风车子抑素A4对人脐静脉内皮细胞的抑制增殖与诱导自噬作用研究

目的研究自噬在风车子抑素A4(Combretastatin A4,CA4)抑制人脐静脉内皮细胞(HUVECs)增殖中的作用,探讨CA4抑制血管生成的机制。方法体外培养HUVECs,采用不同浓度的CA4处理HUVECs,药物作用不同时间后用MTT法检测CA4对细胞存活率的影响,MDC染色检测10n M CA4处理不同时间自噬小体变化的情况,RT-PCR检测自噬相关基因LC3B和Beclin 1基因转录水平的变化,Western Blot检测LC3B和Beclin1的蛋白表达水平的变化。结果 CA4能抑制HUVECs增殖并在一定范围呈浓度依赖性和时间依赖性;10n M CA4处理12小时和24小时自噬小体显著增加,诱导HUVECs自噬;荧光定量PCR结果显示自噬相关基因LC3Ⅰ表达下调、LC3Ⅱ表达上调,LC3Ⅰ/LC3Ⅱ比值显著上调,Beclin 1表达上调;Western Blot结果与荧光定量PCR结果一致,但m TOR蛋白未见明显变化。结论 CA4能显著抑制HUVECs增殖和诱导HUVECs自噬。     

来氟米特对前列腺癌PC3细胞增殖与凋亡的影响

为了研究来氟米特(LEF)对前列腺癌细胞增殖和凋亡的影响,采用前列腺癌细胞株PC3与不同浓度的来氟米特(0,50,100,150μmol·L~(-1))共培养(24,48,72 h),通过CCK-8细胞活力检测实验和克隆形成实验,发现来氟米特抑制PC3细胞增殖,且存在明显的浓度时间依赖性;流式细胞检测表明,来氟米特使PC3细胞发生S期阻滞,并且促进其凋亡;当来氟米特浓度≥150μmol·L~(-1)时,Western Blot实验检测到Caspase-3蛋白发生剪切活化.来氟米特处理可诱导PC3细胞自噬,采用羟氯喹抑制自噬可促进细胞凋亡的发生,提示自噬增强了细胞抗凋亡能力.研究表明,来氟米特可抑制PC3细胞的增殖,诱导其凋亡,可能对前列腺癌有潜在的治疗作用.     

Ghrelin通过诱导细胞自噬加剧H9c2细胞缺氧复氧损伤

用CoCl₂诱导H9c2细胞缺氧损伤24 h后,再将培养基换成新鲜培养基,以模拟心肌细胞体外缺血-再灌模型,并在此基础上通过ghrelin对细胞自噬的调节来评价ghrelin对心肌细胞缺氧-复氧损伤的调节作用.用流式细胞技术和LDH活性检测细胞凋亡和坏死.WST-1检测细胞活力;DCFH2-DA探针评估细胞内活性氧水平;用Western blotting检测细胞自噬.研究结果表明ghrelin处理的缺氧-复氧损伤细胞活力降低、LDH活性、细胞凋亡、ROS含量及自噬增加,用3MA处理后可明显抑制细胞自噬,并伴随细胞活力的显著升高,因此,ghrelin通过加强细胞自噬加剧了CoCl₂诱导的H9c2细胞缺氧-复氧损伤.     

调节细胞自噬对鱼藤酮诱导PC12细胞损伤的影响

以鱼藤酮处理的PC12细胞为帕金森病体外模型,分别使用雷帕霉素作为自噬途径的促进剂,巴佛洛霉素A1和3-甲基腺嘌呤作为抑制剂,检测调节细胞自噬对细胞凋亡的影响,发现巴佛洛霉素A1极大提高了细胞凋亡率,3-甲基腺嘌呤则可以减轻鱼藤酮诱导的细胞凋亡,而雷帕霉素虽然促进受损细胞凋亡,但降低了受损细胞早期的死亡率.构建pEGFP-LC3 稳定转染的PC12细胞,流式细胞检测结果显示,抑制或促进细胞自噬,细胞内自噬相关蛋白LC3均有明显增加.     

