枯草芽孢杆菌突变株IA857高效转化方法的研究

【目的】研究比较枯草芽孢杆菌突变株IA857高效转化的最优方法。【方法】以质粒pHCMC04(大小为8089bp)转化突变型枯草芽孢杆菌IA857,分别用电转化法、原生质体法、电击法诱导的原生质体法、Spizizen低盐环境感受态转化法(简称S法)、低盐环境形成饥饿感受态法及其改良方案在其它突变菌株的试验方法(简称C法)进行实验,通过比较优化得出最优转化方法。【结果】采用S法转化枯草芽孢杆菌突变株IA857,质粒加入量为70ng时,转化后直接摇床培养1h转化率最高达到1.2×104 CFU/μg DNA,可以满足枯草芽孢杆菌高效转化的要求。【结论】得出了枯草芽孢杆菌突变株IA857最优转化方法并提出转化枯草芽孢杆菌的基本框架。     

大肠杆菌嗜盐α-淀粉酶基因的分子改造及其酶学特性

【目的】对大肠杆菌Escherichia coli嗜盐α-淀粉酶基因进行改造,并探索嗜盐α-淀粉酶的嗜盐特性。【方法】从非嗜盐的大肠杆菌JM109中克隆到一个嗜盐α-淀粉酶基因k6并进行重组表达。通过同源建模,确定Na+结合位点上的氨基酸残基,并对相应位点进行定点突变。最后对突变酶的酶学性质进行研究。【结果】相对于野生酶,突变酶更加嗜盐,其最适NaCl浓度由2mol/L增加到3mol/L,最适pH值为7,最适温度为50℃,酶活力为4 831U/mg,提高近4倍。经HPLC检测,突变酶与2%(W/V)可溶性淀粉反应后的产物为葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖的混合物。【结论】嗜盐α-淀粉酶基因k6的嗜盐特性与Na+结合位点具有直接联系。     

人工构建微生物组对制革废水的氨氮去除及微生物组的对比变化分析

为探究复合人工微生物组对制革废水处理体系中微生物群落的影响,在传统的厌氧/好氧(A/O)污水处理工艺处理制革废水的基础上,投加微生物复合菌形成人工微生物组。利用复合人工微生物组强化废水处理,应用高通量测序技术测定各样品中的细菌16S rRNA V3-V4变异区序列,并对测序数据进行生物信息学分析、Alpha多样性分析以及物种组成分析。结果表明,投加微生物组后,化学需氧量(COD)和氨氮的处理效果得到提升,COD的去除率约为82.60%,氨氮的去除率约为99.47%。高通量测序结果表明,人工投加微生物组使得活性污泥中微生物群落丰度以及多样性提高,污染物降解功能菌占比有所提升,陶厄氏菌属(Thauera)成为其最主要的优势菌属。复合人工微生物组的投加对强化制革废水处理系统有一定潜力。     

环糊精水解酶cds1-3底物通道氨基酸的定点突变研究

本研究对具有大分子水解能力的环糊精水解酶cds1-3的蛋白结构进行分析,选取底物通道相关氨基酸进行定点突变。通过比较突变酶和野生酶的功能差异,定位决定cds1-3特殊功能的氨基酸。采用sybyl 1.2进行蛋白质底物结合分析,选取和多聚体形成、底物结合以及底物通道相关的氨基酸Glu66、Pro48、Phe289为突变位点,反向PCR构建pSE380/E66G、pSE380/P48H、pSE380/F289A表达质粒并进行表达,获得酶活突变体并与原始酶进行底物特异性比较分析。其结果显示,突变酶E66G降解大分子底物木薯淀粉和支链淀粉的相对酶活力分别提高26.96%和23.15%,而对小分子底物普鲁兰糖的水解能力下降13.14%。因此,cds1-3是一个能水解大分子底物的特殊环糊精水解酶,氨基酸Glu66是cds1-3水解大分子支链淀粉的关键氨基酸之一。     

麦芽糖淀粉酶CDS 1-3在淀粉糖化过程中的作用分析

为探究多糖相互作用对淀粉糖化速率的影响，本研究使用较传统麦芽糖淀粉酶更具支链淀粉水解能力的麦芽糖淀粉酶CDS 1-3，将其与α-淀粉酶及糖化酶协同进行淀粉糖化，并对糖化液进行还原糖测定以及高效液相色谱分析。结果表明：反应到30 min时，CDS 1-3作用效果最明显，相比于Control组，CDS 1-3组糖化液的葡萄糖当量(Dextrose Equivalent,DE)值提高了4.51%。随着反应的进行，DE值提高速率降低。反应到60 min时，DE值提高了1.17%；反应到90 min时，DE值提高了2.12%。高效液相色谱结果显示，在整个反应过程中，CDS 1-3组葡萄糖和麦芽糖的产量始终高于Control组，说明CDS 1-3可有效加快木薯淀粉糖化速率，可应用于淀粉工业中。