幽门螺杆菌VacA通过SIRT1/FOXO1信号轴促进胃癌细胞的自噬

纯化幽门螺杆菌空泡毒素A(VacA)蛋白后与人体胃癌细胞(SGC7901)共培养,蛋白质印迹法检测SGC7901细胞中沉默调节蛋白1(SIRT1)、叉头框蛋白O(FOXO)1及自噬相关蛋白(P62)的表达情况,并通过RNA干扰(siRNA)技术沉默SIRT1的表达,研究SIRT1/FOXO1信号轴与自噬的相互关系.研究结果显示,VacA蛋白处理胃癌细胞后,SIRT1及FOXO1蛋白表达水平升高,P62蛋白表达水平降低,SGC7901细胞自噬增强.通过干扰SIRT1表达,能够降低FOXO1蛋白表达,增强P62的表达,VacA蛋白诱导的SGC7901细胞自噬受到抑制.提示幽门螺杆菌VacA能够通过调节SIRT1/FOXO1信号轴促进胃癌细胞的自噬.     

PP2A B56α调节亚基原核表达载体的构建及表达

为了构建PP2A B56α调节亚基原核表达载体,以p CEP-4HA-B56α质粒为模板,设计引物克隆人源PP2A B56αc DNA,连入p GEX-4T-1载体中,测序正确后,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,并将诱导表达重组蛋白的菌体超声破碎后,进行可溶性分析,对可溶性蛋白进行纯化.SDS-PAGE电泳及Western Blot分析鉴定重组蛋白.结果表明,经测序和酶切鉴定后成功构建重组质粒p GEX-4T-1-B56α,表达大小约79 k D的重组蛋白,可溶性表达的重组蛋白为菌体总蛋白质量的8.6%,经GST纯化系统纯化得到纯度约为78.9%的重组蛋白,回收率达到52.2%.因此,本研究成功构建了PP2A B56α原核表达体系,获得重组蛋白,为研究PP2A B56α的生物学功能奠定了基础.     

D型产气荚膜梭菌ε毒素重组蛋白的表达与纯化

复苏实验室保存的产气荚膜梭菌ε-pET28a(DE3)菌株,经限制性内切酶EcoRⅠ,XhoⅠ双酶切鉴定后,诱导表达得到大量可溶性的ε重组毒素蛋白.对重组蛋白进行镍柱纯化,得到纯度高于95%的毒素蛋白,利用Western Blot和ELISA分析检测纯化后的毒素蛋白,显示该蛋白具有良好的特异性和免疫原性,为进一步研究单链抗体做铺垫.     

粉尘螨过敏原脂肪酶的表达、纯化及生物信息学分析

为克隆原核表达并纯化出粉尘螨过敏原脂肪酶蛋白,鉴定其免疫学活性,并分析其分子特征.通过重组合成粉尘螨新过敏原脂肪酶基因,与p ET-28a载体连接后转化大肠埃希菌E.coli Top10,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组新过敏原脂肪酶蛋白;经镍柱亲和层析纯化出粉尘螨重组脂肪酶蛋白,用Western Blot、ELISA方法检测其免疫原性.用生物信息学软件预测其理化性质、二级结构,并构建分子进化树.成功表达纯化出高纯度的粉尘螨重组脂肪酶蛋白,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果显示表达重组产物分子质量约为40 k Da,与理论值一致,纯化后的表达产物经Western blot印迹检测有明显条带显示.信息学分析显示蛋白二级结构由α螺旋(16.38%)、延伸主链(18.93%)、无规则卷曲(64.69%)组成.成功原核表达出粉尘螨过敏原脂肪酶蛋白,并纯化获得较高纯度及较强免疫学活性的重组脂肪酶蛋白,为尘螨过敏性疾病的特异性诊断和免疫治疗奠定理论基础.     

