美洲大蠊多肽和顺铂联用对HepG2细胞凋亡及自噬的影响

采用MTT法检测美洲大蠊多肽（PAP-3）与不同浓度的顺铂（DDP）单用或联合使用对人肝癌HepG2细胞增殖的影响；采用流式细胞术检测PAP-3、DDP单独或联合给药干预对HepG2细胞凋亡的影响；Western Blot检测PAP-3、DDP单独或联合给药后HepG2细胞内自噬相关蛋白p62、LC3、Beclin-1、Atg5及PI3K的表达。实验结果显示，与DDP单独给药相比，PAP-3与DDP联合给药对HepG2的细胞的抑制作用更强；PAP-3与DDP联合给药组中细胞的凋亡率与DDP和PAP-3单独给药组相比均有升高（P ＜ 0.05)。与对照组相比，DDP组中，p62蛋白水平降低，LC3II蛋白水平升高，LC3II/I的比例也升高，表现出细胞自噬流的活化；与DDP组相比，联合给药组中p62蛋白水平回升，LC3II蛋白水平和LC3II/I的比例均有回落。且联合给药组中PI3K、Atg5、Beclin-1等自噬相关蛋白的量均较DDP组减少，而凋亡相关的Caspase-3蛋白的表达量则较DDP组增加。据此推测，PAP-3和DDP的联用可以通过抑制HepG2细胞自噬相关蛋白的表达水平，抑制DDP带来的细胞自噬水平的升高，增加细胞对DDP的敏感性，从而诱导HepG2细胞凋亡。     

壳寡糖对HeLa细胞和A549细胞自噬性死亡的影响

为了探讨壳寡糖(COS)对He La细胞和A549细胞自噬性死亡的影响,利用不同浓度COS处理细胞后MTT法检测细胞的增殖抑制情况,采用MDC染色法观察自噬泡的形成,免疫荧光法检测LC3在细胞内的表达,Western-blot分析COS处理He La和A549细胞不同时间后细胞内LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ变化。结果表明,5.0 mg·m L-1COS对两种细胞的增殖抑制率最大,分别为52.15%和57.63%(P0.01)。与阴性对照相比,经COS处理后的细胞MDC染色细胞内荧光强度增加,且阳性信号聚集于核周区域;免疫荧光检测发现LC3阳性颗粒数明显增加,表明细胞内自噬体的数量增多。Western-blot检测分析随着COS处理细胞时间延长,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值逐渐增大,显示细胞内自噬活性增强。由此推测COS能够通过诱导He La和A549细胞的自噬性死亡来抑制细胞增殖,为COS的抗肿瘤作用机制的研究提供理论依据。     

化学低氧诱导剂二氯化钴对PC12细胞自噬的影响

文章研究化学性低氧诱导剂二氯化钴(CoCl_2)对PC12细胞自噬的影响。体外培养PC12细胞,用不同浓度CoCl_2处理PC12细胞24 h。首先通过MTT实验选取后续的CoCl_2处理浓度,用荧光定量聚合酶链式反应(quantitative polymerase chain reaction, q-PCR)实验检测不同浓度CoCl_2处理PC12细胞24 h后细胞内HIF-1α基因表达水平。用Western Blot方法检测CoCl_2处理后自噬相关蛋白Beclin1、LC3-Ⅱ蛋白表达水平。结果表明,400、800μmol/L CoCl_2处理PC12细胞24 h不仅能显著降低细胞存活率,并且能显著提高HIF-1α基因表达,即表明用CoCl_2造模确实可以模拟细胞体外缺氧。此外,800μmol/L CoCl_2处理组的Beclin1、LC3-Ⅱ蛋白表达量出现显著降低,表明CoCl_2处理抑制了细胞自噬,并且该种抑制是呈时间依赖的。研究结果表明,CoCl_2引起的化学性缺氧会损伤PC12细胞,并且会抑制细胞正常的自噬,该异常的自噬可能参与了CoCl_2致PC12细胞的损伤。     

风车子抑素A4对人脐静脉内皮细胞的抑制增殖与诱导自噬作用研究

目的研究自噬在风车子抑素A4(Combretastatin A4,CA4)抑制人脐静脉内皮细胞(HUVECs)增殖中的作用,探讨CA4抑制血管生成的机制。方法体外培养HUVECs,采用不同浓度的CA4处理HUVECs,药物作用不同时间后用MTT法检测CA4对细胞存活率的影响,MDC染色检测10n M CA4处理不同时间自噬小体变化的情况,RT-PCR检测自噬相关基因LC3B和Beclin 1基因转录水平的变化,Western Blot检测LC3B和Beclin1的蛋白表达水平的变化。结果 CA4能抑制HUVECs增殖并在一定范围呈浓度依赖性和时间依赖性;10n M CA4处理12小时和24小时自噬小体显著增加,诱导HUVECs自噬;荧光定量PCR结果显示自噬相关基因LC3Ⅰ表达下调、LC3Ⅱ表达上调,LC3Ⅰ/LC3Ⅱ比值显著上调,Beclin 1表达上调;Western Blot结果与荧光定量PCR结果一致,但m TOR蛋白未见明显变化。结论 CA4能显著抑制HUVECs增殖和诱导HUVECs自噬。     

