环糊精水解酶cds1-3底物通道氨基酸的定点突变研究

本研究对具有大分子水解能力的环糊精水解酶cds1-3的蛋白结构进行分析,选取底物通道相关氨基酸进行定点突变。通过比较突变酶和野生酶的功能差异,定位决定cds1-3特殊功能的氨基酸。采用sybyl 1.2进行蛋白质底物结合分析,选取和多聚体形成、底物结合以及底物通道相关的氨基酸Glu66、Pro48、Phe289为突变位点,反向PCR构建pSE380/E66G、pSE380/P48H、pSE380/F289A表达质粒并进行表达,获得酶活突变体并与原始酶进行底物特异性比较分析。其结果显示,突变酶E66G降解大分子底物木薯淀粉和支链淀粉的相对酶活力分别提高26.96%和23.15%,而对小分子底物普鲁兰糖的水解能力下降13.14%。因此,cds1-3是一个能水解大分子底物的特殊环糊精水解酶,氨基酸Glu66是cds1-3水解大分子支链淀粉的关键氨基酸之一。     

脱毛碱性蛋白酶(DHAP)的饱和突变

本实验在同源建模和氨基酸序列比对的基础上, 选取脱毛碱性蛋白酶（DHAP）8个氨基酸位点进行饱和突变. 通过牛奶平板和96孔板发酵筛选, 获得了4个催化特性改良的突变体, 测序鉴定为D248F, D248S, M233L和W214K. 利用酪蛋白和合成肽(AAPL pN)作为底物, 对这些突变体进行了评价, 结果表明D248F、D248S、W214K在常温(28℃)下的酪蛋白水解活性提高; M233L在常温、高温(50℃)的酶活以及热稳定性都有增加. 同时, M233L和W214K在25℃和50℃水解AAPL pN的酶活也分别得到了不同程度的提高.     

鸡StAR基因非同义单核苷酸多态性的生物信息学分析

以鸡StAR基因为研究对象,在分子水平上探究StAR编码区功能性位点。利用SIFT,PolyPhen-2,PANTHER和PROVEAN等4种方法预测对nsSNPs进行分析预测有害位点,使用SWISS-MODEL, Consurf server,Pymol,I-Mutant 3.0等软件对有害nsSNPs位点进行蛋白质的空间结构、氨基酸间氢键的改变及蛋白稳定性等相关分析。结果表明:从StAR基因的nsSNPs位点筛选出来6个主要有害突变(V125G,M144R,N148T,T204P,C224W和L247Q)。其中,M144R,N148T和T204P这3个位点氢键数目和空间结构发生变化,M144R,N148T,C224W和L247Q这4个位点降低了StAR蛋白质的稳定性,且M144R,N148T,T204P,C224W和L247Q均为高保守性位点。预测M144R,N148T,T204P,C224W和L247Q这5个位点可能为鸡StAR基因的潜在功能性位点。     

采用易错PCR对粘质沙雷氏菌几丁质酶C进行定向进化

以重组E.coliBL21(DE3)pLysS/pET22b-Chi C为亲本,采用易错聚合酶链反应(PCR)技术,对粘质沙雷氏菌几丁质酶C基因(Chi C)进行定向进化研究.经过两轮易错PCR后,建立突变体文库,进行平板初筛、包涵体复性及酶活检测复筛,获得一酶活较高的突变酶(Mut-Chi C),其催化活性为亲本重组酶的1.9倍,比活力为出发菌酶活的3.3倍.对突变酶的酶学性质进行初步研究,其最适pH值为5.0,最适温度为60℃,而出发菌该酶的最适温度为40℃.进化酶基因经DNA测序并通过软件与亲本型酶基因进行分析比对,表明突变酶Mut-Chi C基因发生点突变,使4处氨基酸被取代,且均为有义突变.     

