鸡传染性法氏囊病的RT-PCR诊断方法的研究

在研究鸡法氏囊病毒(IBDV)的A片断cDNA结构的基础上,建立了RT-PCR早期诊断技术.结果表明,使用PrimerDesign引物设计软件,在VP5和VP2的重叠基因区设计的一对引物具有非常高的同源性和保守性.采用的四种IBDV的标准毒株、一种野毒株和一例病鸡标本通过此引物进行RT-PCR检测均得到了明显的阳性扩增结果.而两种其他鸡病病毒和一例健康鸡的法氏囊组织扩增均为阴性结果.     

传染性法氏囊病快速诊断技术的建立及其应用

根据已发表的IBDV各致病型毒株的序列，在病毒结构蛋白VP2编码基因的高变区(VP2 variable domain,vVP2)两端外侧的保守序列内设计合成了2条寡核苷酸引物，对各种不同致病型的12株参考毒株进行逆转录酶一聚合酶链式反应(RT—PCR)的检测．结果 12个参考毒株均能扩增出约679 bp的目的片段，而对作为阴性对照的常见5种鸡病病原NDV、IBV、CAIV、E．coli、pM均没有扩增出任何片段；应用建立的技术对疑似IBD的34份临床病料进行检测，并同时在基础RT—PCR扩增的片段内设计另一对引物进行Nested—PCR检测．结果基础RT—PCR方法检测到ll份阳性，Nested-PCR检测到23份阳性．研究的结果表明建立的IBD的RT—PCR诊断技术具有特异、快捷、敏感的特点．在此基础上设计的Nested—PCR则大大提高了阳性检出率(提高52．1％)．     

亚洲一型口蹄疫病毒YNAs1.1株结构蛋白VP1基因的核苷酸序列分析

提取BHK21细胞增殖的亚洲一型口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus Serotype Asial)强毒株YNAs1.1的RNA,用一对引物P7,P13经反转录（RT）－PCR法扩增了约674bp的DNA片段。克隆目的基因后,采用双脱氧DNA链末端终止法测得了YNAs1.1的VP1基因36－633核苷酸序列。分析表明,病毒VP1基因的核苷酸序列与以色列以及印度已报道的Asia1型FMDV的同源性分别为82.11%与88.07%,对应的氨基酸序列同源性为87.94％与93.47％。该序列在GeneBank登陆号为AF241566。     

RT—PCR检测草鱼呼肠孤病毒的方法研究

草鱼呼肠孤病毒（Grass carp reovirus,GCRV）为草鱼出血病的病原．本实验根据GenBank中GCRV和其他水生呼肠孤病毒毒株的第六基因片段,在其保守区设计了一对GCRV特异性引物,建立了快速检测GCRV的逆转录聚合酶链式反应（RT—PCR）方法．该PCR体系中,上下游引物的最适终浓度为120nmol／L,最适退火温度为52℃．PCR特异性试验表明：所设计的引物只能扩增GCRV的核酸,而不能扩增嗜水气单胞菌BSK-10、WSSV以及正常CIK细胞的DNA或RNA．敏感性试验表明,当GCRV的反转录模板稀释至5-7时,PCR结果还为阳性．用所建立的RT—PCR方法对5份样品进行检测,结果表明本研究建立的RT—PCR检测方法可靠且可行．     

应用二温式多重PCR技术鉴别鸡传染性支气管炎病毒和鸡传染性喉气管炎病毒

为了简化聚链反应（PCR）程序和加快检测速度,将二温式PCR与多重PCR结合起来,建立一种同是检测鸡传染性支气管炎病毒（IBV）和鸡传染性喉气炎病毒（ILTV）的二温式重PCR技术,试验根据IBV和ILTV的基因文库,设计2对分别与IBV和ILTV某段基因序列互补的引物。用这2对引物同一样品中的IBV、ILTV核酸模板进行二温式多重PCR扩增,结果均同时得到2条特异性大小与实验设计相符的1720bp(IBV)和647bp(ILTV）的扩增带,而对其他6种禽病病原的扩增结果均为阴性,敏感性测定结果表明明,该二温式多重PCR技术检出10pg的IBV RNA模板和10pg的ILTV DNA模板。     