糖氧剥夺对大鼠脂肪干细胞自噬和成脂的影响

目的 研究大鼠脂肪干细胞( adipose derived stem cells,ADSC)及糖氧剥夺下,细胞自噬和对诱导分化成脂的影响。 方法常规制备 ADSC, 设 置 对 照 组 ( G 组 ) 、 少 糖 组 ( SG 组 ) 、 缺 氧 组 ( G + CoCl2 组 ) 、 缺氧少糖组( SG+CoCl2 组)和自噬阳性对照组( EBSS 组) 。 设置不同培养时间,MTT 检测各组 ADSC 存活情况;Western blot 分析细胞自噬及成脂诱导油红“ O”染色与比色。 结果 不同培养时间,ADSC 细胞均可增殖。 培养 24 h,各组细胞之间无差别( P>0. 05) ,但培养 48 h 和 72 h,G 组细胞增殖明显高于其它三组( SG 组、G + CoCl2 组和 SG+CoCl2 组) ,P<0.05;Western blot 分 析, EBSS 组、G 组 和 SG 组 的自噬相关蛋白 Ⅰ 型 ( LC3-Ⅰ ) 明显弱于自噬相关蛋白Ⅱ 型( LC3-Ⅱ ) ,且 G+CoCl2 组和 SG+CoCl2 组的 LC3-Ⅰ 明显高于 EBSS 组;成脂诱导实验中,G 组油红“ O” 比色值最高,与其它组比较均有统计学差异( P<0. 05) 。 结论 ADSC 具有较强的细胞自噬作用,推测在缺糖缺氧条件下,通过抑制细胞自噬,降低 ADSC 存活率以及诱导分化成脂率。     

MEK5α和MEK5β调控Beclin 1启动子

Beclin 1是哺乳动物自噬相关基因,调控自噬起始和自噬体成熟.在肌肉分化过程中,Beclin 1基因表达上调,自噬增加;此外MEK5-ERK5信号活化并调控成肌细胞分化.因此,在肌肉分化过程中,MEK5-ERK5信号通路可能调控Beclin 1基因表达.目的是阐明MEK5对成肌细胞Beclin 1基因启动子活性的调控.将不同长度Beclin 1启动子片段克隆至荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic并转染成肌细胞C2C12.双荧光素酶报告基因检测实验结果显示,含Beclin 1基因起始密码子上游586碱基对DNA片段的载体(p-354)具有强荧光素酶活性.MEK5α显著增加p-354荧光素酶活性,并有剂量依赖性;而MEK5β显著降低p-354荧光素酶活性.MEK5β能够拮抗MEK5α对p-354荧光素酶活性的调控.与MEK5对Beclin 1基因启动子调控结果一致,MEK5αCA上调细胞Beclin 1 mRNA表达,MEK5βDD下调Beclin 1mRNA表达,并且MEK5βDD抑制MEK5αCA对Beclin 1 mRNA表达的促进作用.此外,转录因子CREB家族成员CREB3,CREBP和CREBL1能够显著上调p-354荧光素酶活性.CREB3呈剂量依赖性显著上调p-354荧光素酶活性,并与MEK5α具有协同效应.MEK5α和MEK5β对Beclin 1启动子具有不同调控作用,CREB可能是其下游效应因子.     

蛇葡萄素对结肠癌细胞增殖抑制、自噬诱导及自噬对增殖的影响研究

明确蛇葡萄素(Ampelopsin,AMP)对人结肠癌HCT116细胞增殖的抑制,探讨自噬活化及自噬对AMP抑制细胞增殖作用的影响,为AMP临床研究抗肿瘤作用的自噬靶点提供依据.采用CCK-8法检测AMP(0～300μg/m L)作用HCT116细胞后细胞增殖变化,确定AMP的抗肿瘤作用;慢病毒感染法构建HCT116-RFP-GFP-LC3重组细胞株研究自噬标志蛋白LC3的荧光表达,结合蛋白质印迹法检测自噬标志蛋白LC3I/II和P62的表达确定细胞自噬活化状态;通过抑制剂Baf A1阻断HCT116细胞自噬晚期降解过程,比较AMP组与AMP+Baf A1组间AMP对HCT116细胞增殖的影响明确自噬对细胞增殖的影响.结果表明:AMP(150～300μg/m L)抑制细胞增殖,表明AMP具有抗肿瘤作用;对比空白对照组,AMP(50、75μg/m L)组重组细胞出现LC3荧光点状自噬体,自噬发生率分别为26.72%、19.47%; LC3II蛋白表达上调,P62下调,表明AMP诱导细胞自噬且自噬过程完整;与AMP组比较,加入Baf A1后,LC3II、P62蛋白及自噬点均显著增加,证明自噬晚期过程被阻断,但抑制自噬晚期降解过程对AMP组与AMP+Baf A1组间细胞增殖影响不显著(P0.05),说明在实验浓度范围内,阻断自噬降解过程对细胞增殖无显著影响.结论表明:AMP(0～300μg/m L)能够抑制结肠癌细胞增殖,激活细胞自噬,且自噬晚期降解过程阻断对细胞增殖无显著影响,细胞的增殖抑制可能是通过其他途径实现.     