食物对湖北钉螺(Oncomelania hupensis)发育繁殖的影响

用浮游植物(A)、鲫鱼(B)、河蚌(C)、蚯蚓(D)及以浮游植物与3种动物分别混合组成(E、F、G)的7种饲料喂养钉螺,观察其幼螺成活、生长及雌螺产卵量.结果表明,饲料G喂养的钉螺幼螺成活率(43%)明显高于其他饲料(0~33.3%,),B和C喂养钉螺,其幼螺在一个月内全部死亡;在25℃的条件下,饲料A和G喂养的幼螺发育最快,105d其体长分别为6.89mm和6.81mm,且显著长于(P<0.05)饲料D、E、F喂养的钉螺(其体长分别为3.05mm、4.51mm、5.11mm).在25℃的温度条件下饲料A饲养的钉螺产卵时间长、产卵量高(13.9%),与混合型饲料G喂养的钉螺产卵量(14.1%)相当,而明显高于(P<0.05)饲料D、E、F喂养的钉螺(分别为2.9%、10.1%、11.0%);动物型饲料B和C产卵时间短、产卵量最低(不到2%).因此,植物饲料A和混合饲料G适宜于喂养钉螺.     

H-蛋白中Asp-68和Tyr-70定向突变对甘氨酸裂解酶系整体酶活的调控

还原甘氨酸途径被认为是最有前景的C1（one carbon）合成途径,其核心酶系是甘氨酸裂解酶系。在前期研究中,我们在甘氨酸裂解酶系H-蛋白“解开自保护”过程的研究中初步锁定了H-蛋白空腔内的潜在关键氨基酸残基为Ser-67、Asp-68和Tyr-70,并且证明Ser-67位点对甘氨酸酶系的整体酶活有重要影响。本文对H-蛋白的Asp-68和Tyr-70位点进行了侧链带正电突变（H-D68K、H-D68H、H-D68R和H-Y70K、H-Y70H、H-Y70R突变体）,以及侧链非极性突变（H-D68G、H-D68V、H-D68M、H-D68L和H-Y70G、H-Y70V、H-Y70M、H-Y70L突变体）,并测定了各突变体在甘氨酸裂解方向上的酶活。结果发现,Asp-68位带正电突变倾向降低甘氨酸酶系的整体酶活,Asp-68位非极性突变、Tyr-70位带正电突变及非极性突变在总体上倾向于维持或提升整体酶活。其中,相对野生型H-蛋白,H-D68R突变体的酶活下降了90.2%,H-Y70R、H-D68G和H-Y70L突变体的酶活分别提高了75.6%、53.6%和146%。硫辛酰胺与H-蛋白空腔内的氨基酸相互作用的分析结果表明,甘氨酸裂解酶系整体酶活的变化是由于H-蛋白的68和70位残基的突变阻碍或促进硫辛酰胺的释放。     

利用DNA shuffling构建部分解除对氟苯丙氨酸反馈抑制的aroG

3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶(DAHPs)是芳香族氨基酸生物合成途径中关键的限速酶,在大肠杆菌中有3种同工酶,分别由aroG(Phe)、aroH(Trp)和aroF(Tyr)基因编码,这3种酶分别受苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸反馈抑制.为得到解除苯丙氨酸反馈抑制的突变AroG,以Escherichia coli野生型aroG、aroH和aroF基因为亲本,通过DNAshuffling技术对aroG基因进行改组,将获得的改组aroG与载体pET30a连接得到改组文库,转化到E.coliBL21(DE3)中,在含有Phe类似物对氟苯丙氨酸(p-FP)的培养基上筛选转化子,获得2个能耐受10 mg/mLp-FP的克隆.这2个克隆的测序结果显示,其中一个发生了3个点突变:C129T,A531G,A1032G;另一个发生了3个点突变T77A,G883A,A1032G和4个碱基的插入突变即922位插入A,943位插入CG,971位插入A.2个改组AroG的最适pH和最适温度与野生型AroG相比无明显变化.     

