用免疫缺陷雄性F_1代小鼠制备抗问号钩端螺旋体外膜蛋白的单克隆抗体

<正> 单克隆抗体(McAbs)已成为人们研究细菌蛋白在致病机制及抗体反应中之作用的一种重要工具。问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)是引起Weil氏病和“牛乳热”(Dairy Fever)的病原体,由糖、脂和至少9种蛋白构成的外膜所包绕。钩体外膜与纯化脂多糖(LPS)一样也可诱发免疫保护反应,     

不同盐度对Halomonas aquamarina外膜蛋白表达的影响

革兰氏阴性细菌的外膜蛋白(Omp)在维持细菌的生理状态和抵抗外界极端环境中起重要的作用.为研究革兰氏阴性细菌外膜蛋白的抗盐机制,通过比较深海中度嗜盐菌Halomonasaquamarina在正常盐度浓度(0.56mol/LNaCl)、较高(1mol/LNaCl)和高盐度(2mol/LNaCl)下外膜蛋白的双向电泳图谱,获得11个差异点.对这11个差异点进行肽质量指纹图谱及其生物信息分析,鉴定出其中的6个蛋白,并对中度嗜盐细菌外膜蛋白的抗盐机理做了初步的探讨.     

铜绿假单胞菌外膜亚蛋白质组图谱的建立

铜绿假单胞菌是人类重要的病原菌,容易造成免疫缺陷患者如烧伤、艾滋病、癌症或囊性纤维化感染,对该菌外膜蛋白的研究有助于了解该菌的致病机制,为进一步疫苗研制奠定基础.采用月桂酰基氨酸钠的方法提取了铜绿假单胞菌的外膜蛋白,首次建立了外膜亚蛋白质组学表达图谱,鉴定了23个外膜蛋白,占所鉴定蛋白的82.1%.然后对其中的一个外膜蛋白基因PA3988进行了克隆及原核表达与纯化,经免疫小鼠获得抗血清后对外膜蛋白进行双向Western blotting分析,验证了质谱的结果.这些研究结果对铜绿假单胞菌外膜蛋白的深入研究具有积极作用.     

双重PCR法快速检测欧鳗鲡嗜水气单胞菌

采用已知的嗜水气单胞菌编码溶血素(Hemolysin)和外膜蛋白(Ompts)的基因序列为目的基因,依据其保守序列设计两对相应引物,用双重PCR方法检测了32株从发病欧鳗鲡分离的细菌,将检测结果与试剂盒快速生化鉴定结果进行比较.以嗜水气单胞菌为阳性对照,以大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、铜绿假单胞菌、鳗弧菌、溶壁微球菌、金黄色葡萄球菌为阴性对照检测了嗜水气单胞菌溶血素与外膜蛋白基因的特异性.结果表明:被检测的32株欧鳗鲡致病菌中,检测到的4株既有溶血素基因又有外膜蛋白基因的细菌,其生化鉴定结果全部为嗜水气单胞菌,而仅具有外膜蛋白基因的13株细菌中只有5株生化鉴定结果为嗜水气单胞菌.证明双重PCR法可用于快速检测部分嗜水气单胞菌.     

Halomonas aquamarina盐敏感质膜蛋白组的研究

革兰氏阴性细菌外膜蛋白对细菌外部环境因素的调节功能已受到高度重视,但有关细菌质膜的作用报道极少.为研究质膜蛋白在抗盐机制中所起的作用,采用蛋白质组学技术比较深海中度嗜盐菌Halomonasaquamarina在生理(0.56mol/LNaCl)、较高(1mol/LNaCl)和高(2mol/LNaCl)浓度下质膜蛋白差异表达的结果.结果表明,高盐浓度下出现2个新蛋白,质谱分析证明其为ABC转运蛋白.这些发现对从细胞膜整体角度了解细菌的抗盐机理具有重要意义.     

