根癌农杆菌介导的向日葵遗传转化的研究

以向日葵无菌苗的子叶节为外植体,通过农杆菌介导法,对其遗传转化条件进行了研究,建立了向日葵子叶节农杆菌介导的遗传转化体系.结果表明:在农杆菌浸染前(浸染浓度为OD600=0.6)进行2 d的预培养、浸染8 min的外植体在MS+1.2 mg/L 6-BA+0.03 mg/L IAA的培养基上转化效率较高.PCR检测初步证明,LycB基因已整合到向日葵再生植株中.     

大豆子叶节组培再生系统与农杆菌介导的基因转化系统的比较研究

不同基因型的大豆子叶节在添加适宜BA的MS培养基上培养，可从子叶节诱导出高频丛生芽，并获得大量再生植株．通过农杆菌介导法，将深黄被孢霉△＾6—脂肪酸脱氢酶基因导入到栽培大豆吉林43和黑农37品种中．经过在含500mg/L卡那霉素的筛选培养基中连续筛选，获得一批转基因植株．经PCR检测和DNA分子杂交分析，初步证明外源基因已导入并整合到大豆基因组中．本重点阐述了组培再生系统和基因转化系统的内在联系和不同点．     

西瓜NPR1抗病基因的遗传转化

比较了不同预培养时间、侵染时间、共培养时间等因素对农杆菌转化西瓜的影响。西瓜遗传转化的适宜条件:3 d苗龄的子叶,预培养1 d,农杆菌侵染10~15 m in,共培养3 d;不定芽与根的潮霉素(Hyg)筛选浓度分别为20 m g.L-1和6 m g.L-1。对20株西瓜转化苗进行DNA提取,PCR检测,其中5株呈阳性,初步证明目的基因已经整合到西瓜基因组中。     

GmGASA6基因CRISPR-Cas9载体构建及大豆的遗传转化

通过对大豆GmGASA6基因的结构分析,选择了两个靶位点构建了GmGASA6 CRISPR-Cas9的基因编辑载体.利用农杆菌介导的大豆子叶节转化法进行了遗传转化,共转化外植体800个,获得了转基因阳性苗15株.通过测序证实部分T_1代植株GmGASA6基因的靶位点发生了基因编辑.与野生型相比,种子萌发实验发现突变体的胚根伸长受到显著抑制,说明在种子的萌发过程中GmGASA6基因促进种子萌发和胚根的伸长.     

麻疯树毒蛋白(curcin)基因转化水稻的研究

以粳稻(Japonica)品种日本晴与中花11号为材料,对影响农杆菌介导水稻转化体系的几个因素进行了研究,建立了农杆菌介导的有效水稻转化体系.在该体系中,首次使用浓度为10-4g/mL嘌呤合成抑制剂acivicin在转化前对水稻愈伤组织进行预处理,结果表明此法可有效提高GUS基因的瞬时表达率.同时,利用插入了麻疯树毒蛋白(curcin)基因的植物表达质粒pBI121-curcin,通过农杆菌介导转化水稻,获得了多株转基因植株.通过PCR鉴定,证实curcin基因已整合到水稻基因组中.     

头孢在蓖麻子叶节部位对农杆菌除菌效果的摸索

高效的遗传转化体系对植物的转基因有重要意义,除菌是遗传转化工作中的重要环节.头孢除菌剂在蓖麻子叶节部位能完全去除农杆菌,并保证外植体子叶节的生长状况不受损伤.本研究按不同头孢浓度、不同处理时间设置梯度摸索最佳除菌条件.结果表明:选择头孢浓度在4000mg/L、处理时间为10min时处理子叶节,用灭菌的1/8MS液体培养基涮洗3次,并用无菌滤纸吸干表面后再接种到新培养基内,用这种办法除菌效果较好,并且可以保证外植体的长势不受太大影响.该浓度和处理时间对保证农杆菌最小程度的污染率起到了关键作用.     

农杆菌介导大豆未成熟子叶节的遗传转化

以冀豆7号未成熟子叶节为转化受体,研究外植体取材时间、低温预处理、共培养温度及光照时间对农杆菌介导大豆转化抗性芽的影响。结果表明,以开花后60～66 d进行外植体取材的子叶节产生的抗性芽数量较多;共培养温度26℃,光照时间24 h/d有利于抗性芽产生,而外植体4℃低温预处理不利于抗性芽产生。分析不同品种抗性芽诱导率发现,不同基因型未成熟子叶节抗性芽发生率不同,其中以豫豆22,冀豆7号和品系12的抗性芽诱导率较高。     

