海南罗非鱼源维氏气单胞菌的分离、毒力基因检测及ERIC-PCR分型

从海南罗非鱼的体内分离和鉴定出40株维氏气单胞菌,并对这40株维氏气单胞菌进行了8种毒力基因检测及ERIC-PCR分型分析.毒力基因检测的结果表明:在这40株维氏气单胞菌中,主要携带6种毒力基因,即act,alt,ast,fla,lip和hlyA基因,其携带率分别为35.0%,22.5%,27.5%,37.5%,5.0%和15%,未能检测到TapA和aerA基因;根据不同菌株携带毒力基因的不同,这40株维氏气单胞菌又可分为13种毒力基因型,携带2种以上毒的菌株有15株,占总数的37.5%,携带3种以上毒力基因的菌株有9株,占总数的22.5%,其中HNWC23携带5种毒力基因,其毒力基因型为act~+alt~+ast~+hly A~+fla~+.ERIC-PCR分型结果显示:该40株维氏气单胞菌可分为四个大簇,以遗传相似度(96%)为界可将其分为18种ERIC型,每个簇中的ERIC型都呈现多样性.     

嗜水气单胞菌蛋白质组分子解剖图谱的初步建立

采用蛋白质组学技术,建立了嗜水气单胞菌PPD(134/91)在稳定期的蛋白质组分子解剖图谱.将嗜水气单胞菌接种于LB培养基28℃培养18h,取菌总蛋白进行2 DPAGE.从2 DPAGE图谱中随机选取124个蛋白质点进行肽质量指纹图谱鉴定,检索发现其中10个确定为数据库中收录的嗜水气单胞菌的基因或蛋白,其比例约为1/12.实验结果对嗜水气单胞菌菌株之间的比较研究和功能蛋白质组研究具有重要参考价值.     

嗜水气单胞菌的研究进展

回顾了嗜水气单胞菌的生物学性状、血清型、致病性以及致病机理的研究情况,并概述了嗜水气单胞菌的致病毒力因子和诊断检测技术方面的研究情况及新的研究进展.     

双重PCR法快速检测欧鳗鲡嗜水气单胞菌

采用已知的嗜水气单胞菌编码溶血素(Hemolysin)和外膜蛋白(Ompts)的基因序列为目的基因,依据其保守序列设计两对相应引物,用双重PCR方法检测了32株从发病欧鳗鲡分离的细菌,将检测结果与试剂盒快速生化鉴定结果进行比较.以嗜水气单胞菌为阳性对照,以大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、铜绿假单胞菌、鳗弧菌、溶壁微球菌、金黄色葡萄球菌为阴性对照检测了嗜水气单胞菌溶血素与外膜蛋白基因的特异性.结果表明:被检测的32株欧鳗鲡致病菌中,检测到的4株既有溶血素基因又有外膜蛋白基因的细菌,其生化鉴定结果全部为嗜水气单胞菌,而仅具有外膜蛋白基因的13株细菌中只有5株生化鉴定结果为嗜水气单胞菌.证明双重PCR法可用于快速检测部分嗜水气单胞菌.     

温度和pH值对嗜水气单胞菌毒力基因表达的影响

为了解培养温度和pH值对嗜水气单胞菌的毒力基因表达以及致病性的影响，利用反转录PCR（RT—PCR）对4种基因的表达进行了研究。研究结果显示嗜水气单胞菌毒力基因的表达受温度和pH值影响，其中溶血素（AHH）、气溶素（AerA）、外膜蛋白（OMP）和粘附素（Aha）毒力基因在15℃、25℃和37℃下均能高效表达，在4℃AHH和AerA两基因也能持续表达，但OMP和Aha两基因的表达停止。在中性或偏酸性的条件下（pH5．0和pH7．0）4种毒力基因都得以表达，在碱性条件下（pH9．0）4种基因中只有AHH得以表达，而Aha等其它3个基因的表达减弱或停止。基因表达的研究结果得到鲫鱼攻毒试验结果的支持。此外，研究还表明细菌的毒力与鱼的体温也有关系。     