犬瘟热病毒RT-PCR检测方法的建立与应用

根据Barrett发表的犬瘟热病毒 (CDV)Onderstepoort弱毒株融合蛋白 (F)基因序列 ,设计合成了一对寡聚核苷酸引物 ,并以南京农业大学惠赠的Onderstepoort标准株反转录产物为模板 ,建立了CDV的RT PCR方法 ,并应用于CDV的诊断。结果表明 ,以该对引物 ,只能从CDV ONP标准株反转录产物中扩增出大小为 32 4bp的核苷酸片段 ,与理论设计值大小一致 ,而正常Vero细胞和同为副粘病毒科的新城疫病毒 (NDV)作为对照 ,病毒扩增结果为阴性。RT PCR可检出 1μl作 10 6倍稀释的CDV ONP标准株反转录产物 ,说明其具有很高的敏感性。应用试验结果 ,可从感染CDV犬的组织病料中提取RNA ,反转录产物中也扩增出 32 4bp的核苷酸片段。通过本研究不仅建立了敏感性、特异性好的CDV的RT PCR检测方法 ,也为F基因的克隆和序列测定及表达奠定了基础。     

实验动物雪貂阿留申病病毒核酸检测方法的建立

目的 建立阿留申病病毒PCR检测方法,以用于实验动物雪貂阿留申病病毒的检测。方法 参考Genebank中阿留申病病毒核酸VP2基因序列设计一对引物,建立PCR检测方法,进行特异性、敏感性测试,并对实验雪貂粪便样品进行筛查。结果 测序结果显示,使用设计的引物可特异性地扩增获得阿留申病病毒的VP2中531 bp基因片段;在常见实验动物DNA病毒,小鼠多瘤病毒、小鼠细小病毒、犬细小病毒、疱疹病毒、鼠痘病毒、仙台病毒、小鼠腺病毒中均未扩增出目的条带;以目的片段核酸为模板测试该方法敏感性,检测下限达到90. 6 copy/μL。应用该方法对39份雪貂粪便样品进行检测,未检测出阿留申病病毒核酸阳性。结论 本研究建立的方法具备一定的特异性和敏感性,可作为实验动物雪貂中阿留申病病毒感染病原筛查的方法。     

鸡传染性法氏囊病毒LS株的分离与鉴定

用SPF鸡胚,从江苏溧水某鸡场病死鸡的法氏囊组织中分离到一株病毒,接种健康非免疫鸡,能致鸡3～5 d内全部发病,死亡率达55%以上,腿肌和腺胃出血,肝和肾肿大出血,脾脏出血,法氏囊肿大出血;该病毒不能凝集鸡红细胞,可以与IBDV阳性血清产生沉淀;应用RT-PCR进行检测,扩增IBDV VP2基因,并与GenBank中的已知序列进行比较.结果表明,所分离的病毒为IBDV毒株.     

鸡六种病毒多重PCR检测方法的建立和应用

禽流感(Avian influenza,AI)、鸡新城疫(Newcastle disease,ND)、鸡传染性支气管炎(Infectious bronchitis,IB)、鸡传染性喉气管炎(Infectious laryngotracheitis,ILT)、鸡传染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)和鸡减蛋综合症(Egg drop syndrome 76,EDS-76)是6种常见的禽类病毒性传染病,给养鸡业造成重大经济损失。依据NCBI核酸数据库中禽流感病毒(Aiv)、新城疫病毒(Ndv)、鸡传染性支气管炎病毒(Ibv)、传染性法氏囊病(Ibdv)、鸡传染性喉气管炎病毒(Iltv)及减蛋综合征病毒(Edsv)基因序列,设计了6对特异性引物,建立并优化针对鸡Aiv、Ndv、Ibv、Ibdv、Iltv和Edsv的多重PCR鉴别诊断方法,同时进行现场检测应用。结果显示该多重PCR体系检测限为100fg,与其他常见病原体无交叉反应。研究表明鸡六种病毒多重PCR方法具有较高敏感性与特异性,在禽类常见病毒现场诊断方面具有广阔的应用前景。     