自噬对肝癌SMMC-7721细胞侵袭迁移能力的影响

为探讨自噬对照射过程中肝癌SMMC-7721细胞侵袭和迁移能力的影响及其潜在的作用机制,将肝癌SMMC-7721细胞分为6组,分别为阴性对照(NC)组、8 Gy X-线照射(IR)组、自噬激活剂雷帕霉素(Rapa)组、自噬抑制剂三甲基腺嘌呤(3-MA)组、照射+雷帕霉素(IR+Rapa)组和照射+三甲基腺嘌呤(IR+3-MA)组,利用划痕实验和Transwell实验检测自噬对肝癌SMMC-7721细胞迁移和侵袭的影响;用CCK8实验检测照射、雷帕霉素和3-MA对肝癌细胞增殖的影响;用蛋白免疫印迹(Western blot)检测N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)和LC3B蛋白表达情况。研究结果显示,照射可增强肝癌SMMC-7721细胞侵袭迁移的能力(P<0.05),同时,照射可抑制细胞的增殖能力(P<0.05);雷帕霉素激活自噬可增强细胞的侵袭迁移能力(P<0.05),3-MA抑制自噬可抑制细胞侵袭迁移和细胞的增殖能力(P<0.05)。照射可上调N-cadherin、Vimentin表达水平(P<0.05),激活或抑制自噬可分别增加或抑制N-cadherin、Vimentin蛋白表达水平(P<0.05)。表明X-线照射可激活自噬,促进细胞上皮-间充质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)的发生。激活自噬可以提高肝癌细胞上皮间质转化进而促进肝癌细胞侵袭迁移;反之,抑制自噬可阻碍肝癌细胞的侵袭迁移。     

糖氧剥夺对大鼠脂肪干细胞自噬和成脂的影响

目的 研究大鼠脂肪干细胞( adipose derived stem cells,ADSC)及糖氧剥夺下,细胞自噬和对诱导分化成脂的影响。 方法常规制备 ADSC, 设 置 对 照 组 ( G 组 ) 、 少 糖 组 ( SG 组 ) 、 缺 氧 组 ( G + CoCl2 组 ) 、 缺氧少糖组( SG+CoCl2 组)和自噬阳性对照组( EBSS 组) 。 设置不同培养时间,MTT 检测各组 ADSC 存活情况;Western blot 分析细胞自噬及成脂诱导油红“ O”染色与比色。 结果 不同培养时间,ADSC 细胞均可增殖。 培养 24 h,各组细胞之间无差别( P>0. 05) ,但培养 48 h 和 72 h,G 组细胞增殖明显高于其它三组( SG 组、G + CoCl2 组和 SG+CoCl2 组) ,P<0.05;Western blot 分 析, EBSS 组、G 组 和 SG 组 的自噬相关蛋白 Ⅰ 型 ( LC3-Ⅰ ) 明显弱于自噬相关蛋白Ⅱ 型( LC3-Ⅱ ) ,且 G+CoCl2 组和 SG+CoCl2 组的 LC3-Ⅰ 明显高于 EBSS 组;成脂诱导实验中,G 组油红“ O” 比色值最高,与其它组比较均有统计学差异( P<0. 05) 。 结论 ADSC 具有较强的细胞自噬作用,推测在缺糖缺氧条件下,通过抑制细胞自噬,降低 ADSC 存活率以及诱导分化成脂率。     

细胞自噬的调节机制与选择性降解

细胞自噬是一个多步骤的降解过程.当细胞自噬发生时,具有双层膜结构的自噬小体先把待降解的细胞内容物包裹起来,然后与溶酶体融合将内容物降解.细胞自噬起初仅被认为是对营养缺乏的适应性机制,是一个非选择性降解过程.近些年来不断深入的研究表明,细胞自噬同时还参与了抵抗炎症、肿瘤、神经退行性变及心脏病等重要生理过程.随着细胞自噬受体蛋白p62的发现,人们进一步认识到细胞自噬还是一个具有高度选择性的降解过程.本文综述了细胞自噬的调节机制及其对一些蛋白聚合体的选择性降解.     