Floral dip法在大豆遗传转化中的应用研究

首次运用floral dip法将植酸酶基因转化大豆品种冀豆12,获得遗传转化率1.18%～2.22%,证明该方法亦可用于大豆的遗传转化;研究了表面活性剂silwet L-77的浓度、转化液中农杆菌的浓度、不同农杆菌菌株对floral dip法大豆遗传转化的影响,结果表明采用EHA105菌株、菌浓度为OD_(600)=2.0、silwet L-77的浓度为0.05%条件下转化率最高。floral dip法在大豆遗传转化上的成功应用为扩展该方法的应用领域、简便有效地提高大豆的遗传转化效率奠定了一定基础。     

农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化研究

大豆遗传转化是目前研究的热点,为提高大豆遗传转化效率提供理论依据,试通过实验确立农杆菌介导大豆遗传转化条件.实验利用含有pCAMBIA3301质粒的农杆菌LBA4404对辽豆-45子叶节进行了侵染,对消毒方法、草铵膦浓度、侵染浓度、侵染时间、乙酰丁香酮浓度、共培养时间等方面进行了优化.实验结果表明:氯气灭菌5h的二次消毒法,可在不影响种子活力的同时把污染率降低为0,确定草铵膦的选择压力为6mg/L.同时确定辽豆-45子叶节遗传转化的最佳条件为:农杆菌侵染菌液的浓度为OD600=0.6,侵染时间为30 min,暗培养条件下共培养时间为96h,且共培养液体培养基添加200μmol/L的乙酰丁香酮有利于转化.经草铵膦抗性筛选、GUS组织化学染色检测、PCR检测,证实pCAMBIA3301质粒的T-DNA已经整合进了辽豆-45基因组,共获得23株转基因大豆.     

水稻转座子Pong RNAi载体的构建和农杆菌介导的遗传转化

为探讨水稻转座子Pong的功能及其对水稻基因组甲基化的影响,构建了水稻转座子Pong的RNAi表达载体TPAI和TPAⅡ,并利用这两个载体采用农杆菌介导法转化水稻(品种松前)的成熟胚愈伤组织,获得PCR结果阳性的再生植株.同时通过不同的农杆菌侵染途径、侵染浓度和侵染时间等,建立并优化了水稻的遗传转化程序.结果表明:农杆...     

大豆外源基因转化体系建立及条件优化研究

建立了适用于多个大豆品种的萌动胚真空渗透辅助的外源基因转化方法,对影响农杆菌介导转化的有关参数进行了比较研究。确定的优化条件为:预培养3d,在菌种活化液的OD600值为0.6并加以200μmol.L-1乙酰丁香酮的农杆菌菌种活化液,侵染时间为6h,共培养3d。在优化条件下,将携带GUS基因的35S启动子驱动的表达载体pCAMBIA1304的根癌农杆菌菌株GV3101分别转入鲁豆11和潍6823中,获得510株鲁豆11再生植株和591株潍6823再生植株,其中,抗性再生植株分别为444株和462株。通过PCR和GUS检测,证明分别获得了13株和15株转基因植株,转化率分别为2.2%和2.5%。     

玻璃粉创伤棉花茎尖分生组织遗传转化的研究

评估玻璃粉创伤棉胚茎尖分生组织的转化效率及初步建立其遗传转化体系。高速涡旋的玻璃粉创伤棉胚茎尖分生组织,利用农杆菌介导法将报告基因gusA导入棉花,GUS组织化学染色后观察棉胚转化情况,探讨不同转化条件对转化的影响。结果表明：0。2g玻璃粉创伤棉胚,茎尖分生组织的较多细胞被转化,成活12株幼苗,较适宜。涡旋90S转化条件下获得2株GUS阳性苗,涡旋时间越长茎尖分生组织创伤程度越严重,能提高转化效率,但成苗量降低。此外．转化效率受菌液浓度及菌种的影响,OD600为0．8的农杆菌LBA4404菌液侵染棉胚,较多细胞能表达gusA的活性且表达水平较高,而被农杆菌GV3101侵染后的棉胚染色效果较差。     

Introduction of pokeweed antiviral protein cDNA into Brassica napus and acquisition of transsenic plants resistant to viruses

Using cotyledonary petioles as explants, the PAP cDNA controlled by wound-in- ducible promoter has been introduced into Brassica napus by coculture with Agrobacterium tumefaciens and laser microbeam puncture respectively. Regenerated plants resistant to gen-tamycin have been selected out. PCR amplification and Southern blotting analysis indicated that PAP cDNA together with wound-inducible promoter had been integrated into Brassica genome with transformation frequencies of 2.0% and 1.7% for two transformation methods respectively. The test of virus challenge showed that these transgenic Brassica plants were resistant in different degrees to mechanically inoculated TuMV.     

农杆菌介导的大豆反义fad2-1基因转化烟草研究

以烟草无菌苗叶片为外植体,通过根癌农杆菌介导法,将大豆反义油酸脱饱和酶基因导入烟草中,经梯度卡那霉素筛选,获得可在含75mg/L卡那霉素选择生根培养基上再生的抗性植株75株,其中67株抗卡那霉素植株的PCR分析扩增出目的片段;RT-PCR分析表明该基因在烟草中表达.结果表明大豆反义油酸脱饱和酶基因在烟草基因组中整合和表达.这为大豆反义油酸脱饱和酶基因转入大豆和表达奠定基础,也为烟草基因工程育种提供了依据.     