铜绿假单胞菌的LexA蛋白在大肠杆菌中的高效表达与纯化

目的:对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)的阻遏蛋白LexA进行基因克隆、重组表达及蛋白纯化.方法:采用PCR法从PAO1株基因组中扩增出1 086 bp的LexA基因,将此基因片段插入到表达载体pET32a( )上,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达.包涵体洗涤后用8 mol/L尿素溶解,以镍离子亲合柱层析作为第1步纯化,Superdex75凝胶过滤层析作为第2步精细纯化,反相高相液相色谱法(HPLC)测定蛋白的浓度.结果:LexA以包涵体形式表达,表达量为45%,经镍离子亲合柱层析纯化后LexA蛋白纯度达到85%以上,回收率大于80%,镍离子亲合柱层析和凝胶过滤层析两步纯化目的蛋白,经HPLC测定,最终目的蛋白的纯度为98.97%.结论:在pET32a( )表达系统中实现了PA的LexA蛋白的高效表达,两步纯化法获得高纯度的目的蛋白,为进一步鉴定LexA靶位点奠定了基础.     

马铃薯钾离子通道蛋白SKT1的原核表达与纯化

克隆马铃薯(Solanum tuberosum L.)钾离子通道蛋白SKT1基因片段后原核表达并纯化SKT1蛋白,为进一步研究SKT1的晶体结构与功能,以及与其它钾离子通道蛋白的相互作用奠定基础.以马铃薯试管苗总RNA反转录出的cDNA为模板,PCR扩增SKT1蛋白的胞内区,基因片段为1758bp,构建原核表达载体pET30-SKT1,转化大肠杆菌BL21表达株菌,IPTG诱导表达.经SDS-PAGE检测发现SKT1蛋白主要是以包涵体的形式存在.利用6M盐酸胍对SKT1包涵体进行溶解,利用Ni柱亲和纯化,最后在复性缓冲液中复性.获得了SKT1蛋白,复性得率大于40%,纯度达到95%以上,Western Blotting鉴定正确.     

禽网状内皮组织增生病毒gp90全长蛋白的原核表达、表达形式鉴定与纯化

该研究将禽网状内皮组织增生病毒gp90基因克隆至原核表达载体pET-30a(+),转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导,并通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定蛋白表达情况和蛋白表达.结果发现,将gp90基因连接表达载体转化宿主菌后,成功在大肠杆菌以包涵体形式表达.纯化的蛋白纯度超过90%.     

海南斑等蝎钾通道阻断剂Im58的克隆、表达、纯化和鉴定

为表达钾离子通道阻断剂Im58,设计了4条搭桥PCR引物,通过overlap PCR的方法扩增出蝎毒肽Im58DNA全长片段,选用表达载体pGEX-4T-1,将测序正确的克隆转化至大肠杆菌E.coli/Rosetta(DE3)中.通过检测不同诱导时间和IPTG浓度下融合蛋白的表达量,筛选出最优表达条件.表达蛋白经IPTG诱导后,融合蛋白再经GSH亲和层析柱纯化,将洗脱液经超滤浓缩脱盐、纯化后得GST-Im58融合蛋白,蛋白用小肠激酶酶切后通过RP-HPLC C18柱分离获得色谱纯的蝎毒肽.蝎毒肽通过Tricine系统的SDS-PAGE蛋白质电泳鉴定重组多肽的分子量大小和纯度,并由MALDI-TOF-MS来精确测定重组多肽的分子量.结果表明:Im58阳性克隆子证明成功构建了Im58原核表达载体,Tricine系统的SDS-PAGE蛋白质电泳和MALDI-TOF-MS鉴定Im58多肽表达纯化成功.     

