金属卟啉重组蛋白的光活性与光稳定性研究

本研究以突变体肌红蛋白(myoglobin,Mb)F43H/H64A Mb为骨架,通过原卟啉锌(zinc-protoporphyrin,ZnPP)、原卟啉钴(cobalt-protoporphyrin,CoPP)替代蛋白天然辅基血红素(heme)的方式制备了两个新的重组肌红蛋白(reconstituted myoglobin,rMb),命名为ZnPP-F43H/H64A Mb和CoPP-F43H/H64AMb,并对其光稳定性和光催化降解染料活性进行了研究。结果显示,ZnPP-F43H/H64A Mb具备更好的光催化降解亚甲基蓝的能力,ZnPP-F43H/H64A具有光不稳性。     

人类隐花色素蛋白(Homosapiens Cryptochrome,HsCRY)昆虫表达系统的建立及其与FAD结合状态的NMR研究

隐花色素(Cryptochrome,CRY)蛋白是一种对蓝光敏感的蛋白,它与辅因子黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide,FAD)形成的自由基电子对在调节生物钟及感应磁场中发挥重要的作用,但目前对人类CRY(Homo sapiens CRY,HsCRY)蛋白的结构功能研究尚未见报道.以HeLa细胞RNA为模板,通过RT-PCR方法扩增得到全长1 761bp的HsCRY1基因,把其克隆到HTA杆状病毒转座载体上,经菌落PCR和测序鉴定出阳性重组转座载体HTA-HsCRY1,转化含有病毒杆粒bacmid的DH10Bac感受态细胞,蓝白斑筛选和PCR检测获得重组质粒BacmidHsCRY1,转染昆虫Spodoptera frugiperda(sf9)细胞,产生的病毒感染昆虫细胞获得分子量为66kDa的目的蛋白HsCRY1.蛋白经Western Blot和SDS-PAGE鉴定,并利用镍亲和层析柱纯化,结果100mmol/L及200mmol/L咪唑均可洗脱下较纯的目标蛋白.同源蛋白的多序列比对表明HsCRY1的W320,W374以及W397可能组成传递电子的色氨酸三联体,对3个突变蛋白W320F,W374F以及W397F进行表达纯化.31P核磁共振检测蛋白与辅因子FAD的结合状态,发现与自由态FAD的磷谱相比,野生型HsCRY1及突变体3(W397F)结合的FAD的化学位移发生了改变,而HsCRY1突变体1(W320F)以及突变体2(W374F)不结合FAD.本实验成功构建了表达HsCRY1蛋白及其色氨酸突变蛋白的杆状病毒-昆虫表达系统,并通过核磁共振的方法发现色氨酸突变位点会对蛋白与FAD的结合产生影响.     

多电极DBD放电反应器对苋菜红脱色效果的研究

研究了不同因素对一种介质阻挡放电反应器静态电容的影响.使用该反应器对苋菜红染料废水进行了脱色研究,研究结果表明,此反应器对苋菜红有明显的脱色效果,120 min内苋菜红脱色率可达96.1%.以一定时段内苋菜红的脱色效率研究了反应器静态电容与电源电容之间的匹配对应关系,得出最佳匹配比约为1∶20.     

点突变对枯草芽孢杆菌甘露聚糖酶结构和功能的影响

目的研究定点突变对枯草芽孢杆菌B23所产生的甘露聚糖酶活性及蛋白结构的影响,深入了解该酶结构与功能间的关系,为其分子改造提供理论依据。方法通过与同源酶蛋白序列的比较和分析,在同源性较高的色氨酸第196、198和199位点上,天冬氨酸第91位点上和谷氨酸第191位点上通过特异引物引入突变,PCR扩增获得甘露聚糖酶的突变基因,B.subtilis WB800为表达载体,纯化相应的诱变蛋白,测定其酶活性及荧光光谱变化。结果三个色氨酸突变体蛋白[Man(W196H)、Man(W198H)、Man(W199H)和Man(W199A)]核的活性均有所下降,其中Man(W199H)突变体酶活力几乎丧失,为突变前的4%。Man(D91N)和Man(E191Q)的酶活力也分别降至突变前的10%和12%。结论W199、D91和E191是酶活性的必需基团,对其造成的突变对甘露聚糖酶的结构和活性有显著影响。     