SMYD3对氯化钴诱导T47D乳腺癌细胞缺氧的影响分析

为了探究组蛋白甲基化酶SMYD3是否会对氯化钴(CoCl_2)诱导乳腺癌细胞缺氧损伤作用产生影响,采用MTT法和流式细胞术检测不同浓度的CoCl_2(0、50、100、200、400,μmol/L)给药24,h以及联合转染过表达质粒使SMYD3过表达后对T47D细胞的增殖及细胞周期的影响;实时荧光定量PCR法(Real-time PCR)检测其对SMYD3转录表达的影响情况.MTT和流式细胞术结果显示:CoCl_2可剂量依赖性地对T47D乳腺癌细胞的增殖产生抑制作用(P0.01),并诱导产生G0/G1期细胞周期阻滞(P0.05).CoCl_2可以抑制SMYD3的转录(P0.01).利用siRNA抑制内源性SMYD3表达后同样可诱导细胞发生G0/G1期阻滞(P0.05),而转染外源质粒使SMYD3过表达则可明显拮抗CoCl_2所诱导的G0/G1期阻滞及对细胞的杀伤作用.CoCl_2对T47D细胞的周期调控作用可能与抑制SMYD3的表达有关,SMYD3的过表达可提升肿瘤细胞在缺氧环境下的存活能力.     

地塞米松在体外通过自噬减少亨廷顿蛋白积聚

为探讨地塞米松对亨廷顿模型细胞中突变亨廷顿蛋白水平影响，以及自噬在其中的作用，将表达GFP-Htt(Q74)的PC12细胞分为对照组、地塞米松组、3-甲基腺嘌呤组（3-methyladenine,3-MA）和3-MA+地塞米松组，使用荧光显微镜观测自噬水平、突变亨廷顿蛋白的累积情况；蛋白质印迹法检测突变亨廷顿蛋白表达水平。结果显示：相比对照组，地塞米松组细胞中突变亨廷顿蛋白聚集和水平显著减少（P<0.05），地塞米松引发PC12细胞LC3点状聚集；与地塞米松组细胞相比，3-MA+地塞米松组细胞中，突变亨廷顿蛋白聚集和水平显著增加。地塞米松在体外能显著减少GFP-Htt(Q74)-PC12细胞内突变亨廷顿蛋白聚集水平，其机制可能与激活自噬降解途径有关。     

甘松新酮对H9C2心肌细胞低氧损伤的作用及其机制

以氯化钴(CoCl₂)构建H9C2心肌细胞低氧损伤模型,研究Nar在其中的作用及机制. CCK-8试剂盒检测细胞活力,流式细胞仪测细胞凋亡,以自噬抑制剂3-MA预作用细胞探讨Nar对自噬的影响,Western Blot检测Beclin-1、LC3II/LC3I、P62、Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白表达,分光光度计测定乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和肌酸激酶(CK)含量. 结果显示:CoCl₂ (500 μmol/L)可抑制约50 %细胞生长,而Nar (50 μmol/L)预处理显著减轻了CoCl₂ (500 μmol/L)诱导的细胞凋亡;另外,Nar通过增加LC3II/LC3I和Beclin-1表达及促进P62降解激活了自噬,但3-MA预作用逆转了该过程;3-MA预作用同时逆转了Nar对CoCl₂造成的H9C2细胞凋亡和氧化损伤的保护作用. 研究表明:Nar在心肌细胞低氧损伤中以诱导自噬抑制凋亡的方式保护心肌细胞,Nar可能成为治疗低氧性心脏病的潜在药物.     