耐热、高产重组人Cu,Zn-SOD改构体的构建及纯化方法的研究

目的通过对天然人Cu,Zn-SOD基因的改造,得到热稳定性、活性产量提高的重组人Cu,Zn-SOD(rhCu,Zn-SOD)改构体,并进行蛋白纯化方法的研究。方法重叠PCR技术将天然hCu,Zn-SOD的Cys6突变为A la6,Cys111突变为Ser111,构建重组质粒pET22b-rmhCu,Zn-SOD6A la,111Ser,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导后SDS-PAGE分析改构体蛋白的表达,并进行W estern blot鉴定;研究改构体蛋白的纯化方法,HPLC检测蛋白纯度,比较rhCu,Zn-SOD及其改构体的活性和热稳定性。结果成功构建了rmhCu,Zn-SOD6A la,111Ser表达载体;SDS-PAGE显示rmhCu,Zn-SOD6A la,111Ser蛋白在BL21(DE3)宿主菌中得到了有效表达,表达量占菌体蛋白总量的64.6%;Western blot结果显示表达产物可以特异性地与小鼠抗人SOD多克隆抗体结合;纯化得到纯度大于95%的rmhCu,Zn-SOD6A la,111Se改构体蛋白,从1g湿菌体中获得的活性蛋白总量高于未改构体的2倍;改构体的热稳定性较未改构体获得大幅提高。结论构建的rmhCu,Zn-SOD6A la,111Ser改构体具有较好的热稳定性和较高的活性产量,摸索出一种比较简易的蛋白纯化工艺,为Cu,Zn-SOD的广泛应用奠定基础。     

人呼吸道合胞病毒FHRA-HRB片段的表达纯化与鉴定

目的:克隆呼吸道合胞病毒融合F蛋白(RSV-F)中FHRA-HRB基因片段,构建体外的原核表达载体,对FHRA-HRB蛋白进行表达纯化,为进一步研究FHRA-HRB蛋白构效关系及抗RSV活性提供实验依据.方法:用Trizol法从RSV感染的Hep-2细胞中提取病毒RNA,逆转录得c DNA,使用Primer 6.0软件设计特异性引物,聚合酶链反应(PCR)扩增得到FHRA-HRB片段,测序成功后,将FHRA-HRB插入p ET-15b脱磷载体中,转化入Rosettagami表达宿主,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导FHRA-HRB的体外表达,Ni-NTA亲和层析法纯化蛋白.用Western-blot法鉴定FHRA-HRB蛋白表达.结果:成功扩增了大小约1100 bp的FHRA-HRB片段,克隆进p ET-15b载体后,菌液PCR验证与测序分析结果表明FHRA-HRB片段序列与预期一致且读码框插入正确,表达载体构建成功.工程菌经IPTG诱导后成功表达大小约43 000的FHRA-HRB蛋白,经Ni-NTA agarose纯化后FHRA-HRB蛋白纯度达95%以上.纯化后的FHRA-HRB蛋白经Western-blot鉴定其大小正确.结论:成功构建p ET-15b-FHRA-HRB表达载体,经表达纯化后,得到了纯度较高的FHRA-HRB蛋白,纯化蛋白经Western-blot鉴定正确.本研究为进一步研究其抗RSV活性和开发以F蛋白为靶点的抗RSV药物提供实验依据.     

重组大鼠细胞球蛋白的制备、纯化与活性

通过聚合酶链式反应(PCR)克隆鼠源细胞球蛋白(Cytoglobin,CYGB)基因,构建原核表达载体pET22b-Cygb,转入E.coliBL21(DE3)经乳糖诱导表达CYGB,发现CYGB主要以可溶形式存在,其表达量占可溶性总蛋白的35%以上.通过DEAE阴离子交换柱层析和Sephacryl S-100凝胶过滤层析,CYGB纯度可超过95%.重组表达的可溶性CYGB不但具有过氧化物酶活性,其活性为(3.23±0.12)mkat.(g.min)-1,还能保护胎鼠原代皮肤成纤维细胞减轻氧化应激损伤(H2O2模型).     

细胞毒性T细胞抗原4胞外结构域的高效表达与纯化

目的:获得细胞毒性T淋巴细胞相关分子4胞外结构域(exCTLA4)在大肠杆菌中高效表达的条件,并纯化获得高纯度的重组蛋白.方法:构建原核表达质粒pET28a-exCTLA4并转入大肠杆菌Transetta(DE3)中,通过改变诱导物IPTG浓度、细菌培养温度和时间,获得了exCTLA4的最佳表达条件.收集最佳诱导条件下表达exCTLA4的菌体,将菌体超声破碎后,离心分离exCTLA4包涵体,用低浓度尿素(2mol·L~(-1))洗去大部分背景蛋白后,再用高浓度尿素(8mol·L~(-1))溶解包涵体,进一步用镍离子亲和层析方法得到高纯度exCTLA4.结果:构建了表达载体pET28a-exCTLA4,获得了exCTLA4在Transetta(DE3)中的最佳诱导条件,即在1mmol·L~(-1) IPTG、25℃下,诱导6h能得到最佳表达,但重组蛋白以包涵体形式存在.通过纯化exCTLA4包涵体及进一步的镍离子亲和层析获得了高纯度的目的蛋白,Western blot鉴定为CTLA4.结论:获得了exCTLA4重组蛋白在大肠杆菌中的最佳表达条件和纯化方法及步骤,为该蛋白的应用奠定了基础.     