盐藻GPDH基因的载体构建及在烟草中的表达

作者用冻融法，将构建有盐藻3-磷酸甘油脱氢酶基因的植物高效表达载体DsGPDH导入感受态的根癌农杆茵EHA105中．叶盘法转化烟草，在含卡那霉素的MS培养基上进行选择性培养，生根率达到80％．用POR的方法对再生苗进行了初步筛选，阳性率约为50％．对PCR阳性苗，进行RT-PCR分析，证实整合到烟草基因组中的GPDH基因表达产生了mRNA．     

Mutant acetolactate synthase （ALS） gene as a selectable marker for Agrobacterium-mediated transformation of soybean

Soybean is one of the crops most difficult to be manipulated in vitro. Although several soybean marker genes, all the selectable markers used were from bacteria origin. To find suitable selectable marker gene from plant origin for soybean transformation, a mutant acetolactate synthase （ALS） gene from Arabidopsis thaliana was tested for Agrobacterium-mediated soybean embryo axis transformation with the herbicide Arsenal as the selective agent. Transgenic soybean plants were obtained after the herbicide se- lection and the To transgenic lines showed resistance to the herbicide at a concentration of 100 g/ha. ALS enzyme assay of To transgenic line also showed higher activity compared to the wild type control plant. PCR analysis of the T1 transgenic lines confirmed the integration and segregation of the transgene. Taken together, our results showed that the mutant ALS gene is a suitable selectable marker for soybean transformation.     

农杆菌介导的DREB1A基因转化多花黑麦草及其转化体系的优化

采用携带卡那霉素抗性基因nptII和GUS基因的ubiquitin启动子驱动的表达载体pBI121／DREB1A的根癌农杆菌AGL1, 对多花黑麦草幼胚来源的胚性愈伤组织进行了遗传转化,并优化了各种影响因素。胚性愈伤组织经根癌农杆菌感染和共培养后,用50mg／L巴龙霉素筛选抗性愈伤组织,待抗性愈伤组织在IB分化培养基上分化成苗后用25mg／L卡那霉素进一步筛选再生植株, 获得了部分抗性植株。抗性植株的总DNA用DREB1A基因的特异引物进行PCR检测,转化频率为2.14％,PCR-Southern blot进一步验证了转化植株基因组中含有该外源基因。各种影响转化效率因素的优化实验表明,当转化时菌液浓度的OD600为2.0、侵染时间为1h、共培养时间为2d、共培养温度为21℃及在共培养期间使用乙酰丁香酮等,均可明显提高转化频率。     

胰蛋白酶抑制剂抗虫基因转化烟草的研究

实验用携带质粒pAM194/TI的根癌农杆菌LBA4404转化烟草,通过筛选,共获得35株卡那霉素抗性苗.GUS组织染色、PCR检测及抗虫试验表明胰蛋白酶抑制剂抗虫基因已经成功地整合进再生植株染色体基因组中,有些已正确表达.     

根癌农杆菌介导苜蓿体胚转化及转基因植株再生

用含质粒载体pCAMBIA2301(带有受CaMV35S启动子调控的GUS基因和nptⅡ基因)的根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens转化晋南苜蓿Medicago sativa L.cv.Jinnan的体胚组织,发现负压处理有利于提高转化频率(可达35%),3批共158个体胚切块的转化实验共获得具有卡那霉素抗性的再生植株15株,经组织化学染色和分子检测,证实GUS基因已整合到转化植株基因组中,在芽、叶片、叶柄和根等组织中均有表达,并在土壤栽培过程中保持稳定的表达.     

两种遗传标记筛选物在马铃薯Desiree遗传转化应用中的研究

以马铃薯茎段为外植体,采用农杆菌介导法,将带有Bar和hpt基因的植物表达质粒载体转入马铃薯栽培品种Desiree,并对遗传转化过程中的预培养时间、抑菌素浓度、筛选物抗除草剂Basta和潮霉素的浓度等因素进行了研究.结果表明:预培养时间2 d转化效率最高;头孢霉素浓度为300 mg/L时,能够有效的抑制农杆菌的生长;以除草剂Basta为筛选物时,适宜的筛选压为0.6 mg/L,用潮霉素(Hyg)作为筛选物时,以15 mg/L为最合适;获得的转基因植株经PCR分析,证实Bar基因己经整合到马铃薯基因组DNA中,从而建立了以除草剂Basta或以潮霉素为遗传标记筛选物的马铃薯栽培品种Desiree的遗传转化体系,为利用基因工程进一步改良马铃薯品质奠定了基础.