MEK5$\alpha $ 和 MEK5$\beta $ 调控 ${\bf Beclin}$ 1 启动子

Beclin 1是哺乳动物自噬相关基因, 调控自噬起始和自噬体成熟. 在肌肉分化过程中, Beclin 1 基因表达上调, 自噬增加; 此外 MEK5-ERK5 信号活化并调控成肌细胞分化. 因此, 在肌肉分化过程中, MEK5-ERK5 信号通路可能调控 Beclin 1 基因表达. 目的是阐明 MEK5 对成肌细胞 Beclin 1 基因启动子活性的调控. 将不同长度 Beclin 1 启动子片段克隆至荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic并转染成肌细胞C2C12. 双荧光素酶报告基因检测实验结果显示, 含 Beclin 1 基因起始密码子上游 586 碱基对 DNA 片段的载体(p-354)具有强荧光素酶活性. MEK5$\alpha $显著增加 p-354 荧光素酶活性, 并有剂量依赖性; 而 MEK5$\beta $ 显著降低 p-354 荧光素酶活性. MEK5$\beta $能够拮抗 MEK5$\alpha $对 p-354 荧光素酶活性的调控. 与 MEK5 对 Beclin 1 基因启动子调控结果一致, MEK5$\alpha $CA 上调细胞Beclin 1 mRNA 表达, MEK5$\beta $DD 下调 Beclin 1 mRNA 表达, 并且 MEK5$\beta $DD 抑制 MEK5$\alpha $CA 对 Beclin 1 mRNA 表达的促进作用. 此外, 转录因子 CREB 家族成员 CREB3, CREBP 和 CREBL1 能够显著上调 p-354 荧光素酶活性. CREB3 呈剂量依赖性显著上调 p-354 荧光素酶活性, 并与 MEK5$\alpha $ 具有协同效应. MEK5$\alpha $ 和 MEK5$\beta $ 对 Beclin 1 启动子具有不同调控作用, CREB 可能是其下游效应因子.     

过氧化氢诱导前列腺癌PC3细胞HSP60表达和Akt蛋白磷酸化的研究

以不同浓度H_2O_2刺激PC3细胞24h,应用MTT法分析细胞活力变化,并采用蛋白印迹方法检测HSP60蛋白、Akt蛋白(总Akt蛋白)和磷酸化Akt蛋白的表达水平.结果表明,15.625μmol/L的H2O2可诱导PC3细胞内HSP60表达显著升高(p0.05),7.312μmol/L和15.625μmol/L的H_2O_2均会导致磷酸化Akt蛋白的量显著下降(p0.01),但该两种浓度的刺激对细胞内总Akt蛋白量并无显著影响(p0.05).     

酒精对PC12细胞凋亡的诱导作用

采用不同浓度酒精处理PC12细胞,观察酒精诱导细胞凋亡作用及其与线粒体凋亡途径的关系.结果显示,采用50、100、200、400和800mmol/L浓度的酒精处理去血清培养的PC12细胞24h后,细胞存活率分别是单纯去血清培养细胞存活率的85.66%、74.28%、62.47%、54.14%和50.35%,呈浓度依赖性,与对照组比较差异显著(P0.05).Hoechst 33342/PI染色法观察到典型凋亡现象,如核型固缩、染色质凝集等.DNA琼脂糖凝胶电泳可见100~400mmol/L浓度酒精处理组呈现凋亡细胞典型梯状DNA.酒精能使PC12细胞线粒体膜电位下降并呈浓度依赖性.酒精致PC12细胞凋亡过程中,凋亡关键蛋白Caspase-3、Caspase-9表达量升高.上述结果表明,酒精能够诱导PC12细胞凋亡,诱导作用随浓度升高而增强且酒精诱导PC12细胞凋亡与线粒体凋亡途径有关.     