鹅细小病毒C日v强毒株VP3基因克隆及遗传进化

根据Genbank中的鹅细小病毒(GPV)B株全基因序列,设计合成一对引物,应用PCR技术扩增了GPV强毒株CHv的VP3基因片段,将扩增后的VP3基因重组到pMD18-T质粒载体上,并对擂人片段进行序列测定,将测序结果及由该结果推导的氨基酸序列与国内外分离的GPV,M DPV,PPV和CPV等不同宿主的细小病毒的VP3进行比对分析.结果表明:中国四川分离的GPV CHv株VP3基因长1 605 bp,编码 534个氨基酸,与国内外10株GPV的VP3基因进行比较,核苷酸同源性为93.4%-99.8%,氨基酸同源性为96.5%99.3%,其变异较小,是GPV保持一个血清型的分子基础.与番鸭细小病毒的核苷酸和氨基酸同源性分别为79.6%和89.9%,而与其他种属的细小病毒同源性均在30%以下,表明它们与GPV CHv株亲缘关系较远.     

鹅细小病毒CHv强毒株VP3基因克隆及遗传进化

根据Genbank中的鹅细小病毒(GPV)B株全基因序列,设计合成一对引物,应用PCR技术扩增了GPV强毒株CHv的VP3基因片段,将扩增后的VP3基因重组到pMD18-T质粒载体上,并对插入片段进行序列测定,将测序结果及由该结果推导的氨基酸序列与国内外分离的GPV、MDPV、PPV和CPV等不同宿主的细小病毒的VP3进行比对分析。结果表明:中国四川分离的GPV CHv株VP3基因长1 605 bp,编码534个氨基酸,与国内外10株GPV的VP3基因进行比较,核苷酸同源性为93.4%~99.8%,氨基酸同源性为96.5%~99.3%,其变异较小,是GPV保持一个血清型的分子基础。与番鸭细小病毒的核苷酸和氨基酸同源性分别为79.6%和89.9%,而与其他种属的细小病毒同源性均在30%以下,表明它们与GPV CHv株亲缘关系较远。     

传染性法氏囊病病毒VP2基因的扩增与序列分析

为了解凉山地区传染性法氏囊病病毒(IBDV)的分子特征,利用实验室采集保存的感染IBD的法氏囊提取出总RNA.采用RT-PCR方法对IBDV VP2基因进行扩增,测序后与GenBank中的参考序列进行比对分析.结果表明,试验成功扩增出1 369 bp的VP2基因片段;样品与弱毒株和经典毒株的核苷酸同源性高达98.4%～99.6%;系统发生树表明样品中的IBDV与弱毒株B87亲缘关系最近;样品与弱毒株的氨基酸序列同源性为98.9%～99.1%;样品中的IBDV分子特征完全符合弱毒类型的特征,样品与弱毒株的抗原性基本一致,推测样品中的IBDV应与弱毒株或疫苗毒株同一来源.该毒株与疫苗用毒株亲缘关系最近,且IBDV疫苗多为活疫苗,因此,试验结果说明凉山地区IBDV免疫接种率可能较高,但应该拟定更合理的免疫程序.     

传染性法氏囊病病毒结构的分子生物学研究进展

传染性法氏囊病是一种严重危害雏鸡的免疫抑制性、高度接触性传染病.传染性法氏囊病病毒为双RNA病毒,有A、B两个片断.A片断编码4种蛋白VP2,VP3,VP4和VP5,B片断编码VP1蛋白.其中的VP2和VP3是主要的宿主保护性抗原,在病毒的结构、变异、毒力和免疫原性方面有着重要的作用.     