可溶性人干细胞因子的原核表达和纯化

用Trizol提取人骨髓总RNA,通过RT-PCR扩增人干细胞因子DNA,克隆到pMD18-T载体中并测序．将其定向连入原核表达载体pET32a( ),获得了重组表达载体pET32a( )／hSCF,其cDNA长度为504bp,测序结果与已知序列吻合．然后在大肠杆菌BL21中经IPTG诱导表达,获得37kD的融合蛋白,约占菌体总蛋白量的30％．经Ni^2 -NTA树脂亲和层析柱纯化获得纯度大约90％的重组蛋白．     

人和小鼠白细胞介素-5重组蛋白疫苗的提取

利用PCR技术从含有人和小鼠IL-5基因的质粒pORF9-hIL-5和pORF9-mIL-5质粒中扩增出人和小鼠IL-5基因序列,然后利用基因工程技术将人和小鼠IL-5基因序列分别插入原核表达质粒pQE30,获得人和小鼠IL-5重组表达质粒pQE-hIL-5和pQE-mIL-5.用酶切和DNA序列测定方法证实pQE-hIL-5和pQE-mIL-5正确后,转化感受态大肠杆菌JM109.用IPTG诱导表达重组蛋白,表达产物经Ni-NTA亲合层析进行分离纯化,最后用SDS-PAGE和免疫印迹法进行鉴定.结果表明:琼脂糖凝胶电泳发现PCR扩增的人和小鼠IL-5基因序列相对分子质量大小和预期值一致,酶切pQE-hIL-5和pQE-mIL-5片段和预期值相符,DNA序列测定插入的人和小鼠IL-5 PCR产物基因序列和阅读框架正确无误.重组蛋白质在大肠杆菌中获得稳定表达,表达的重组蛋白相对分子质量与预期值相一致,纯化的蛋白浓度达93%以上,抗组氨酸抗体可特异性识别hIL-5和mIL-5重组蛋白.     

人P53的原核表达及包涵体复性研究

通过检测血清中p53蛋白及其抗体变化诊断肿瘤的ELISA试剂盒的研发需要大量制备p53蛋白.本研究通过构建人野生型p53基因的原核表达质粒pET-32a-p53,在大肠杆菌中诱导表达得到p53包涵体蛋白,经包涵体变性、亲和纯化、复性得到可溶p53蛋白.发现利用8M尿素对包涵体进行变性溶解,经镍柱亲和纯化得到纯度超过95%的变性蛋白.尝试透析复性、稀释复性和柱上复性3种方法分别对p53变性蛋白进行复性.结果表明透析复性的复性率最高,这为原核表达制备p53提供了一种参考.本研究为ELISA法检测血清中p53蛋白及其抗体诊断肿瘤相关试剂盒研发奠定了基础.     

小鼠睾丸特异表达新基因(mtLR1)在大肠杆菌中的表达

根据已经克隆的mtLR1基因序列,采用RT-PCR的方法获得mtLR1基因。将所得的PCR产物插入原核表达载体pMAL-P-2x中,得重组质粒(pMAL-P-2x/mtLR1)并转化大肠杆菌(E．coli)DH5α．经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析显示,重组蛋白得到了正确表达,表达的融合蛋白占菌体蛋白总量的52％,分子质量约为73 kDa。mtLR1蛋白的高效表达,为研究其生物学功能和制备单克隆抗体奠定了基础。     