调节细胞自噬对鱼藤酮诱导PC12细胞损伤的影响

以鱼藤酮处理的PC12细胞为帕金森病体外模型,分别使用雷帕霉素作为自噬途径的促进剂,巴佛洛霉素A1和3-甲基腺嘌呤作为抑制剂,检测调节细胞自噬对细胞凋亡的影响,发现巴佛洛霉素A1极大提高了细胞凋亡率,3-甲基腺嘌呤则可以减轻鱼藤酮诱导的细胞凋亡,而雷帕霉素虽然促进受损细胞凋亡,但降低了受损细胞早期的死亡率.构建pEGFP-LC3 稳定转染的PC12细胞,流式细胞检测结果显示,抑制或促进细胞自噬,细胞内自噬相关蛋白LC3均有明显增加.     

地塞米松在体外通过自噬减少亨廷顿蛋白积聚

为探讨地塞米松对亨廷顿模型细胞中突变亨廷顿蛋白水平影响，以及自噬在其中的作用，将表达GFP-Htt(Q74)的PC12细胞分为对照组、地塞米松组、3-甲基腺嘌呤组（3-methyladenine,3-MA）和3-MA+地塞米松组，使用荧光显微镜观测自噬水平、突变亨廷顿蛋白的累积情况；蛋白质印迹法检测突变亨廷顿蛋白表达水平。结果显示：相比对照组，地塞米松组细胞中突变亨廷顿蛋白聚集和水平显著减少（P<0.05），地塞米松引发PC12细胞LC3点状聚集；与地塞米松组细胞相比，3-MA+地塞米松组细胞中，突变亨廷顿蛋白聚集和水平显著增加。地塞米松在体外能显著减少GFP-Htt(Q74)-PC12细胞内突变亨廷顿蛋白聚集水平，其机制可能与激活自噬降解途径有关。     

罂粟碱通过调节自噬对肝癌细胞放射敏感性的影响

为探究罂粟碱(Papaverine,PPV)和细胞自噬在原发性肝癌放射敏感性中的作用机理,将肝癌HepG2、Huh7细胞进行X射线照射,并将细胞分为阴性对照(NC)组、罂粟碱(PPV)组、单纯照射(IR)组，然后采用CCK8实验检测细胞的增殖情况,划痕实验检测细胞迁移情况,克隆形成实验检测细胞放射敏感性,实时定量PCR (RT-PCR)实验检测LC3B、ATG7 mRNA表达情况,蛋白免疫印迹(Western blot)实验检测自噬相关标志物LC3B、p62、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR蛋白表达情况。研究结果显示,与NC组相比,罂粟碱对肝癌HepG2和Huh7细胞的增殖有明显的抑制作用(P<0.05),并可以抑制肝癌细胞的迁移能力(P<0.05)，显著降低肝癌细胞LC3B、ATG7 mRNA的表达水平(P<0.05)和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的蛋白表达,提高p62、p-PI3K、p-AKT和p-mTOR的蛋白表达。此外,罂粟碱还可以提高肝癌细胞的放射治疗(RT)效果。上述结果表明罂粟碱通过PI3K/AKT/mTOR通路抑制HepG2、Huh7细胞自噬,从而抑制肝癌细胞的增殖和迁移能力,并提高肝癌细胞放射敏感性。     

一种新的咪唑通过AMPK/mTOR途径诱导肿瘤细胞自噬

自噬与肿瘤的发生有着密切的关系.通过防止受损蛋白质和细胞器的毒性积累,自噬限制氧化应激、慢性组织损伤和致癌信号传导,抑制癌症的发生,这表明了自噬激活在癌症预防和治疗中的作用.研究发现一种新的咪唑,命名为NO.143.利用胰腺癌细胞PANC-1为模型,用MTS检测不同浓度NO.143对细胞活力的影响,共聚焦显微镜观察自噬荧光点,Western blot检测自噬相关蛋白LC3B、ATG13、p62的表达情况,以及AMPK/mTOR信号通路相关蛋白的表达情况.结果表明,NO.143呈现浓度依赖性地抑制肿瘤细胞的增殖. NO.143能够明显增加细胞中自噬荧光斑点、LC3B表达、ATG13的含量和p62的降解,表明NO.143能够显著上调肿瘤细胞的自噬.进一步研究显示,NO.143能够增加AMPKα的磷酸化水平,降低哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和S6的磷酸化水平.相反的,在抑制AMPKα活性后,这种现象发生逆转.这些结果都可能表明NO.143通过AMPK/mTOR信号传导途径诱导肿瘤自噬,抑制肿瘤细胞的增殖.     