猴空泡病毒(SV40)PCR检测方法的建立与初步应用

目的建立检测实验猴及生物制品中猴空泡病毒(SV40)的PCR方法。方法根据SV40-776株设计合成三对引物对现有毒株进行PCR扩增并克隆测序。用这三对引物对56份猴肾、肺、脾及10批脊髓灰质炎疫苗进行检测。结果三对引物均扩增出目的片段;56份猴脏器和10批疫苗SV40检测均为阴性。结论56只恒河猴和10批疫苗中未检测到SV40,所设计的三对引物检测结果准确,均可用于检测。     

鸡传染性法氏囊病高免卵黄抗体液的研制

为防治鸡传染性法氏囊病毒地方性毒株所致的疾病,进行了高免卵黄抗体的制备、安全检验、保存期试验、鸡体里消长试验、治疗试验,为应用高免卵黄抗体防治鸡传染性法氏囊病取得了可参考性资料。     

应用RT-PCR技术检测葡萄扇叶病毒的研究

以扇叶病株为材料，根据病毒外壳蛋白核苷酸序列，设计特异引物P1（1064－1083），P2（762－781），建立了以RNA为模板的GFLV的RT－PCR检测体系。     

检测克氏原螯虾白斑综合征病毒(WSSV)的巢式PCR方法的建立与初步应用

根据GenBank中已发表的3株WSSV的VP28基因序列,设计了4条特异性引物．通过筛选最佳反应条件和试剂工作浓度,建立了检测克氏原螯虾WSSV的巢式PCR方法．该方法第一轮扩增的敏感性是36ng,第二轮扩增的敏感性是36Pg．在对9份克氏原螯虾临床病料的巢式PCR检测中,用引物W1和W2做第一轮扩增,未检测到阳性病例;用引物S1和S2做第二轮扩增,检测到一例WSSV阳性病例．以上结果表明：对于检测克氏原螯虾WSSV,巢式PCR较一步PCR具有更高的检测灵敏度和应用前景．     

蓝舌病病毒内蒙古分离株VP2基因5′端序列分析及探针制备

从内蒙古巴盟地区分离的蓝舌病病毒株(BTV—NM)提取总RNA，经反转录PCR扩增VP2基因5′端片段，并构建至pGEM—T载体中。序列测定后，将这一序列与蓝舌病毒澳大利亚株VP2基因5′端进行比较分析：同源性为40％。通过PCR法标记克隆的cDNA片段，制备地高辛标记探针，与粗提的蓝舌病发病羊病毒RNA进行Northernblot杂交，并作敏感性试验，结果表明此探针对蓝舌病毒内蒙古分离株具有特异性，可检测出50pg的病毒RNA。     

轮状病毒VP7基因的克隆及核苷酸序列分析

用反转录聚合酶链反应（RT－PCR）技术，从轮状病毒感染的细胞中扩增了916bp的VP7片段中抗原表位区。通过T4DNA连接酶将其直接连接于克隆载体质粒pGEM-T上，转化至受体菌DH5a中。提取质粒经PCR扩增、酶切鉴定，证明重组质粒pT-V7中含有轮状病毒的VP7基因片段。经核苷酸序列分析，表明正确克服了轮状病毒主要保护性抗VP7基因中抗原表位区。     

中蜂囊状幼虫病病毒部分结构蛋白基因的克隆及序列分析

根据小ＲＮＡ 病毒科（ Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ） 中病毒ＲＮＡ 所具有的结构特征, 采用ｍＲＮＡｃａｐｔｕｒｅ ｋｉｔ 提取纯化中蜂囊状幼虫病病毒（Ｃｈｉｎｅｓｅｓｃａｂｒｏｏｄ ｖｉｒｕｓ ＣＳＢＶ） 的ＲＮＡ, 并以之为ｃＤＮＡ合成的模板． 依据小ＲＮＡ病毒科中的脊髓灰质炎病毒结构蛋白基因序列设计了一对引物ＶＰ５和ＶＰ３ , 通过ＰＣＲ 扩增获得预期大小约为１ １００ ｂｐ的ＤＮＡ 片段, 将此片段克隆到ｐＧＥＭＴｅａｓｙ载体上并直接测序． 序列分析表明, 该片段为中蜂囊状幼虫病病毒部分结构蛋白基因, 与意蜂幼虫囊状病病毒结构蛋白基因序列的同源性为８６－８ ％ , 与之对应氨基酸序列的同源性高达９３－４ ％ ． 该病毒株为一种新型的蜜蜂囊状幼虫病病毒株