围、线性(L)的IPG胶条，经电泳分离后利用Z3图象分析软件，可在SDS-PAGE凝胶上检测到450个左右的蛋白点，酸性蛋白占89％．选用pH4～7窄范围、线性(L)的IPG胶条，经电泳后可在SDS-PAGE凝胶上检测到600个左右的蛋白点，其中缺铁诱导上调表达的有29个点，减弱表达的有1个点，诱导特异表达的有5个点．(2)不同方法提取可溶性蛋白的差异．酚法提取的蛋白再溶性好，纯度较高．TCA／丙酮法简单易操作，蛋白损耗少，在2-DE图象上．碱性端显示的蛋白点较多，但此法的缺点是再溶性差，对2-DE成功分离蛋白有影响．     

大鼠骨组织蛋白质组样品提取方法的建立

蛋白质组学是目前研究的重要热点．该拟建立大鼠骨组织蛋白质样品提取的最佳方法．用于双向电泳分离．为进一步进行蛋白组学分析奠定基础．实验对3种不同方法制备的样本进行同一条件的二维电泳(2-DE)图谱．比较2-DE的结果．结果发现，丙酮沉淀法最佳．这些结果提示．只有结合骨组织成分特征与双向电泳的具体要求．选择恰当的样品提取液．采用合理的提取步骤，获得蛋白质样品，才能得到清晰高分辨率的电泳图谱，满足蛋白质组学分析需要。     

大麻蛋白质组的双向电泳技术建立

蛋白组学研究中最关键步骤是样品制备,为得到高质量的双向电泳蛋白图谱,作者通过对TCA/丙酮法对大麻茎、叶进行蛋白样品制备、双向电泳技术流程进行优化,建立了适于大麻茎、叶的双向电泳技术体系.优化双向电泳体系为:裂解液在传统配方中加入Tris-HCl(p H=8.8),以Triton X-100代替CHAPS,蛋白裂解后加入4倍体积100%预冷丙酮等均可有效去除各种非蛋白杂质;IPG胶条p H=4~7,24 cm,考染上样量800μg/胶条可得到背景清晰、分辨率高的双向电泳图谱.大麻茎中可分辨的蛋白点为1 027±12,叶中为905±8.该体系能同时适用于大麻茎、叶,并能满足下一步蛋白质谱测序分析的要求,可为大麻蛋白组学的发展提供技术支持.     

小麦抗叶锈病相关蛋白的初步分析

以小麦抗叶锈病近等基因系TcLr10和感病亲本Thatcher为植物材料.在未接种小麦叶锈菌之前提取二者叶片的蛋白质,并在接种小麦叶锈菌之后24h,48h,72h分别提取TcLr10与Thatcher叶片的蛋白质组,将提取的全部样品进行双向电泳.对所得蛋白质双向电泳图谱进行分析,结果表明,在未接种叶锈菌时TcLr10与Thatcher存在三个点的差异,其中有两个蛋白质点在TcLr10表达量明显高于感病亲本Thatcher,另一个点在TcLr10中有表达而在Thatcher中未发现;接种叶锈菌后TcLr10与Thatcher中均诱导产生一蛋白质点,但该点在Lr10中诱导产生的速度和量均明显高于感病亲本Thatcher.     

精子膜抗原提取、纯化及SDS—PAGE分析

目的：分析正常生育男性精细胞膜抗原，以便进一步应用精子抗原于其抗体的检测。方法：1．精子膜抗原粗制方法，按“全国临床检验操作规程”(第二版，1998年，P398)描述的方法进行，即收集20名正常生育男性精子样品，用含0．5％NP—40的Tris—Hcl缓冲液抽提。2．粗提液蛋白含量测定采用紫外分光光度法。3．蛋白抗原纯化方法，采用冰冷乙醇沉淀法，以粗提液：冰冷95％乙醇(—20℃)＝1：9(v/v)混合，并按1／50容量加入饱和乙酸钠混匀，于—20℃放置48h。取出后于—10℃，1800g离心30分钟，弃上清，例放试管，沥干沉淀，—20℃保存备用。4、SDS—PAGE分析，步骤3所获样品，以NS溶解，通过紫外分光光度计测定含量，并调节到6mg/ml。SDS—PAGE分析条件的点样量25μl，分离胶17．5％，隔层胶5％，电泳缓冲液用甘氨酸—Tris，PH18．6，电压20v过夜，次日再150V4h。电泳后凝胶经考麦斯亮兰染色、乙酸—甲醇洗脱，直至显示清晰电泳图谱。结果：1、粗提液经紫外分光光度计测定，其原液含蛋白质为24mg/ml，最大吸收峰值280nm。2．纯化的精子膜抗原溶液经SDS—PAGE分析，图谱显示2个蛋白斑，与标准蛋白比较，其分子量一个为35—45KD，另一个为15—25KD；75—85KD处出现微量痕迹。结论：我们成功地进行了精子膜抗原提取、纯化及SDS—PAGE分析实验，结果有清晰记录，为进一步应用精子抗原检测精子抗体的研究提供物质基础。     