白藜芦醇对镉诱导HEK 293T细胞自噬与凋亡的影响

为了探究白藜芦醇与镉诱导人胚胎肾细胞293(HEK 293T)细胞自噬与凋亡之间的关系,本研究在已证明低浓度镉诱导细胞自噬,高浓度镉导致细胞凋亡的基础上,以HEK 293T细胞为研究对象,并分别与镉、白藜芦醇及各种抑制剂进行联合培养,利用免疫印记分析检测自噬标志蛋白LC3B-Ⅱ/Ⅰ、溶酶体标志蛋白cathepsin L...     

细胞自噬对拟南芥种子萌发的影响

自噬在植物生长发育过程发挥着至关重要的作用，但是植物中自噬与种子萌发的关系尚不明确。为了探究自噬对种子萌发的影响，通过基因表达检测、蛋白免疫印迹实验和种子萌发速率比较，分析了细胞自噬对拟南芥(Arabidopsis thaliana)种子萌发的影响。研究结果表明细胞自噬在植物种子萌发过程中发挥重要作用:(1)自噬基因的表达在种子萌发过程中明显上调，且ATG8蛋白在种子萌发过程中逐渐积累，表明种子萌发过程中细胞自噬被激活；(2)细胞自噬抑制剂3-methyladenine (3-MA)能够显著地抑制拟南芥野生型种子的萌发，拟南芥自噬突变体种子的萌发速度比野生型种子的慢，表明细胞自噬途径在种子萌发过程中发挥正向调控作用但不是种子萌发所必需的。     

TRAPP复合物与自噬关系的研究进展

转运蛋白颗粒(TRAPP)是一种高度保守的多亚基蛋白复合物，参与囊泡运输、细胞自噬等过程.细胞自噬是真核生物中高度保守的降解和循环通路，在维持细胞稳态和应对环境压力中起着重要作用.近年来，TRAPP复合物与自噬关系的研究较为广泛，研究表明多个TRAPP复合物亚基参与自噬过程，且TRAPP复合物不同亚基的突变或缺失也与多种人类疾病有关.对TRAPP复合物参与调控细胞自噬机制的深入研究有助于了解一些人类疾病的发生和发展.     

自噬检测质粒pLVX-mRFP-EGFP-LC3的构建和表达鉴定

细胞自噬的机体重要的一种代谢过程,为了更好地研究不同条件下细胞自噬的水平,构建自噬检测质粒pLVX-mRFP-EGFP-LC3。使用Trizol法提取Hela细胞总RNA,PCR技术特异性扩增LC3基因,将目的片段插入pEGFP-N3载体中。再将mRFP片段插入到EGFP-LC3质粒中,利用PCR技术扩增带有不同酶切位点的mRFP-EGFP-LC3片段,插入到慢病毒载体pLVX-puro中。通过Fugene~?6将质粒瞬时转染到293T细胞中,使用荧光显微镜检测荧光蛋白的表达,使用Western blotting检测目的基因的表达。结果显示成功构建自噬检测质粒pLVX-mRFP-EGFP-LC3,荧光显微镜下可见红色和绿色荧光,Western blotting方法检测到LC3的表达。     

岩藻黄素抗D-gal诱导SH-SY5Y细胞衰老作用及机制研究

衰老相关的神经退行性疾病发病率不断增高,严重影响老年人生活质量,为探讨岩藻黄素(Fucoxanthin, FUCO)对神经细胞的抗衰老作用及其机制,采用D-gal诱导人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y细胞)衰老,然后在细胞培养基中添加FUCO对细胞进行干预,检测其细胞活力、SA-β-半乳糖苷酶活性及细胞内丙二醛(MDA)含量,细胞内自噬体形成及自噬(Autophagy)相关蛋白的表达。研究结果显示,5,10μmol/L FUCO可明显抑制D-gal诱导的细胞衰老,显著提高SH-SY5Y细胞活力(P0.05),降低SH-SY5Y细胞内SA-β-半乳糖苷酶的活性(P0.05)和MDA含量(P0.05),但20μmol/L FUCO的抑制作用不明显(P0.05)。光学显微镜观察结果显示,5,10,20μmol/L FUCO组细胞内自噬体数量明显比模型组增多;Western blot检测结果显示,与模型组比较,10,20μmol/L FUCO组自噬相关蛋白ATG5表达增多、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ增大、p-mTOR/mTOR减小(P0.05)。表明FUCO具有抗D-gal诱导的SH-SY5Y细胞衰老的作用,其作用机制可能与适度调节自噬途径有关。     

