农杆菌介导大豆未成熟子叶节的遗传转化

以冀豆7号未成熟子叶节为转化受体,研究外植体取材时间、低温预处理、共培养温度及光照时间对农杆菌介导大豆转化抗性芽的影响。结果表明,以开花后60～66 d进行外植体取材的子叶节产生的抗性芽数量较多;共培养温度26℃,光照时间24 h/d有利于抗性芽产生,而外植体4℃低温预处理不利于抗性芽产生。分析不同品种抗性芽诱导率发现,不同基因型未成熟子叶节抗性芽发生率不同,其中以豫豆22,冀豆7号和品系12的抗性芽诱导率较高。     

长链非编码RNA H19、Neat1、Meg3、Gas5在梅山与杜洛克猪卵泡及各组织中的差异表达分析

为探讨lnc RNA在卵泡及组织中的表达规律,采用荧光定量RT-PCR检测lncRNA H19、Neat1、Meg3、Gas5基因在杜洛克与梅山猪各级卵泡和猪不同组织中的表达量变化。结果表明:H19基因在杜洛克猪各级卵泡S、M1、M2、L中的表达量分别是梅山猪的3.61、0.57、4.19、3.27倍,各级卵泡品种间差异极显著(P0.01);Neat1基因在杜洛克猪各级卵泡中的表达量分别是梅山猪的3.94、1.16、1.63、1.44倍,其中S卵泡品种间差异极显著(P0.01);Meg3基因在杜洛克猪各级卵泡中的表达量分别是梅山猪的2.78、1.12、10.65、1.41倍,S、M2卵泡品种间差异极显著(P0.01);Gas5基因在杜洛克猪各级卵泡中的表达量分别是梅山猪的4.53、1.40、6.31、1.14倍,S、M2卵泡品种间差异极显著(P0.01),M1卵泡中差异显著(P0.05)。组织表达分析结果表明,各基因在下丘脑、垂体、子宫、卵巢等组织中均有表达。此研究表明,4个lnc RNA基因在杜洛克和梅山猪中表达量存在较大差异,可能影响卵泡的增殖、发育和成熟。     

水稻磷转运蛋白基因OsPht1;6启动子表达载体转化系统的建立

通过PCR从粳稻（Oryza sativa L.cv.ssp.Japonica）的总DNA中扩增出一个磷转运蛋白基因（Phosphates transporter1；6；OsPht1；6，accession no AF536966）的启动子序列.以此为基础与二元表达载体PS1aG-3构建含Pht1；6启动子的植物表达载体，并通过根癌农杆菌介导转化了水稻武运粳7号品种.同时，对其愈伤组织高效再生体系和影响报告基因GUS瞬时表达的各种因素也做了比较研究.结果表明：①诱导水稻武运粳7号品种愈伤形成，3 mg/L 2，4-D的生长素浓度最适宜；②GUS基因高瞬时表达频率的条件为：工程菌液的浓度OD600值为0.7-0.8，浸染时间30 min，共培养时间3 d.利用这些再生转化条件，以EHA105为菌株转化浸染愈伤组织，获得了较高频率的Pht1；6启动子驱动的GUS基因瞬时表达.这些方法都有效地提高了抗性愈伤组织的形成率，该实验获得了转基因植株，经PCR检测，证实已将目的基因整合到水稻的基因组中.     

Floral dip法在大豆遗传转化中的应用研究

首次运用floral dip法将植酸酶基因转化大豆品种冀豆12,获得遗传转化率1.18%～2.22%,证明该方法亦可用于大豆的遗传转化;研究了表面活性剂silwet L-77的浓度、转化液中农杆菌的浓度、不同农杆菌菌株对floral dip法大豆遗传转化的影响,结果表明采用EHA105菌株、菌浓度为OD_(600)=2.0、silwet L-77的浓度为0.05%条件下转化率最高。floral dip法在大豆遗传转化上的成功应用为扩展该方法的应用领域、简便有效地提高大豆的遗传转化效率奠定了一定基础。     