集胞藻PCC6803基因slr2049定点突变及其体内重组功能研究

在Synechocystis sp.PCC 6803中找到与cpeS具有高度同源性的基因slr2049.采用PCR从Synechocystis sp.PCC 6803DNA中扩增出cpcB,slr2049,ho1,pcyA4个基因;定点突变试剂盒构建8个突变体slr2049(H21S)、slr2049(L23S)、slr2049(A24S)、slr2049(F25S)、slr2049(W72L)、slr2049(G84S)、slr2049(R107S)和slr2049(Y124S);将它们与表达载体pCDFDuet-1和pET-23a(+)相连构建pCDF-cpcB-slr2049野生型和pCDF-cpcB-slr2049突变体以及pET-ho1-pcyA,进行高效表达,用亲和层析柱纯化,产物用SDS-PAGE和光谱检测.研究表明:突变体slr2049(H21S)、slr2049(L23S)、slr2049(F25S)、slr2049(W72L)、slr2049(G84S)、slr2049(Y124S)与野生型slr2049催化获得的重组藻蓝蛋白β亚基具有与天然藻蓝蛋白β亚基相似的光谱特性,其他2个突变体slr2049(A24S)和slr2049(R107S)催化的产物则没有光谱特性.由此推测,第24位丙氨酸和第107位精氨酸可能是slr2049酶活性的必需氨基酸,其所处位置是slr2049的活性位点.     

静电作用对细胞色素b5与细胞色素c之间电子传递的影响

研究了细胞色素b5 E44A,E56A,E44/56A,E44/48/56A/D60A及F35Y突变体蛋白与细胞色素c的结合和电子传递反应.细胞色素b5 E44/48/56A/D60A与细胞色素c结合反应没有显示出特征的紫外-可见差谱峰,这表明静电作用的改变对特征峰的形成产生了明显影响.对野生型细胞色素b5及其突变体蛋白与细胞色素c在不同温度和离子强度下电子传递速率的研究中发现,其电子传递速率的递变规律为:F35Y＞野生型＞E56A＞E44A＞E44/56A＞E44/48/56A/D60A.反应的活化熵和活化焓均无明显变化,表明这些残基突变没有给两蛋白间电子传递的结构造成大的改变.通过对电子传递速率随离子强度的变化趋势的研究表明,静电作用明显影响了电子传递过程.突变体蛋白F35Y以及E44/48/56A/D60A和野生型蛋白反应结果的显著差别,进一步确证了静电作用在电子传递过程中的重要作用.     

人尿激酶原纤原受体识别区嵌合突变体的构建与表达

采用同源转座方法,构建了在尿激酶原K区138～139位点插入了赖氨酸甘氨酸天冬氨酸(KGD)序列的2种尿激酶原嵌合体基因(proUK-KGDW, proUK-KGDS),并以昆虫细胞SF9为宿主获得了高效表达,表达量在33.34 μkat·mL-1, 细胞密度为106·mL-1,表达高峰期表达产物占细胞总蛋白的15%以上.表达产物展示出较高的纤溶活性,并具有良好的人尿激酶原免疫原性,同时,经SDS-PAGE试验检测,昆虫细胞分泌的突变体相对分子质量符合理论预期,为5.4×104,绝大多数为单链态形式.经过离子交换、分子筛层析及超滤浓缩等步骤对突变体蛋白进行了初步纯化,光浊度法试验表明含有KGDW序列的尿激酶原突变体具有较强的血小板聚集抑制活性,而含有KGDS序列的突变体几乎不具有任何活性,表明羧基端边侧序列对KGD展示正常的受体结合活性影响较大.溶解圈试验表明2种突变体均保留了较高的纤溶活性,说明插入序列不影响尿激酶原的酶切活性.     

葡激酶突变体Y1-Sak的体外变复性研究

具有低免疫原性的双功能葡激酶突变体Y1-Sak(△15,S16K,K74A,E75A,R77A,K109R,F111D)在大肠杆菌中的表达产物为包涵体,必须进行体外变复性才能得到活性.详细研究了复性方式、pH、温度、复性的初始蛋白浓度和添加L-精氨酸对Y1-Sak的体外变复性的影响,发现复性温度和添加的L-精氨酸对Y1-Sak的复性有重要的影响.经过工艺优化后,Y1-Sak的纯化活性回收率达到40%左右,蛋白比活性由20 kU/mg提高到53 kU/mg.用动态光散射分析发现,工艺优化后复性的高比活性Y1-Sak的水合动力学半径与野生型葡激酶相近,分子基本处于单体状态.     

脱毛碱性蛋白酶(DHAP)的饱和突变

本实验在同源建模和氨基酸序列比对的基础上, 选取脱毛碱性蛋白酶（DHAP）8个氨基酸位点进行饱和突变. 通过牛奶平板和96孔板发酵筛选, 获得了4个催化特性改良的突变体, 测序鉴定为D248F, D248S, M233L和W214K. 利用酪蛋白和合成肽(AAPL pN)作为底物, 对这些突变体进行了评价, 结果表明D248F、D248S、W214K在常温(28℃)下的酪蛋白水解活性提高; M233L在常温、高温(50℃)的酶活以及热稳定性都有增加. 同时, M233L和W214K在25℃和50℃水解AAPL pN的酶活也分别得到了不同程度的提高.     