镉致PC12细胞的神经毒性

镉是环境中常见的重金属,为了研究镉暴露可能会对神经系统造成的损伤,文章以PC12细胞为模型,观察不同浓度氯化镉暴露对PC12细胞的损伤。实验用0.1、0.5、2.5μmol/L镉处理PC12细胞24 h, MTT比色法检测细胞存活率,并检测0.1、0.5μmol/L镉处理后PC12细胞分化和活性氧变化。MTT结果显示,0.5μmol/L的镉处理显著降低了PC12细胞的存活率,镉暴露对PC12细胞存活率的降低呈剂量依赖性;细胞分化实验结果表明,镉暴露后细胞突起总长度、一级分支和二级分支数目显著降低,且镉对神经发生的抑制作用呈剂量依赖性;细胞内活性氧检测实验表明,镉暴露后细胞内的活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)荧光信号显著增加。上述结果表明,镉可能是通过增加细胞内ROS影响细胞的存活率和分化,进而引起神经毒性。     

黄秦艽活性提取物对雪上一枝蒿所致PC12细胞毒性的保护作用研究

目的探讨黄秦艽中活性成分D1对雪上一枝蒿总生物碱(CFA)所致的PC12细胞损伤的保护作用及机制。方法用噻唑蓝(MTT)比色法测定细胞活力,试剂盒测定乳酸脱氢酶(LDH)活力,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测Bcl-2表达水平。结果 CFA孵育24 h可剂量依赖性降低PC12细胞存活率。D1(6.25~25μg/m L)预孵育2 h可显著抑制CFA所致的PC12细胞损伤和LDH释放,当D1浓度为6.25μg/m L和25μg/m L时,Bcl-2蛋白表达水平明显上升。结论 D1可通过修复损伤的线粒体及调节相应凋亡蛋白表达保护CFA所致的PC12损伤。     

一种新的咪唑通过AMPK/mTOR途径诱导肿瘤细胞自噬

自噬与肿瘤的发生有着密切的关系.通过防止受损蛋白质和细胞器的毒性积累,自噬限制氧化应激、慢性组织损伤和致癌信号传导,抑制癌症的发生,这表明了自噬激活在癌症预防和治疗中的作用.研究发现一种新的咪唑,命名为NO.143.利用胰腺癌细胞PANC-1为模型,用MTS检测不同浓度NO.143对细胞活力的影响,共聚焦显微镜观察自噬荧光点,Western blot检测自噬相关蛋白LC3B、ATG13、p62的表达情况,以及AMPK/mTOR信号通路相关蛋白的表达情况.结果表明,NO.143呈现浓度依赖性地抑制肿瘤细胞的增殖. NO.143能够明显增加细胞中自噬荧光斑点、LC3B表达、ATG13的含量和p62的降解,表明NO.143能够显著上调肿瘤细胞的自噬.进一步研究显示,NO.143能够增加AMPKα的磷酸化水平,降低哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和S6的磷酸化水平.相反的,在抑制AMPKα活性后,这种现象发生逆转.这些结果都可能表明NO.143通过AMPK/mTOR信号传导途径诱导肿瘤自噬,抑制肿瘤细胞的增殖.     

PC12细胞对急性缺氧耐受的体积调节

采用大鼠嗜铬细胞瘤克隆株PC12细胞研究了高渗(450mOsm)诱导对PC12细胞缺氧耐受的影响及其相关机制.在诱导培养3d后,PC12细胞的醛糖还原酶基因表达水平显著升高.急性缺氧24h后其乳酸脱氢酶(LDH)漏出率为(20.4±6.0)%,与正常对照组(17.5±7.0)%接近,而未诱导细胞的LDH漏出率为(49.6±13.8)%.经过诱导的PC12细胞其细胞体积的变化幅度相对较小,急性缺氧24h后,细胞体积增加为正常对照的3.6倍.而未诱导细胞的体积增大至正常对照的6.6倍.加入0.5mmol/L的奎尼丁阻断醛糖还原酶-山梨醇系统对效应分子山梨醇的释放后,急性缺氧24h其乳酸脱氢酶(LDH)漏出率达(83±2)%.以上结果提示高渗诱导后PC12细胞缺氧耐受能力提高,其保护作用可能与细胞体积调节机制有关.推测醛糖还原酶-山梨醇系统可能通过维持细胞体积的稳定,保护细胞结构的完整从而阻断了进一步细胞死亡发生的启动.     