大肠杆菌嗜盐α-淀粉酶基因的分子改造及其酶学特性

【目的】对大肠杆菌Escherichia coli嗜盐α-淀粉酶基因进行改造,并探索嗜盐α-淀粉酶的嗜盐特性。【方法】从非嗜盐的大肠杆菌JM109中克隆到一个嗜盐α-淀粉酶基因k6并进行重组表达。通过同源建模,确定Na+结合位点上的氨基酸残基,并对相应位点进行定点突变。最后对突变酶的酶学性质进行研究。【结果】相对于野生酶,突变酶更加嗜盐,其最适NaCl浓度由2mol/L增加到3mol/L,最适pH值为7,最适温度为50℃,酶活力为4 831U/mg,提高近4倍。经HPLC检测,突变酶与2%(W/V)可溶性淀粉反应后的产物为葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖的混合物。【结论】嗜盐α-淀粉酶基因k6的嗜盐特性与Na+结合位点具有直接联系。     

磨难砺炼心智 态度催生成功

如果令从A到Z这26个英文字母,分别等于从1％到26％,那么我们就可以得出以下有趣的结论: HARD WORK(努力工作): H A R D W O R K=8％ 1％ 18％ 4％ 23％ 15％ 18％ 11％=98％KNOWLEDGE(知识): K N O W L E D G E=11％ 14％ 15％ 23％ 12％ 5％ 4％ 7％ 5％=96％LOVE(爱情): L O V E=12％ 15％ 22％ 5％=54％LUCK(好运): L U C K=12％ 21％ 3％ 11％=47％这些我们通常非常看重的东西都不是最完美的,那么,究竟什么使生活变得圆满呢?     

新疆维吾尔族宫颈鳞癌组织人乳头瘤病毒16型E6、E7基因变异分析

为探讨新疆维吾尔族宫颈鳞癌组织人乳头瘤病毒16型(HPV16)E6、E7基因序列的变异分布情况。采用43例维吾尔族妇女宫颈鳞癌组织中提取DNA作为模板,PCR扩增E6和E7全长基因,PCR产物直接测序。以欧洲标准株为原型,进行序列分析,并对HPV16 E6、E7进行进化树分析。结果显示,测序结果分析共发现6个突变位点(4个错义突变,2个无义突变),其中有34例E6基因350位核苷酸发生突变(T350G),突变频率为79.1%,对应氨基酸改变为Leucine→valine(L83V);6例E6基因295位核苷酸发生突变(T295G),突变频率为(14.0%),相应氨基酸改变为aspartic→glutamic(D64E),值得注意的是,这6例HPV16 E6基因T295G突变均伴随着E6基因T350G突变。E7基因仅在1例样本647位点发生常见的核苷酸A→G突变(A647G),且伴随着E6基因178位点T→G突变(T178G)。进化树分析表明,8例为HPV16欧洲型(Ep),34例为欧洲变异型(E),仅1例为亚洲型(As),没有发现非洲株(Af)和亚洲美洲株(AA)。由此可知:(1)新疆维吾尔族妇女主要以感染HPV16欧洲型(E)为主;(2)E6基因T295G-T350G共突变为特点的HPV16病毒,可能做为新疆维吾尔族妇女特有的HPV16欧洲型新疆株还需要进一步确认。     

中国的甘草属新分类群

本文发表国产甘草属6新种:紫花甘草(Glycyrrhiza purpureiflora X.Y.Li),垂花甘草(Gnutantiflora X.Y.Li)平卧甘草(G.prostraca X.Y.Li ex D.C.F.),疏花甘草(G.laxiflora X.Y.Li ex D.C.F.),无腺毛甘草(G.eglandulosa X.Y.Li),阿拉尔甘草(G.alalensis X.Y.Li).     

武陵山区湖南新纪录植物（Ⅱ）

报道了湖南植物分布新纪录种17个,变种3个,隶属11科,16属,它们是兴山唐松草（Thalictrum xingshanicum G. F. Tao）、鹤峰铁线莲（Clematis armandii var. hefengensis (G. F. Tao) W. T.Wang）、珠芽蓼（Polygonum viviparum Linn.）、湖北凤仙花（Impatiens pritzelii Hook. f.）、东川凤仙花（I. blinii Lévl. Cat.）、野梦花（Daphne tangutica var. wilsonii (Rehd.) H. F. Zhou ex C. Y. Chang）、纤细荛花（Wikstroemia gracilis Hemsl.）、小花栝楼（Trichosanthes parviflora C. Y. Wu ex S. K. Chen）、野草莓（Fragaria vesca Linn.）、五叶白叶莓（Rubus innominatu var. quinatus Bailey）、竹叶鸡爪茶（R. bambusarum）、峨嵋蔷薇（Rosa omeiensis Rolfe）、皱叶委陵菜（Potentilla ancistrifolia Bunge）、狼牙委陵菜（P. cryptotaeniae Maxim.）、文县黄蓍（Astragalus wenxianensis Y. C. Ho）、黔蚊母树（Distylium tsiangii Chun ex Walker）、羽脉野扇花（Sarcococca hookeriana Baill.）、峨嵋鹅耳枥（Carpinus omeiensis Hu & D. Fang）、曲脉卫矛（Euonymus venosus Hemsl.）、小果卫矛（E. microcarpus (Oliv.) Sprague）,纠正了链荚豆（Alysicarpus vaginalis (Linn.) DC.）的区系记录错误.     