不同大豆品种对根际土壤微生物群落影响的差异

采用磷脂脂肪酸(phospholipid fatty acid, PLFA)分析法研究4个大豆品种(台湾75、中黄42、春丰早和六月半)对根际土壤微生物区系的影响。结果发现：尽管不同大豆品种在红壤(黄筋泥土)中的生物量和产量差别很大,但对根际土壤好氧菌、厌氧菌、革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、放线菌和原生动物的影响不大;六月半品种显著影响根际土壤真菌PLFA总量,改变了细菌/真菌的比值;与六月半相比,春丰早显著增加了根际微生物群落的多样性、群落的优势种群和均匀度;中黄42显著提高了根际微生物群落优势种群的丰富度;中黄42和台湾75对根际土壤微生物Shannon均匀度的影响也有显著差异;但是4种大豆品种对根际土壤微生物群落的McIntosh和Gini多样性指数没有显著影响。主成分分析结果表明,六月半和中黄42品种对根际微生物的影响差异明显,而春丰早和台湾75变化相近,差异不明显。     

饥饿再投喂对鳜肌FSRP-1、FSRP-3和肠道PepT1基因表达的影响

为探讨饥饿再投喂对鳜肌FSRP-1、FSRP-3和肠道中PepT1基因表达的影响,本研究采用qRT-PCR技术,测定饥饿7d再饱食一餐后0、1、3、6、12、24、48、96h条件下鳜肌中FSRP-1、FSRP-3和肠道中PepT1基因表达水平的变化,研究结果表明:FSRP-1基因表达在投喂后12h内显著升高(P0.05),12-48h维持在较高表达水平,48h后显著降低(P0.05);FSRP-3基因表达在投喂后1h内显著降低(P0.05),12h达到峰值且表达量是1h的5倍,48h后显著降低(P0.05);PepT1基因表达在投喂后6h内显著降低(P0.05),48h时表达量最高。FSRP-1、FSRP-3和PepT1是与鱼类生长相关的重要基因,受饥饿再投喂的影响较大。     

白桦BpGRAS1基因的克隆及耐盐功能分析

【目的】 GRAS转录因子是植物特有的转录因子家族之一,在植物响应盐、干旱等非生物胁迫中发挥重要的调控作用。从白桦(Betula platyphylla )中克隆GRAS转录因子基因,研究其耐盐功能,为研究木本植物GRAS转录因子的抗逆机制奠定理论基础。【方法】 在白桦转录组数据库中获得一个GRAS转录因子基因,命名为BpGRAS1 (GenBank 登录号: MN117546.1)。利用生物信息学进行多序列比对、构建进化树。分别构建植物过表达(pROKⅡ-BpGRAS1) 及抑制表达(pFGC5941-BpGRAS1) 载体。利用农杆菌介导高效瞬时遗传转化体系获得BpGRAS1基因瞬时过表达(OE)、抑制表达(IE) 及对照 (WT) 白桦植株。通过实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR) 技术分析盐胁迫下OE、IE及WT植株中BpGRAS1基因的表达情况,鉴定转基因植株中BpGRAS1的表达效率是否响应盐胁迫。在盐胁迫下比较了BpGRAS1基因瞬时过表达、抑制表达及对照白桦植株的电解质渗透率、失水率、丙二醛(MDA) 含量、过氧化物酶 (POD) 和超氧化物歧化酶 (SOD) 活性。【结果】 BpGRAS1基因的开放阅读框为1 425 bp,编码 474个氨基酸。BpGRAS1具有GRAS家族的序列特征,在C端的氨基酸序列相似度较高,与AtSHR亲缘关系较近。盐胁迫处理下,BpGRAS1的表达量升高,过表达植株中表达量高于对照,抑制表达植株中表达量低于对照,说明BpGRAS1受盐胁迫诱导,成功获得过表达及抑制表达植株。过表达BpGRAS1基因能降低白桦在盐胁迫下的电解质渗透率、失水率及 MDA 的积累,并显著增强了 POD 和 SOD 酶的活性,从而提高转基因植株的耐盐性。【结论】 BpGRAS1基因响应盐胁迫,过表达BpGRAS1基因降低了盐胁迫下植株细胞受损程度,通过增强POD 和 SOD 活性提高白桦的耐盐能力。     

生脉注射液治疗冠心病、心绞痛的临床表现

观察生脉注射液治疗冠心病、心绞痛的临床表现。疗法:生脉注射液40ml加入5%GS50ml静滴,每日一次,疗程为15d,结果:心绞痛症状显著缓解,总有效率达95%。缺血性心电图明显改善(p<0.01),心泵功能明显改善(p<0.05),血流变量改善(p<0.01)还有降低血脂作用(p<0.01),结论:生脉注射液对冠心病、心绞痛有显著疗效。     