传染性非典型肺炎病毒核蛋白的表达与活性检测

用PCR方法，人工合成传染性非典型肺炎病毒(SARS-CoV)核蛋白(N)全编码基因，并构建原核表达载体．在大肠杆菌中进行表达．结果重组N蛋白表达产量占菌体总蛋白的40％以上，主要以可溶形式存在．用SARS患者急性期血清进行蛋白印迹检测，表明可溶形式和包含体形式均有明显活性．包含体形式的重组蛋白经纯化后纯度可达90％以上，活性与纯化前相当，可作为SARS抗体诊断试剂盒的抗原原料．     

利用多克隆抗体检测纺锤体蛋白基因INMAP在肝癌细胞中的表达

 为探究纺锤体蛋白INMAP 的功能及其在细胞恶性增殖中发挥的作用,制备INMAP 多克隆抗体.利用0.1 mmol/L IPTG于16℃诱导His-INMAP 融合蛋白进行原核表达,SDS-PAGE 及免疫印迹检测蛋白表达.4.0 mol/L 尿素处理包涵体获得可溶性融合蛋白,镍亲和柱分离纯化融合蛋白抗原并检测蛋白浓度及纯度.以所获抗原免疫4 只Balb/c 小鼠,收集心脏抗血清.以纯化前、后的原核表达产物作为抗原,检测INMAP 多克隆抗体的特异性.通过免疫印迹分析INMAP 在正常肝细胞系L-02 及5个肝癌细胞系(PLC、HepG2、SUN449、SMMC-7721 和BEL-7402)中的表达差异.结果显示,His-INMAP 融合蛋白主要以包涵体形式存在,经4.0 mol/L 尿素处理可获得可溶性目的蛋白,且纯化后的抗原纯度较高(94.1%).INMAP 多克隆抗体能与INMAP 抗原特异结合.INMAP 在6 种肝细胞中具有多态性,除PLC 外,在其他肝癌细胞中其基因表达水平显著下调.本研究制备的INMAP 多克隆抗体特异性高,为INMAP 基因功能的进一步研究奠定了基础.     

人溶菌酶N端与Exendin-4嵌合蛋白的基因克隆及原核表达

目的:克隆嵌合多肽人溶菌酶N端-Exendin-4基因并进行原核表达和纯化.方法:通过重组PCR技术将人溶菌酶N端74个氨基酸的基因序列与Exendin-4多肽基因序列相连接,其间引入一段由凝血酶和二肽基肽酶识别位点组成的连接序列.以嵌合基因hLYZ(N74)-Ex4与质粒pET-32a(+)构建原核表达体,转化大肠杆菌BL21(DE3)并诱导表达.表达蛋白经Ni-NTA亲和层析纯化、Western blotting鉴定;透析复性后,以肠激酶切割并回收目的多肽.结果:重组质粒pET-32a/hLYZ(N74)-Ex4构建正确,目的蛋白主要以包涵体形式存在,37℃诱导4h、IPTG浓度为0.6 mmol/L时表达量最高,约占菌体蛋白总量的30%.Western blotting检测显示重组蛋白为单一清晰条带.重组蛋白经肠激酶切割后,回收得到高纯度的嵌合多肽.结论:成功构建hLYZ(N74)-Ex4嵌合基因的原核表达质粒,高效原核表达并获得高纯度目的蛋白.     

氧化还原因子-1的原核表达纯化及其活性鉴定

为建立氧化还原因子-1(Ref-1)的原核表达系统,将经过酶切后的人源Ref-1编码片段定向克隆到pGEX-4T-3载体上,构建了pGEX-4T-3/Ref-1原核表达载体,重组质粒转化至BL21(DE3)工程菌,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导重组工程菌表达可溶性融合蛋白,谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B(Glutathione Sepha-rose 4B)亲和纯化重组蛋白,透析后用聚乙二醇8000(PEG8000)浓缩,获得纯度达92%的融合蛋白,产率为3.7 mg/L,融合蛋白占菌体总蛋白的6.8%.蛋白质印迹(Western blot)显示该蛋白可以被抗体特异性识别,证实其为GST-Ref-1融合蛋白.GST-Ref-1蛋白体外增强了激活蛋白-1(AP-1)的DNA结合能力,并能拮抗H2O2造成的AP-1氧化损伤.