南极寡营养细菌ANT52的脂多糖对梭子蟹非特异性免疫功能的影响

文章采用改良酚水法提取南极寡营养细菌(Alteromonas stellipolaris)ANT52的脂多糖,得率可达6.73%,据SDS-PAGE分析结果判断细菌ANT52的脂多糖为光滑型脂多糖。以南极寡营养细菌ANT52脂多糖提取物免疫注射梭子蟹,分别在免疫接种后的第3、6、9、12天检测梭子蟹血清的溶菌酶活力、超氧化物歧化酶活力及血淋巴细胞的吞噬活性等非特异性免疫指标,结果表明:南极寡营养细菌ANT52提取的脂多糖能显著提高梭子蟹血清中的溶菌酶活力、超氧化物歧化酶活力、血细胞吞噬活性(P<0.05),且各种酶活力及血细胞吞噬活性出现峰值的时间不同,溶菌酶出现峰值时间早于超氧化物歧化酶。     

重组大肠埃希菌外膜蛋白C的表达、纯化及多克隆抗体制备

采用分子克隆方法获得大肠埃希菌外膜蛋白Omp C表达菌株;利用SDS-PAGE电泳切胶纯化、尿素梯度复性获得Omp C蛋白,免疫小鼠制备Omp C蛋白多克隆抗体。ELISA法证实Omp C抗血清滴度达1∶6 400倍,Western blotting发现Omp C抗血清具有很好的特异性。通过DNAMAN软件对Omp C序列同源性分析显示不同细菌间存在较高同源性,采用MEGA软件对Omp C的系统进化分析发现肠道致病菌亲缘关系更近。为Omp C蛋白免疫学功能研究奠定基础。     

多杀性巴氏杆菌外膜蛋白单克隆抗体对兔及鼠巴氏杆菌病的保护

用兔子分离的多杀性巴氏杆菌(P.multocida)免疫小鼠得脾细胞,与骨髓瘤细胞融合后制备针对37.5KDa外膜蛋白的单克隆抗体(MAbs)。用酶联免疫吸附试验(ELISA),全细胞放射免疫沉淀试验(WCRIP),免疫印迹分析筛选所需MAbs。WC-RIP和免疫印迹试验表明,用完整多杀性巴氏杆菌吸附及洗脱的MAb1608,其识别的抗原暴露于细胞表面,抗体易于接近,其分子量为37.5KDa,蛋白酶K处理多杀性巴氏杆菌外膜,MAb1608的活性完全消除,说明此MAb结合于某一蛋白抗原决定簇。在免疫印迹试验中MAbl6108与提纯的脂多糖(LPS)无反应。被动转移研究表明与对照组比,鼻内接种MAb1608并同时鼻内攻毒的9只家兔其死亡率、肺炎严重程度、非呼吸道脏器和鼻腔中多杀性巴氏杆菌数量都明显要低。肺中多杀巴菌数量减少84.750倍。被动转移试验也表明MAb1608保护鼠免受具有该MAb识别抗原决定簇的同源或异源多杀巴菌株的攻击。但是,当用缺乏MAb1608识别抗原决定簇的多杀巴菌株攻击鼠时,MAb1608不提供保护作用。本研究表明37.5KDa外膜蛋白是保护性MAb的作用靶。     

细菌内毒素对基因免疫小鼠存活率和产仔率的影响

作为第三代疫苗,核酸疫苗具有易操作、低成本等优点,但是其内在危险性还有待进一步研究和排除,在其制备过程中可能掺入的细菌内毒素就是影响因素之一.细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁外膜结构中的脂多糖,体内释放后会引起发热、休克等多种病理变化.国外已有体外实验证明内毒素会对小鼠的生殖系统产生影响,本研究旨在通过在体实验探讨内毒素对免疫小鼠的存活率和产仔率的影响.采用常规方法(碱裂解法)、试剂盒2种方法,提取2种pCR3.1-Sry质粒(2种质粒的区别在于是否去除内毒素,其浓度和纯度均经过琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法分析和控制).作为核酸疫苗对小鼠进行免疫:全程统计免疫小鼠的存活率和产仔率,同时注射灭菌ddH2O作为对照.分子生物学实验结果显示,所制备疫苗具有适宜的浓度和较高的纯度;免疫实验和数字统计结果显示,未去除内毒素实验组小鼠较去除内毒素组的存活率由93%下降到84%、产仔率由87.5%下降到35.7%,而去除内毒素组却与对照组没有明显差异.总之,核酸疫苗制备过程中掺入的细菌内毒素会对免疫小鼠造成较大不良影响,特别是生殖系统,体现在产仔率大幅降低.     