4种基因表达量和光合参数差异对白桦无性系幼苗生长的影响

【目的】分析1年生白桦(Betula platyphylla)无性系幼苗RBCS1A、RBCS3B、GO、RCA基因表达量和光合速率、蒸腾速率、气孔导度、瞬时水分利用效率、胞间CO₂浓度、羧化效率与苗高、地径的相关性,探索基因表达量和光合参数对白桦无性系幼苗生长初期的影响。【方法】在白桦双列杂交子代林中选择6株成熟的树木进行组织培养,随后将其扩繁为6个无性系,对1年生白桦无性系幼苗的生长量与光合参数和4个与光合作用相关的基因表达量进行测定分析。【结果】6种不同基因型白桦无性系幼苗的生长量与光合参数及基因表达量间差异显著(P<0.05);光合参数间表现出了密切的相关性,其中净光合速率与瞬时水分利用效率、蒸腾速率、气孔导度、羧化效率显著正相关(P<0.05)。RBCS1A的表达量与RBCS3B显著正相关,RBCS1A的表达量与RCA显著正相关,GO基因的表达量与RCA显著负相关(P<0.05)。基因表达量与植物的蒸腾速率、净光合速率、瞬时水分利用效率及气孔导度间均表现出了显著相关性(P<0.05),但基因表达量和光合参数与白桦幼苗的苗高、地径相关性未达到显著水平(P>0.05)。【结论】1年生白桦不同无性系幼苗4种基因的表达量和6种光合参数间差异显著,并且表现出了密切的相关性,但与苗高、地径相关性不显著。说明在白桦幼苗生长的初期,4种基因的表达量和6种光合参数并不能够显著地影响白桦无性系幼苗的生长。     

Foxp3表达对黑色素瘤B16细胞增殖的影响

目的通过检测Foxp3在黑色素瘤B16细胞中的表达及其对肿瘤细胞增殖的影响,探讨Foxp3在黑色素瘤细胞中表达的可能作用.方法采用RT-PCR和免疫组化法检测B16细胞中Foxp3在mRNA和蛋白水平的表达;采用VigoFect转染试剂将pcDNA3.1-Foxp3真核表达载体瞬时转染B16细胞,RT-PCR和流式细胞术方法分别检测转染前后Foxp3基因和蛋白的表达;MTT方法检测Foxp3高表达后对肿瘤细胞增殖的影响.结果 B16细胞在mRNA和蛋白水平均表达Foxp3;瞬时转染后Foxp3转染组中Foxp3的表达显著高于空载体组和B16组(P0.01);Foxp3转染组细胞A490 nm值在48 h和72 h与空载体组和B16组相比显著降低,差异具有统计学意义(P0.05).结论黑色素瘤B16细胞Foxp3的表达可抑制肿瘤细胞的增殖.     

影响根癌农杆菌介导的香蕉基因转化早期的主要因素

用含质粒载体pCAMBIA2301的根癌农杆菌（Agrobacterium inoculation）转化“641”香蕉（Musa AAA Cavendish subgroup cv.64-1）的薄片外植体，通过测定GUS基因瞬时表达率，对转化早期的主要影响因素进行了研究。结果表明：农杆菌EHA105较适合于介导转化，将薄片置于固体高渗培养基上培养4h后，通过真空减压法使农杆菌接种于其上，获得了较高的瞬时表达率（41.67%），是对照（8.33%）的5倍，农杆菌悬液稀释5倍用于转化较好，共培养3d为宜，薄片外植体越靠近根部，瞬时表达率越高。而外植体预培养会降低瞬时表达率。     

山羊ZP3基因的cDNA克隆、序列分析及组织表达研究

对高繁金堂黑山羊和低繁藏山羊ZP3基因cDNA进行克隆、序列分析,并采用Real-time PCR技术对其在发情前期母羊卵巢组织的表达进行研究.结果表明:山羊ZP3基因编码区全长为1269bp,共编码422个氨基酸,两品种间有2处碱基差异,但未导致氨基酸的差异.山羊的ZP3基因在卵巢表达量高,与其他组织差异极显著(P＜0.01),但两个品种间差异不显著(P＞0.05).说明ZP3基因主要在卵巢中表达,但可能不是影响山羊多羔性状的主基因.     