结核分枝杆菌H37Rv株与耐异烟肼菌株间细胞壁蛋白质组双向电泳图谱比较

利用双向电泳技术可以对体外培养的结核分枝杆菌非耐药型菌株和耐药型菌株进行细胞壁蛋白质组学比较,寻找与耐药相关的蛋白质．结核分枝杆菌H37Rv株与耐异烟肼菌株在Middlebrook 7H9 Broth培养基中37℃摇床培养1个月后,从培养物中提取结核分枝杆菌细胞壁蛋白．以pH4～7的IPG预制胶条为第一向等电聚焦,以SDS-PAGE为双向电泳第二向,经过银氨染色,图像扫描后,利用软件分析处理图像．在结核分枝杆菌H37Rv株和耐异烟肼菌株的细胞壁蛋白质凝胶图谱中分别检测出499和582个蛋白质斑点．它们的蛋白质分子质量分布基本相似,其中有102个斑点差异显著．这为研究耐异烟肼菌株的耐药机制提供了蛋白质组学方面的信息．     

拟南芥全细胞蛋白质样品制备及其双向电泳条件的优化

对双向电泳方法进行了改进， 包括对样品的制备、 双向电泳参数的选择等关键步骤进行优化. 实验发现， 采用乙酸铵 甲醇沉淀拟南芥全细胞蛋白质， 同时结合高伏时、 长时间的等电聚焦可以获得高分辨率、 重复性好的蛋白质双向电泳图谱. 银染后， 经Phoretix 2D v2004软件分析可分辨出1 000以上蛋白点.     

COC1/DDP亚细胞中波形纤维蛋白的肽质谱指纹分析

目的寻找与鉴定卵巢癌耐药株中的差异表达蛋白质。方法应用高分辨二维凝胶电泳分离卵巢癌细胞中差异表达的波形纤维蛋白,并通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱对其进行分析与鉴定。结果获得了分辨率和重复性均较佳的凝胶电泳图谱,图像分析显示波形纤维蛋白表达明显下调。结论与其他方法相比,应用凝胶电泳和生物质谱联用技术分析与鉴定未知蛋白具有简单快捷的特点。     

日本囊对虾性腺蛋白质双向电泳的样品制备方法的改进

采用一种能同时提取RNA、DNA和Protein的试剂(RDP试剂)进行日本囊对虾性腺总蛋白质的制备,并通过双向电泳(2 - DE)技术与传统的裂解液法比较提取效果.RDP法所得2- DE图谱清晰,条纹少,蛋白质点数多,而裂解液法存在横向和纵向拖尾,其碱性端蛋白质点大量缺失,说明RDP法能有效去除蛋白质样品中盐离子、脂...     

正常与性早熟河蟹视神经节蛋白的二维电泳初步分析

利用双向电泳技术比较正常和性早熟河蟹视神经节蛋白的表达差异,旨在探索蛋白质组学技术在甲壳动物中尤其是河蟹的性早熟研究当中的应用.结果发现,明显差异的蛋白点共24个,为以后通过蛋白质组学手段筛选出真正影响性早熟发生的蛋白质或酶奠定了基础.     