小白菊内酯对RAW264.7炎症细胞因子表达的抑制

目的:研究小白菊内酯对细菌脂多糖诱导炎症反应的抑制作用.方法:选用小鼠巨噬细胞RAW264.7,采用实时定量多聚酶链式反应及酶联免疫吸附法,检测不同浓度小白菊内酯(0.1、1、10、50μmol/L)和细菌脂多糖(10μmol/L)作用后,细胞因子的mRNA(IL-6、TNF-α、Ptgs2、IL-1β、IL-10、MMP13与CXCL1)及蛋白(IL-6、TNF-α、IL-1β与IL-10)表达水平的改变.实验同时设立4个对照组,包括DMSO组、脂多糖组、DMSO+脂多糖组及阳性药Bay 11-7082+脂多糖组.结果:浓度分别为10和50μmol/L小白菊内酯稳定有效地抑制脂多糖诱导小鼠巨噬细胞产生细胞因子.在mRNA水平上,IL-6、TNF-α、Ptgs2、IL-1β、IL-10与MMP13的mRNA表达水平明显下降,差异有显著性,CXCL1 mRNA表达水平改变无统计学差异;在蛋白水平上,IL-6、TNF-α、IL-1β与IL-10的表达亦显著性下降,有统计学差异.结论:小白菊内酯有效抑制了细菌脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞中炎症细胞因子的表达.     

哈维氏弧菌TS-628菌株抗原性研究

哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)是海水鱼虾养殖中常见的致病菌,由该菌引发的病害给世界各地的养殖业带来重大经济损失,但对其有效抗原的筛选或相关疫苗的研究报道相当少,对其病害的防治也尚无有效措施.本文以患病青石斑鱼分离到的病原菌哈维氏弧菌TS-628菌株为研究对象,分别提取它的鞭毛蛋白、脂多糖(LPS)和外膜蛋白(OMP),并采用Western blot技术分析检测这3种成分的抗原性.结果显示,鞭毛蛋白主要的免疫印迹带约有4条,其中43、52 ku为主要免疫反应显色带;OMP主要的免疫印迹带约有5条,其中43 ku为最主要免疫反应显色带, 35、38、47和52 ku也具有较强的免疫显色反应.LPS没有检测到免疫印迹反应.这一研究结果将为灵敏检测哈维氏弧菌以及研制高效疫苗奠定基础.     

三（4-甲基芳氧基）镧催化ε-己内酯开环聚合研究

系统研究了三（4-甲基芳氧基）镧[La（OMP）3]催化ε-己内酯（ε-CL）的开环聚合,发现它具有催化活性,并且反应显示出一定活性聚合特征．通过^1H NMR分析端基结构的方法．     

三种不同诱因制作急性肺损伤动物模型的比较

摘要: 目的 对由盐酸( HC1) 、油酸( OA) 和脂多糖( LPS) 3 种诱因所致急性肺损伤( ALI) 动物模型进行比较。方法 将 24 只健康雄性 SD 大鼠随机均分为 4 组: 生理盐水( NS) 组( 尾静脉注射) 、油酸组( 尾静脉注射) 、LPS 组( 尾 静脉注射) 和 HC1 组( 气管内滴入) 。制模后观察 4 h,抽取颈总动脉血进行血气分析。然后处死,解剖取肺组织 HE 染色,观察肺组织病理形态学改变,并进行病理损伤评分。结果 HC1 组、OA 组、LPS 组氧分压( PaO2 ) 均低于 NS 组( P ＜ 0． 01) ,其中 OA 组低于 HC1 组,HC1 组低于 LPS 组,( P ＜ 0． 01) ; 肺损伤程度油酸 ＞ 盐酸 ＞ 脂多糖。结 论 ALI 的发生发展与其致病因素密切相关; 3 种诱因所致急性肺损伤动物模型存在一定差异,急性肺损伤程度不 同,油酸 ＞ 盐酸 ＞ 脂多糖。     