人工脱色过氧化物酶催化降解苋菜红活性研究

以肌红蛋白(Mb)为骨架构建并纯化了三突变体蛋白F43Y/F138W/P88W Mb,双突变体蛋白F43Y/F138W Mb及单突变体蛋白 F43Y Mb,并对三个突变体蛋白的苋菜红(amaranth)脱色降解活性进行了研究。催化活性及酶动力学研究结果显示,相比于F43Y/F138W Mb和F43Y Mb,三突变体F43Y/F138W/P88W Mb的苋菜红催化效率最高,这表明色氨酸对人工脱色过氧化物酶的活性起了重要作用。该研究不仅为今后的血红素蛋白设计提供了理论依据,同时也表明人工酶在染料废水处理方面具有潜在的应用价值。     

不同诱导条件对树鼩骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响

目的 探讨不同诱导条件对树鼩骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）体外向成骨细胞分化的影响。方法 取 P3代树鼩骨髓间充质干细胞分成7组进行诱导。A组：高糖DMEM+1μmol/L地塞米松+100μmol/L维生素C+10 mmol/Lβ-磷酸甘油钠;B组：高糖 DMEM+50 ng/mL BMP-2;C组：高糖 DMEM+80 ng/mL BMP-2;D组：高糖DMEM+50μmol/L维生素C+10 mmol/Lβ-磷酸甘油钠+20ng/m L BMP-2;E组：高糖 DMEM+1μmol/L地塞米松 +100μmol/L维生素C+20 mmol/Lβ-磷酸甘油钠;F组：高糖DMEM+100μmol/L地塞米松+100μmol/L维生素 C+10 mmol/Lβ-磷酸甘油钠;G组：DMEM/F12+0.1μmol/L地塞米松 +50μmol/L维生素C+10 mmol/Lβ-磷酸甘油钠。诱导18 d后进行碱性磷酸酶和茜素红染色鉴定其诱导分化情况。结果 每一组碱性磷酸酶染色呈不同程度的阳性,茜素红染色可在A、B、C、D和E组观察到明显矿化结节。结论 A组、B组、C组、D组和 E组可以诱导树鼩BM-MSCs向成骨细胞分化,其中以A组和B组效果最为突出。     

湘桂粤地区苦苣苔科植物省级分布8新记录种

报道了湘桂粤地区8种苦苣苔科植物的省级分布新记录。包括:湖南省级分布新记录的皱边马铃苣苔Oreocharis crispate W. H. ChenY. M. Shui、革叶石山苣苔Petrocodon coriaceifolius (Y. G. Wei) Y. G. WeiMich.M?ller;广东省级分布新记录的多花石山苣苔Pet. multiflorus Fang WenY. S. Jiang、弯果奇柱苣苔Deinostigma cyrtocarpa (D.FangL.Zeng) Mich.M?llerH.J. Atkins;广西省级分布新记录的粉花半蒴苣苔Hemiboea roseoalba S.B. Zhou,Xin HongF. Wen、江华小花苣苔Primulina jianghuaensis K.M. LiuX.Z.Cai、封开报春苣苔P. fengkaiensis Z.L. NingM. Kang、密花石山苣苔Petrocodon confertiflorus H.Q. LiY.Q. Wang,并提供了这些省级分布新记录种的标本引证和地理分布信息。     