嗜水气单胞菌的分离培养及鉴定

从患腹水病褐牙鲆体内分离致病菌,通过生理生化鉴定方法对该菌进行了鉴定.根据Genbank 上报道的嗜水气单胞菌标准株的16s rDNA序列以及致病性嗜水气单胞菌所含有的气溶素(aer)基因没汁了2对引物,对所分离到的2株疑似菌以及3株标准株进行PCR扩增,均能够扩增出目的条带,经测序后,该菌的16s rDNA的序列、aer序列与标准株同源性分别达到99.8%和95%,与常规细菌鉴定方法所得结果一致,证明该菌为嗜水气单胞菌.     

超分支滚环扩增法检测美洲鳗鲡嗜水气单胞菌

建立了基于锁式探针的超分支滚环扩增检测嗜水气单胞菌的新方法。根据嗜水气单胞菌ARE基因上的一段高保守基因序列,设计锁式探针和对应的扩增引物,并优化了反应条件。探针在T4 DNA 连接酶作用下,16 ℃连接1 h、63 ℃扩增1 h,其扩增产物电泳后得到明显条带。在8种水产养殖病原菌中,只有嗜水气单胞菌可以特异性检出,并且特异性良好,灵敏度（1.0×103 cfu/mL）高于免疫法以及常规的PCR法。对嗜水气单胞菌人工感染的美洲鳗鲡肌肉样品进行检测,发现条带清晰可见。该方法的反应过程是在恒温条件下进行,不需要PCR 仪,此外,样品处理过程简单,应用水煮法即可进行。     

运用SELEX技术筛选嗜水气单胞菌适配子

以嗜水气单胞菌为研究对象,采用适体筛选技术(SELEX,system evolution of ligands by expo-nential enrichment),利用体外合成的长度为78个核苷酸的随机ssDNA文库,以嗜水气单胞菌为靶目标进行12轮的筛选,利用生物素-抗地高辛碱性磷酸酶显色系统检测DNA适配子与嗜水气单胞菌的亲和力.研究结果表明:随着筛选轮数的增加,DNA适配子与嗜水气单胞菌结合后显色,A(absorbance)值逐渐增加,亲和力由最初的0.32升到第9轮的0.72.研究已初步筛选到与嗜水气单胞菌具有高亲和力的DNA适配子,为嗜水气单胞菌的二级结构研究及其检测试剂盒的研发提供了基础.     

不同环境来源的洋葱伯克氏菌对人体健康的风险评估

对来源于不同环境的41株洋葱伯克氏菌进行了毒力基因检测及致病性研究.4个毒力基因(BCESM,cbl A,cepR和cep I)被从数量不等的菌株中扩增到,从而认定了10个风险性较高的菌株;通过苜蓿和生菜模型致病性测定,发现不同来源的很多菌株表现出对苜蓿和生菜不同程度的致病力.所研究的洋葱伯克氏菌株大部分被认定对人体健康存在风险.     

鸭致病性大肠杆菌中耶尔森菌强毒力岛的分子流行病学调查

为了解耶尔森菌强毒力岛(HPI)在鸭致病性大肠杆菌中的流行情况,根据HPI结构基因irp2和fyuA参考序列设计了引物,用PCR方法对从成都等地分离的64株鸭致病性大肠杆菌和28株健康雏鸭泄殖腔拭子分离的大肠杆菌基因进行了扩增和检测,并对5个菌株相关基因进行了克隆和序列分析.结果表明,irp2和fyuA携带率在鸭大肠杆菌病分离株分别为40.6%(26/64)和39.1%(25/64),在健康鸭泄殖腔大肠杆菌分离株分别25.0%(7/28)和21.4%(6/28).鸭大肠杆菌病分离株携带fyuA和irp2的阳性率显著高于健康鸭大肠杆菌分离株(P<0.05),HPI毒力岛的携带率与菌株的致病性呈明显的正相关.分析表明相关基因与GenBank中参考序列的同源性高达98%以上.     