水稻耐淹性的QTL定位与候选基因分析

为研究水稻苗期对淹水胁迫的耐受性,以籼稻品种台中本地1号(TN1)和粳稻品种春江06(CJ06)为亲本构建的DH群体为实验材料,将淹水条件下的成苗率作为考察指标,利用该群体前期构建的分子连锁图谱对淹水数据进行数量性状基因座(quantitative trait loci,QTL)检测分析.利用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)技术对淹水处理前后相关基因的表达量进行分析,并对表达量存在显著差异的基因进行测序分析.结果表明:挖掘到6个与淹水胁迫相关的QTL,分别位于水稻第1,2,6,8和9号染色体上;位于8号染色体QTL区间内的基因LOC_Os08g42750的表达在两亲本间存在显著差异,该基因在两亲本的编码区域存在4处差异.检测到的QTL位点对QTL精细定位和克隆耐淹相关基因具有重要参考价值,并为研究水稻耐淹分子机制及水稻直播育种提供了新的观点和见解.     

玉米MAR序列的分离及其在转基因烟草中的功能研究

从玉米基因组中分离了一段核基质结合区(MAR)序列,它位于乙醇脱氢酶1基因的5'端启动子区域.为研究此段MAR序列在转基因植物中的功能,将MAR构建在报告基因β-葡糖醛酸酶(GUS)基因(uidA)和植物选择标记新霉素磷酸转移酶II基因(nptII)的两侧形成植物表达载体,在载体中两段MAR之间的距离为6.2kb.GUS活性检测表明,MAR序列对报告基因的表达水平没有影响.这一现象与MAR只构建在报告基因两侧形成小环时提高外源基因表达的结果不同,为进一步研究MAR作用机制提供了基础.     

不同抗性棉花品种PR基因响应大丽轮枝菌的表达分析

由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)引起的棉花黄萎病每年给我国农业生产造成严重经济损失。为了明确不同抗性陆地棉(Gossypium hirsutum)品种中病程相关基因(GhPR基因)响应不同致病型大丽轮枝菌的表达差异,揭示GhPR基因在棉花与大丽轮枝菌互作过程中的免疫反应变化,本研究用寄主来源的棉花黄萎病菌落叶型菌株V592和非落叶型菌株I6以及非寄主来源的落叶型菌株S1和非落叶型菌株V31分别对2个感病棉花品种和1个抗病棉花品种的无菌根系进行诱导处理,检测GhPR基因的表达情况。结果显示,棉花黄萎病菌落叶型菌株V592和非落叶型菌株I6均能诱导3个棉花品种的GhPR基因普遍上调表达;在感病品种军棉1号上,2个菌株诱导GhPR基因达到最大相对表达量的基因个数相当;在感病品种新陆早1号上,I6菌株诱导GhPR基因达到最大相对表达量的基因个数比V592菌株多;表明在棉花感病品种上,非落叶型菌株诱导GhPR基因上调表达的能力与落叶型菌株的诱导能力相当,甚至更强。在抗病品种中植棉2号上,落叶型菌株V592诱导GhPR基因达到最大相对表达量的基因个数及上调表达量均显著高于I6菌株诱导的上调表达量,表明在棉花抗病品种上,落叶型菌株诱导GhPR基因上调表达的能力比非落叶型菌株的诱导能力强。对非寄主来源的2个大丽轮枝菌菌株,非落叶型菌株V31诱导感病棉花品种GhPR基因达到最大相对表达量的基因个数比落叶型菌株S1多,落叶型菌株S1诱导抗病棉花品种GhPR基因达到最大相对表达量的基因个数比非落叶型菌株V31多。结果表明,棉花感病品种的GhPR基因对落叶型和非落叶型大丽轮枝菌侵染均有一定的响应能力,棉花抗病品种的GhPR基因对落叶型菌系侵染具有更强的响应能力。     

鼠源VCAM-1真核表达载体构建及在同源细胞中过表达研究

构建鼠源VCAM-1基因的真核表达载体,并使其在C2C12细胞中过表达,为相关病毒受体研究奠定基础.采用RT-PCR方法扩增鼠源VCAM-1基因,构建重组载体pcDNA3.1-VCAM-1.通过脂质体法转染至C2C12细胞内;采用实时荧光定量PCR和Western-blot分别检测目的基因和蛋白的过表达情况.应用间接免疫荧光实验分析VCAM-1在细胞中的定位.构建的重组质粒pcDNA3.1-VCAM-1转染C2C12细胞后,实验组VCAM-1基因和蛋白表达均显著高于对照组细胞(P0.01),且主要表达定位于胞浆中.结果表明,实验成功地构建了鼠源VCAM-1真核表达载体,并在同源细胞中实现过表达.     