巴西橡胶树树皮蛋白质组学分析体系的构建

巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)是一种重要的产胶植物,其体内合成和贮存胶乳的地方是乳管系统,而乳管主要分布于树皮中。以10年生巴西橡胶树无性系“热研88-13”为研究对象,采用改进的三氯乙酸(TCA) 丙酮沉淀法提取树皮蛋白,使用17 cm,pH 4~7的IPG胶条进行双向电泳,得到良好的蛋白图谱。PDQuest软件(Bio rad)分析银染后的凝胶,共得到约350个蛋白点。从这些蛋白点中随机选取10个蛋白点经基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI TOF MS)分析后,搜索NCBInr数据库对蛋白进行鉴定。结果显示,这些蛋白主要包括两种来源于巴西橡胶树中的重要蛋白,即橡胶小粒子蛋白(Small rubber particle protein)和橡胶树凝集因子(hevein),此外还有一些其他功能和未知功能的蛋白。     

肝癌细胞株HepG-2的G1期细胞蛋白质组双向电泳图谱的建立

采用双向电泳分离肝癌细胞株 HepG2 的 G1 期细胞的蛋白质,经考马斯亮蓝染色及图像扫描与分析显示:在 pH3-10,13 cm 的 IPG 胶条上,可分离到 227 个重复性及分辨率均较好的蛋白斑点,蛋白斑点的匹配率为 84%.建立了 HepG2 的G1 期细胞蛋白质组双向电泳图谱,为其蛋白质组学的进一步研究奠定了基础.     

高酸重质原油电脱盐脱水工艺研究

对高酸重质原油PL19-3进行了破乳剂评价,其中破乳剂G和DLS1603效果较好.考察了影响电脱盐的因素,确定了高酸重质原油PL19-3电脱盐的最佳工艺条件范围:温度130~140℃,注水量6%~8%,场强900~1100 V/cm,破乳剂注入量10.0 mg/L.在选定的工艺条件下进行三级电脱盐动态模拟实验,三级脱后原油含盐≤3 mg/L,含水≤0.2%,PL19-3原油经过三级电脱盐,脱后原油含盐含水均达到中石化的相应技术指标.     

适于双向电泳分析的银杏叶绿体蛋白质提取方法

【目的】获得银杏叶绿体蛋白质的提取方法,在蛋白质水平探讨银杏光合作用对环境的响应机制。【方法】建立一种适合银杏叶绿体蛋白双向电泳分离的实验体系,采用Tris-平衡酚抽提法对银杏叶绿体蛋白质进行提取,并与三氯乙酸(TCA)-丙酮沉降法进行对比分析。【结果】Percoll密度梯度离心法适用于银杏叶绿体的提取,提取的叶绿体平均完整率在85%左右。单向电泳结果显示,与TCA-丙酮沉降法相比,在用Tris-平衡酚抽提法分离的叶绿体蛋白质泳道中,低分子质量蛋白质条带更多、更清晰。进一步的双向电泳结果表明,用Tris-平衡酚抽提法对银杏叶绿体蛋白质进行提取,蛋白质产量更高,图谱清晰,所分离的蛋白点更多,形态更好,条纹影响相对较小。【结论】Tris-平衡酚抽提法可有效地提取高质量的叶绿体蛋白质并进行双向电泳,可用于银杏叶绿体的蛋白质组学分析。     

Two-dimensional gel electrophoresis analysis of the proteomes expressed in the human hepatoma cell line BEL-7404 and normal liver cell line L-02

Proteome analysis technology has been used extensively in conducting discovery research of biology and has become one of the most essential technologies in functional genomics. The proteomes of the human hepatoma cell line BEL-7404 and the normal human liver cell line L-02 have been separated by high resolution two-dimensional gel electrophoresis (2-DE) with immobilized pH gradient isoelectric focusing (IPG-IEF) in the first dimension and sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) in the second dimension (IPG-DALT). The resulting images have been analyzed using 2-D analysis software. Quantitative analysis reveals that 7 protein spots are detected only in hepatoma BEL-7404 cells, 14 only in L-02 cells, and 78 protein spots show significant fluctuation in quantity in both cell lines (P< 0.01). These protein spots have been displayed on a proteome differential expression map. Analysis for the reproducibility of 2-DE indicates that the positional variability in the IEF dimension is 0.73 mm, while the variability in the SDS-PAGE dimension is 0.44 mm, and the quantitative variability is 17.6%–19.2%. These results suggest that the reproducibility of 2-DE has been suitable for the study of differential expression of proteomes. Proteome differential expression maps can be useful tools for disease diagnosis, drug-target validation analysis and biological process elucidation.