应用多重PCR法鉴定产志贺样毒素大肠杆菌毒力基因

目的：从各种来源的标本中快速鉴定STEC毒力基因，并了解其在菌株中的分布情况．方法：采用多重PCR的方法鉴定STEC的特征性毒力因子stx1，six2，eaeA和hlyA．结果：各种标本中鉴定出产志贺毒素的大肠杆菌共46株，38株(82．6％)携带stx1基因，30株(65．2％)具有six2基因，22株(47．8％)同时检测到2种基因．36株(78．3％)检测到hlyA基因，24株(52．2％)有eaeA基因．4种毒力基因即six1 stx2 eaeA hlyA的有19株(41．3％)，而且血清型均为O157．结论：产志贺样毒素大肠埃希菌毒力基因图谱是一个重要的分子流行病学标志，应用多重PCR可简便、快速、敏感、特异性地鉴定出STEC的特征性毒力基因，并依照毒力基因存在情况判定其致病性能．     

广西猪瘟病毒的调查研究

１９８６～１９８９年，从广西５个地、市的１０个病猪场猪体中分离到１０个病毒。用猪瘟石门系标准强毒作对照，经病原性、抗原性及血清学试验，培养特性，血细胞吸附及病毒的形态结构观察，证明１０个毒株为猪瘟病毒。它们有共同的抗原性。它们之间的区别只是毒力的强弱不同。从临床症状、病理变化和病程方面看，９个为亚急性猪瘟毒株；一个为慢性或温和性猪瘟毒株。     

耐碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的分离鉴定及生物学特性分析

以临床尿路感染患者尿液为研究对象,通过分离培养及16s rDNA进行肺炎克雷伯菌的分离鉴定;采用Kirby-Bauer纸片法进行药敏实验,并对分离株进行碳青霉烯酶表型筛选;通过PCR检测常见的碳青霉烯酶耐药基因、荚膜血清型和毒力基因分布情况;对分离的肺炎克雷伯菌株进行了生物被膜形成能力及其对小鼠致病力的分析。本研究从采取的86例尿液标本中分离检出11株耐碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌,分离率为12.79%。耐碳青霉烯酶基因PCR检测结果显示,blaNDM、blaVIM、blaIMP和blaKPC基因在分离株中均呈现不同程度的分布。耐药性分析发现11株肺炎克雷伯菌对氨苄西林耐药率为90.91%,对头孢噻肟耐药率为63.64%,对链霉素、庆大霉素、氯霉素和诺氟沙星的耐药率较低。耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌荚膜分型结果显示,分离的11株细菌中10株均为强毒力型菌株（90.9%）,其中K57血清型4株（36.4%）,K1血清型1株（9.1%）,K2血清型1株（9.1%）,K5血清型1株（9.1%）,K20血清型3株（27.3%）,提示该批分离株具有较强的致病力。此外,毒力因子分布结果显示,其毒力因子rmpA（54.5%）、Aerobactin F（54.5%）在菌株中分布较为广泛。生物被膜形成能力检测及小鼠致病性试验结果显示,9株分离株均有较强的生物被膜形成能力,菌株致病力可能与荚膜血清型及生物被膜形成能力相关。综上所述,临床分离的致尿路感染病原肺炎克雷伯菌呈现多重耐药特征,强毒力菌株以K57荚膜型为主,K1、K2均有分布,提示对尿路感染病原应加强耐药监测,合理使用抗菌药物,有效防控多重耐药和强毒力菌株的感染与流行。     