麻疯树毒蛋白(curcin)基因转化水稻的研究

以粳稻(Japonica)品种日本晴与中花11号为材料,对影响农杆菌介导水稻转化体系的几个因素进行了研究,建立了农杆菌介导的有效水稻转化体系.在该体系中,首次使用浓度为10-4g/mL嘌呤合成抑制剂acivicin在转化前对水稻愈伤组织进行预处理,结果表明此法可有效提高GUS基因的瞬时表达率.同时,利用插入了麻疯树毒蛋白(curcin)基因的植物表达质粒pBI121-curcin,通过农杆菌介导转化水稻,获得了多株转基因植株.通过PCR鉴定,证实curcin基因已整合到水稻基因组中.     

靶向survivin基因的shRNA慢病毒载体的构建及其对膀胱癌EJ细胞凋亡的影响

目的:构建survivin基因特异性shRNA慢病毒干扰载体,转染膀胱癌EJ细胞,研究survivin基因在膀胱癌细胞株中的表达抑制情况,观察survivin shRNA慢病毒载体对EJ细胞凋亡的影响.方法:以survivin基因为靶标设计shRNA干扰序列,克隆至p SIH1-H1-cop GFP慢病毒载体.干扰载体鉴定正确后转染膀胱癌细胞株EJ细胞,荧光显微镜下观察GFP表达情况,实时荧光定量PCR检测survivin基因mRNA含量变化,Western blotting法检测survivin蛋白表达,Annexin V-FITC/PI双染法检测EJ细胞凋亡情况.结果:PCR扩增鉴定、DNA测序证实survivin慢病毒干扰载体构建成功;EJ细胞经干扰载体处理后,EJ细胞survivin基因mRNA水平下调了73.33%,蛋白表达受到显著抑制,EJ细胞凋亡率达到24.39%.结论:成功构建了靶向survivin基因的shRNA重组慢病毒干扰载体,可以显著降低转染细胞survivin基因的表达水平,并有效提高膀胱癌细胞凋亡率.     

利用改良的CRISPR/Cas9系统构建猪PPARD 载体及效率检测

为了构建猪PPARD基因编辑载体并进行基因编辑效率检测，本研究利用改良的双位点编辑CRISPR/Cas9载体系统，根据PPARD基因结构和序列特点，设计2个能靶向切割PPARD基因的sgRNA序列，将2个PPARD sgRNA表达盒以串联的形式连接到一个CRISPR/Cas9载体中。将构建的质粒转染PK15细胞，提取各组细胞DNA,PCR扩增突变区域后，通过序列测定在DNA水平检测载体编辑效率。分别提取各组细胞总RNA及细胞总蛋白，利用qRT-PCR及Western blot在基因表达及蛋白表达水平上检测重组载体的基因编辑效率。结果发现，PPARD-2KO组DNA总突变率为45.83%(22/48);与正常对照组相比，PPARD基因编辑组中PPARD mRNA显著下降84%(P<0.01),PPARD蛋白表达量显著下降61%(P<0.01)。本研究利用改良的CRISPR/Cas9载体系统成功构建了高效PPARD基因编辑载体，并且未经药物筛选即可在细胞上实现高效率基因编辑，将大幅提高后续筛选单细胞克隆效率，推进对PPARD基因的功能研究。     

几个生态因子对萼花臂尾轮虫休眠卵萌发的影响

本文研究了生态因子(温度、pH、孵化液、光照等)对萼花臂尾轮虫休眠卵萌发的影响。结果表明:萼花臂尾轮虫休眠卵在17℃~29℃范围内皆有不同比例的萌发,以23℃时萌发率最高,萌发率为60.17±4.18%,在17℃~23℃休眠卵的萌发率随着温度的升高而增加,在23℃以上萌发率随着温度的升高而降低,冷冻保存轮虫休眠卵,可极显著地提高萌发率(p<0.01);pH在5~9范围内休眠卵也有不同比例的萌发,以pH为7和8时的萌发率最高,极显著地高于其它pH条件下的萌发率(p<0.01);轮虫休眠卵萌发以曝气的自来水作萌发液萌发效果最好,原液次之,用未曝气的自来水萌发效果最差;光照对休眠卵的萌发率无显著地影响(p>0.05)。