甘松新酮对H9C2心肌细胞低氧损伤的作用及其机制

以氯化钴(CoCl₂)构建H9C2心肌细胞低氧损伤模型,研究Nar在其中的作用及机制. CCK-8试剂盒检测细胞活力,流式细胞仪测细胞凋亡,以自噬抑制剂3-MA预作用细胞探讨Nar对自噬的影响,Western Blot检测Beclin-1、LC3II/LC3I、P62、Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白表达,分光光度计测定乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和肌酸激酶(CK)含量. 结果显示:CoCl₂ (500 μmol/L)可抑制约50 %细胞生长,而Nar (50 μmol/L)预处理显著减轻了CoCl₂ (500 μmol/L)诱导的细胞凋亡;另外,Nar通过增加LC3II/LC3I和Beclin-1表达及促进P62降解激活了自噬,但3-MA预作用逆转了该过程;3-MA预作用同时逆转了Nar对CoCl₂造成的H9C2细胞凋亡和氧化损伤的保护作用. 研究表明:Nar在心肌细胞低氧损伤中以诱导自噬抑制凋亡的方式保护心肌细胞,Nar可能成为治疗低氧性心脏病的潜在药物.     

自噬在绿脓杆菌感染时对中性粒细胞粘附的作用

为研究自噬在绿脓杆菌感染时对中性粒细胞募集的作用,在分离小鼠骨髓中性粒细胞后进行了中性粒细胞募集级联反应中的粘附实验.结果表明,绿脓杆菌感染可引起中性粒细胞的粘附,同时伴随着整合素CD11b/CD18的表达增强.免疫印迹实验发现,绿脓杆菌感染时中性粒细胞的自噬标志蛋白LC3-II的表达增加,而在自噬抑制剂3-甲基腺苷处理时LC3-II的表达显著地被抑制.3-甲基腺苷还可以显著地抑制中性粒细胞的粘附和整合素CD11b的表达,但是CD18的表达未受抑制剂的影响.由此确定,在绿脓杆菌感染时自噬对骨髓中性粒细胞的粘附起促进作用,这一过程与整合素CD11b的激活相伴.     

基于RNA-seq的HBSS诱导细胞自噬的组学分析及实验验证

为寻找Hank’s平衡盐溶液(HBSS)诱导细胞自噬的调控蛋白,对HBSS诱导大鼠肾上皮(NRK)细胞株的细胞自噬现象进行转录组分析和实验验证.用HBSS分别处理细胞不同时长,结合LC3B-Ⅱ蛋白表达量和细胞存活率确定最佳诱导时间.根据最佳诱导时间制作细胞样品,进行转录组测序(RNA-seq),原始数据质控过滤后进行注释和分析.选取表达差异变化排序靠前的基因进行敲降实验,筛选具有潜在调控功能的蛋白质,接着用荧光定量PCR实验对该蛋白质的上游基因表达情况进行辅助验证.结果发现,HBSS诱导细胞自噬的最佳诱导时间为3 h;在转录组结果中共鉴定到32 305个基因,477个差异表达基因,差异基因的GO和KEGG富集分析结果显示这些基因主要参与代谢底物分解、氨基酸转运以及蛋白质修饰调控等信号调控通路;免疫印迹结果表明干扰基因Sat1的表达可以降低细胞内LC3B-Ⅱ的表达水平.本研究围绕HBSS诱导细胞自噬进行转录组学测序分析,并通过实验发现了影响LC3B-Ⅱ表达的潜在功能调控基因Sat1.综合考虑所有实验结果,Sat1可能通过GO和KEGG显著富集的信号通路影响HBSS诱导的细胞自噬,这些发现...     

LC3真核表达载体构建及其在293T细胞中自噬诱导研究

【目的】构建pEGFP-N1-LC3真核表达载体,并将其转染进人胚肾细胞293T,通过Earle's盐平衡液(Balanced salt solution,EBSS)饥饿诱导观察细胞自噬现象。【方法】RT-PCR扩增LC3基因,并将其插入pEGFP-N1真核表达载体构建重组质粒。将重组质粒转染至人胚肾细胞293T,显微镜观察、Western blot检测GFP-LC3融合蛋白表达情况。对转染细胞进行Earle's盐平衡液饥饿诱导,通过Western blot验证自噬指标,激光共聚焦显微镜观察自噬泡形成。【结果】成功构建pEGFP-N1-LC3真核表达载体,并在293T细胞中成功表达目的蛋白,在进行Earle's盐平衡液饥饿诱导后观察到自噬泡的形成,Western blot检测到LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化。【结论】本实验为研究自噬在癌细胞病理进程中的机制提供了实验素材。