4种鱼中DFF基因的检测

根据人类DFF基因的DNA序列，设计了一对引物，通过PCR扩增得到了该基因的一个片断，经地高辛标记作为探针对4种鱼基因组DNA（经过限制酶消化）进行了Southern杂交检测，结果表明：在鲤鱼和鲫鱼中存在一个大小为3.7Kb杂交带，在泥鳅和大鳞副泥鳅中存在的杂交带为4.5Kb，明DFF基因在进化过程中具有保守性，本研究为鱼类DFF基因的克隆奠定了基础。     

Parallel evolution of virulence in pathogenic Escherichia coli

The mechanisms underlying the evolution and emergence of new bacterial pathogens are not well understood. To elucidate the evolution of pathogenic Escherichia coli strains, here we sequenced seven housekeeping genes to build a phylogenetic tree and trace the history of the acquisition of virulence genes. Compatibility analysis indicates that more than 70% of the informative sites agree with a single phylogeny, suggesting that recombination has not completely obscured the remnants of ancestral chromosomes. On the basis of the rate of synonymous substitution for E. coli and Salmonella enterica (4.7 x 10(-9) per site per year), the radiation of clones began about 9 million years ago and the highly virulent pathogen responsible for epidemics of food poisoning, E. coli O157:H7, separated from a common ancestor of E. coli K-12 as long as 4.5 million years ago. Phylogenetic analysis reveals that old lineages of E. coli have acquired the same virulence factors in parallel, including a pathogenicity island involved in intestinal adhesion, a plasmid-borne haemolysin, and phage-encoded Shiga toxins. Such parallel evolution indicates that natural selection has favoured an ordered acquisition of genes and the progressive build-up of molecular mechanisms that increase virulence.     

翘嘴鳜肝肾坏死症病原菌的分离及初步鉴定

从主要呈现肝肾坏死症的翘嘴鳜病灶部位分离到９个菌株,其中３个菌株能通过人工感染在正常翘嘴鳜上复制出与自然发病相同的症状。用直接荧光抗体法对致病菌株的鉴定结果表明,本研究中分离的３个菌株均不同于过去从患病翘嘴鳜上已经分离到的柱状嗜纤维菌（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ ｃｏｌｕｍｎａｒｉｓ）和嗜水气单胞菌（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）。     

蜡状芽孢杆菌对番茄青枯雷尔氏菌致病性的影响

青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）从其致病性上可分为能使植株发病的强致病力菌株和不能使植株发病的弱致病力菌株．利用蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）与致病性稳定的青枯雷尔氏菌强致病力菌株进行共培养，处理后的青枯雷尔氏菌在TTC平板上表现为弱毒株的菌落特征，出现了致弱现象．经过16S rDNA基因序列测定，证明了用蜡状芽孢杆菌处理前后的菌株为青枯雷尔氏菌，并非是其它的污染菌株，通过回接番茄盆栽苗发现致弱前的青枯雷尔氏菌能有效引起番茄发生青枯病，而致弱后的菌株丧失致病力．不能引起番茄发病，     

网箱养殖患病草鱼细菌分离鉴定与回复感染研究

利用常用细菌分离纯化方法从患病草鱼中分离出7株菌株,分别编号为Ⅰ～Ⅶ;对7株菌株的16SrRNA基因序列进行PCR扩增,均得到长约600bp的片段;将扩增结果进行测序,测序结果输入到美国国立生物技术信息中心(NCBI,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/),用BLAST工具对序列进行同源性比对分析.结果表明:Ⅰ为沙雷氏菌,同源性达95%;II为腐生葡萄球菌,同源性达99%;III为荧光假单孢菌,同源性达97%;IV为产碱普罗威登斯菌,同源性达99%;V为嗜水气单孢菌,同源性达99%;VI为杀鲑气单孢菌,同源性达97%;VII为不动菌属,同源性达97%.将Ⅰ～Ⅶ号菌株回复感染健康草鱼,结果沙雷氏菌、腐生葡萄球菌、荧光假单孢菌、产碱普罗威登斯菌和嗜水气单孢菌对草鱼的危害较大,而杀鲑气单孢菌和不动菌属的感染症状不明显.