南海海洋真菌2516号中的环肽成分

对中国南海海洋真菌 2 5 16号的代谢产物进行研究 ,发现该真菌能产生丰富的环肽化合物。从培养液中已分离得到 7个环肽化合物 ,其中 3个为新化合物 ,根据NMR ,2DNMR ,FABMS等光谱数据确定了新化合物的结构 ,分别是环 (异亮 -亮 -缬 -缬 )四肽、环 (异亮 -亮 -亮 -缬 )四肽和环 (异亮 -缬 -缬 -缬 )四肽。另 4个化合物为环二肽。     

人乳头瘤病毒HPV16E6的表达促进角质生成细胞凋亡的发生

为探讨HPV16早期基因E6的表达对角质生成细胞NIKS凋亡表型的影响及可能的机制,经培养稳定表达HPV16E6的角质生成细胞NIKS;使用不同的DNA损伤剂处理转染后细胞,流式细胞术检测细胞凋亡情况;建立表达HPV16E6突变体Y54D及F2V的p53降解缺陷型NIKS细胞系并用DNA损伤剂处理,流式细胞术检测凋亡情况.研究显示,流式细胞术结果显示稳定表达E6的细胞系在足叶乙甙、丝裂霉素及紫衫醇处理后发生明显的细胞凋亡;表达Y54D或F2V的NIKS细胞经DNA损伤剂处理后凋亡明显低于正常E6表达细胞.研究表明,人乳头瘤病毒E6的表达能够促进角质生成细胞凋亡的发生,这种促凋亡作用与细胞内p53的表达相关.     

Electrostatic effect on electron transfer between cytochrome b5 and cytochrome c

The binding and electron transfer between wild type, E44A, E56A, E44/56A, E44/48/56A/D60Aand F35Y variants of cytochrome b5 and cytochrome c were studied. When mixed with cytochrome c, the cytochrome b5E44/48/56A/D60A did not show the typical UV-vis difference spectrum of absorption, indicating that the alteration ofthe surface electrostatic potential obviously influenced the spectrum. The electron transfer rates of wild type cytochromeb5, its variants and cytochrome e at different temperature and ionic strength exhibited an order of F35Y > wild type >E56A > E44A > E44/48/56A/D60A. The enthalpy and entropy of the reaction did not change obviously, suggestingthat the mutation did not significantly disturb the electron transfer conformation. The investigation of electron transfer rateconstants at different ionic strength demonstrated that electrostatic interaction obviously affected the electron transfer pro-cess. The significant difference of Cyt b5 F35Y and E44/48/56A/D60A from the wild type protein further confirmed thegreat importance of the electrostatic interaction in the protein electron transfer.     

Electrostatic effect on electron transfer between cytochrome b5 and cytochrome c

The binding and electron transfer between wild type, E44A, E56A, E44/56A, E44/48/56A/D60A and F35Y variants of cytochrome b5 and cytochrome c were studied. When mixed with cytochrome c, the cytochrome b, E44/48/56A/D60A did not show the typical UV-vis difference spectrum of absorption, indicating that the alteration of the surface electrostatic potential obviously influenced the spectrum. The electron transfer rates of wild type cytochrome bj, its variants and cytochrome c at different temperature and ionic strength exhibited an order of F35Y > wild type > E56A > E44A > E44/48/56A/D60A. The enthalpy and entropy of the reaction did not change obviously, suggesting that the mutation did not significantly disturb the electron transfer conformation. The investigation of electron transfer rate constants at different ionic strength demonstrated that electrostatic interaction obviously affected the electron transfer process. The significant difference of Cyt b, F35Y and E44/48/56A/D60A from the wild type protein further confirmed the great importance of the electrostatic interaction in the protein electron transfer.     

Roles of Phe58 residue in stabilizing structure of cytochrome b5

To understand effect of (-stacking interactions between the side chain of aromatic amino acids and the porphyrin ring on structures and properties in cytochrome b5 (cyt b5), the Phe58 residue was mutated to tyrosine and tryptophan, respectively by site-directed mutagenesis. The denaturation of cyt b5 F58W and F58Y toward guanidine hydrochloride was examined by UV-visible and fluorescence spectroscopy. The kinetics of heme transfer reactions between apo-myoglobin and the mutants were studied. The results indicated that the mutation of F58 residue for Y58 or W58 reduced the interaction between of peptide and the heme group, resulting in decrease of the Tm and Cm values of the proteins, increase of the heme transfer reaction rate, and shifts of the redox potential.