青稞麦绿素对小鼠免疫性肝损伤的保护作用

目的:观察青稞麦绿素(HBG)对小鼠免疫性肝损伤的保护作用.方法:先用HBG预处理,再采用卡介苗和脂多糖(BCG+LPS)制作小鼠急性免疫性肝损伤模型,以联苯双酯滴丸(BDD)为阳性对照.采用全自动生化分析仪测定血清谷丙转氨酶(ALT)、血清碱性磷酸酶(ALP)、血清谷草转氨酶(AST)和血清乳酸脱氢酶(LDH)的含量;连苯三酚自氧化法测定血清超氧化物歧化酶(SOD)活性;硫代巴比妥酸(TBA)显色法测定肝匀浆中的丙二醛(MDA)含量;肝组织常规制片,组织学观察.结果:不同剂量的HBG组血清ALT、ALP、AST、LDH和肝组织中MDA含量明显低于对照组,血清SOD明显高于对照组;镜下病理显示,HBG对由BCG+LPS引起的小鼠急性肝损伤造成的肝细胞水样变性、大片坏死、炎性细胞浸润等状态有缓解作用.结论:HBG对由BCG+LPS引起的小鼠免疫性肝损伤有保护作用,其作用机制可能与其抗自由基和参与免疫调节有关.     

中国鲎3个地理群体遗传多样性的等位酶分析

应用等位酶技术对漳浦、连江和温州3个地理群体的中国鲎遗传多态性进行分析.实验结果发现：6个酶系统的10个位点中有6个为多态性位点,共获得21个等位基因;大部分位点在3个群体中偏离Hardy-Weinberg平衡;在物种水平上,有效等位基因数为1.635,观察杂合度为0.456,期望杂合度为0.306,香侬指数为0.48...     

内毒素诱导急性肺损伤小鼠支气管肺泡灌洗液中谷氨酸含量变化的初步研究

目的 观察LPS诱导急性肺损伤时肺内是否存在谷氨酸（Glu）的释放.方法 腹腔注射内毒素制备小鼠急性肺损伤模型,于6h后采用生理盐水行支气管肺泡灌洗,用高效液相色谱法测量灌洗液中氨基酸的浓度.结果 与生理盐水对照组相比,LPS处理组支气管肺泡灌洗液中Glu的浓度增高（P〈0.01）;苏氨酸、蛋氨酸及精氨酸的浓度降低（P〈0.05）,其它氨基酸浓度无显著性变化.结论 在LPS诱导的肺损伤过程中肺组织中部分氨基酸代谢发生显著变化,肺内谷氨酸的释放增多,进一步提示Glu参与了内毒素诱导的肺损伤的病理生理过程.     

脂多糖对RAW264.7细胞IL-10分泌及mRNA表达的影响

目的探讨脂多糖（LPS）对RAW264．7细胞白细胞介素10（interleuldn-10，IL-10）分泌及mRNA表达的影响。方法采用体外培养巨噬细胞株RAW264．7细胞，实验分为正常对照组、LPS组。采用ELISA法、逆转录PCR（RT—PCR）技术检测IIJ-10分泌及mRNA表达的变化。结果LPS刺激RAW264．7细胞后IL-10的分泌及mRNA表达较对照组增加（P〈0．05），并具有时间依赖性。结论LPS可刺激RAW264．7细胞IIJ—10分泌及mRNA表达的增加。     

哺乳动物胸腺器官发育及调控

胸腺为T细胞的发育、分化成熟及功能的获得提供重要而复杂的微环境。在胸腺微环境的作用下,T细胞发育成具有自身免疫耐受及MHC限制性的成熟淋巴细胞。T细胞分化成熟过程需要胸腺细胞与起源于胚胎第3咽囊的胸腺上皮细胞(Thymic epithelial cells,TECs)的相互作用。对胸腺器官三维组织结构的建立、胸腺前体细胞的迁入及胸腺的发育等过程的认识,有助于我们对胸腺器官形成的理解,也为胸腺发育缺陷相关疾病的预防及治疗提供重要依据。     

红细胞CR1数量表达和基因多态性的研究

红细胞补体受体I（CR1）是红细胞重要的免疫物质基础,红细胞的一个功能是通过CR1促进免疫复合物由循环中完全清除.红细胞免疫黏附能力与CR1数量表达有关,CR1的基因突变影响数量表达.许多疾病如系统性红斑狼疮（SLE）、慢性肝炎及肿瘤中红细胞CR1水平下降,与CR1分子的数量及基因多态性密切相关.