盐酸去氢骆驼蓬碱诱导人胰腺癌AsPC-1细胞凋亡

目的:探讨盐酸去氢骆驼蓬碱对人胰腺癌AsPC-1细胞的增殖抑制作用及其可能的作用机制。方法:采用噻唑蓝(MTT)法及克隆形成抑制实验观察盐酸去氢骆驼蓬碱对胰腺癌AsPC-1细胞的增殖抑制作用,流式细胞仪检测细胞凋亡水平,Western blotting检测细胞凋亡及自噬相关蛋白的表达水平。结果:盐酸去氢骆驼蓬碱作用人胰腺癌AsPC-1细胞后,不同浓度的药物对其生长均有抑制作用,且呈剂量-效应关系(P<0.01),24、48及72h的IC50分别约为116.5、66、22.3μmol.L-1;与对照组相比随着盐酸去氢骆驼蓬碱浓度的增加,细胞克隆逐渐减少;不同浓度盐酸去氢骆驼蓬碱作用后,均出现明显的晚期凋亡及坏死细胞群,且呈剂量-效应关系;盐酸去氢骆驼蓬碱作用后,胰腺癌AsPC-1细胞出现Caspase-3、PARP酶切活化,同时自噬标记性蛋白LC3Ⅱ增加,P62减少。结论:盐酸去氢骆驼蓬碱通过诱导细胞凋亡及自噬的方式抑制人胰腺癌AsPC-1细胞的生长。     

基于RNA-seq的HBSS诱导细胞自噬的组学分析及实验验证

为寻找Hank’s平衡盐溶液(HBSS)诱导细胞自噬的调控蛋白,对HBSS诱导大鼠肾上皮(NRK)细胞株的细胞自噬现象进行转录组分析和实验验证.用HBSS分别处理细胞不同时长,结合LC3B-Ⅱ蛋白表达量和细胞存活率确定最佳诱导时间.根据最佳诱导时间制作细胞样品,进行转录组测序(RNA-seq),原始数据质控过滤后进行注释和分析.选取表达差异变化排序靠前的基因进行敲降实验,筛选具有潜在调控功能的蛋白质,接着用荧光定量PCR实验对该蛋白质的上游基因表达情况进行辅助验证.结果发现,HBSS诱导细胞自噬的最佳诱导时间为3 h;在转录组结果中共鉴定到32 305个基因,477个差异表达基因,差异基因的GO和KEGG富集分析结果显示这些基因主要参与代谢底物分解、氨基酸转运以及蛋白质修饰调控等信号调控通路;免疫印迹结果表明干扰基因Sat1的表达可以降低细胞内LC3B-Ⅱ的表达水平.本研究围绕HBSS诱导细胞自噬进行转录组学测序分析,并通过实验发现了影响LC3B-Ⅱ表达的潜在功能调控基因Sat1.综合考虑所有实验结果,Sat1可能通过GO和KEGG显著富集的信号通路影响HBSS诱导的细胞自噬,这些发现...     

壳寡糖对HeLa细胞和A549细胞自噬性死亡的影响

为了探讨壳寡糖(COS)对He La细胞和A549细胞自噬性死亡的影响,利用不同浓度COS处理细胞后MTT法检测细胞的增殖抑制情况,采用MDC染色法观察自噬泡的形成,免疫荧光法检测LC3在细胞内的表达,Western-blot分析COS处理He La和A549细胞不同时间后细胞内LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ变化。结果表明,5.0 mg·m L-1COS对两种细胞的增殖抑制率最大,分别为52.15%和57.63%(P0.01)。与阴性对照相比,经COS处理后的细胞MDC染色细胞内荧光强度增加,且阳性信号聚集于核周区域;免疫荧光检测发现LC3阳性颗粒数明显增加,表明细胞内自噬体的数量增多。Western-blot检测分析随着COS处理细胞时间延长,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值逐渐增大,显示细胞内自噬活性增强。由此推测COS能够通过诱导He La和A549细胞的自噬性死亡来抑制细胞增殖,为COS的抗肿瘤作用机制的研究提供理论依据。