多种肌红蛋白突变体与Cu(Ⅱ)相互作用机制光谱法研究

运用多种光谱法研究PCR定点突变获得的肌红蛋白突变体(D44K、D60K、K56D)与Cu(Ⅱ)的相互作用.结果表明:Cu(Ⅱ)对突变体的猝灭机理与野生型相同,均为静态猝灭,但结合常数、结合位点数、热力学常数、结合距离以及三维构象方面发生了一些变化.在相同温度下,蛋白与Cu(Ⅱ)的结合能力顺序为Mb(WT)相似文献   

Roles of Phe58 residue in stabilizing structure of cytochrome b5

To understand effect of (-stacking interactions between the side chain of aromatic amino acids and the porphyrin ring on structures and properties in cytochrome b5 (cyt b5), the Phe58 residue was mutated to tyrosine and tryptophan, respectively by site-directed mutagenesis. The denaturation of cyt b5 F58W and F58Y toward guanidine hydrochloride was examined by UV-visible and fluorescence spectroscopy. The kinetics of heme transfer reactions between apo-myoglobin and the mutants were studied. The results indicated that the mutation of F58 residue for Y58 or W58 reduced the interaction between of peptide and the heme group, resulting in decrease of the Tm and Cm values of the proteins, increase of the heme transfer reaction rate, and shifts of the redox potential.     

Study on the DME-cytochrome<Emphasis Type="Italic">b</Emphasis><Subscript>5</Subscript> and its mutants at site of F58

Phenylalanine-58 is one of the conservative residues in the hydrophobic pocket of Cyt bs, which forms aromatic stacking with the heme b. Previous study showed that both the stacking and the property of the aromatic residue affect hydrophobicity of the heme pocket, leading to change of protein‘s property. In order to further reveal the essence we esterify the heme propionate of Cyt bs, F58Y and F58W, and eliminate the hydrogen bond between heme propionate and Ser64 in examining the effect of hydrogen net on the π-π interaction. In this paper thermal denaturation of DME-Cyt b5 and its F58Y and F58W mutants has been studied by UV-visible and CD spectra. The heme transfer reactions between these proteins and apo-myoglobin have been studied as well. The results demonstrate that esterification did not destroy the aromatic stacking; however, it affects the stability of the proteins due to different volumes, hydropho-bicities and hydrogen bonds forming ability of these substituents.     

Roles of Phe58 residue in stabilizing structure of cytochrome b<Subscript>5</Subscript>

To understand effect of π-stacking interactions between the side chain of aromatic amino acids and the porphyrin ring on structures and properties in cytochrome b₅ (cyt b₅), the Phe58 residue was mutated to tyrosine and tryptophan, respectively by site-directed mutagenesis. The denaturation of cyt b₅ F58W and F58Y toward guanidine hydrochloride was examined by UV-visible and fluorescence spectroscopy. The kinetics of heme transfer reactions between apo-myoglobin and the mutants were studied. The results indicated that the mutation of F58 residue for Y58 or W58 reduced the interaction between of peptide and the heme group, resulting in decrease of the T _m and C _m values of the proteins, increase of the heme transfer reaction rate, and shifts of the redox potential.     

谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)海藻糖合成酶的定点突变及其酶学性质研究

以已知晶体结构的Pseudomonas mesoacidophila MX-45菌株海藻酮糖合成酶（MutB）的晶体结构为模板,在SWISS-MODEL模建立谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）海藻糖合成酶的立体结构,并对初始结构作能量优化,通过氨基酸序列比对,选择TreS-glu保守区内的氨基酸R245、D247、E289、F244和保守区外的氨基酸A288进行定点突变,并对突变酶F244C、F244L、F244W、F244Y、A288G、R245X、E289X、D247N、D247E进行纯化和酶学性质研究,比较突变子对酶活性和热稳定性的影响。结果表明,R245、E289突变为其它的19个氨基酸后酶活力全部丧失,D247E和D247N也丧失酶活,F244C、F244L、F244W、F244Y和A288G的比活力分别降低到TreS-glu的38%、24%、62%、64%和35%,A288突变成T288后没有酶活。与TreS-glu相比,F244C、F244W、A288G的Km值基本不变,F244L、F244Y对底物麦芽糖的亲和力降低,F244Y的最适反应温度和TreS-glu相同,均为27℃,而F244C、F244L、F244W和A288G的最适温度提高到32℃。与TreS-glu相比,突变酶的最适反应pH值均有所下降,其中F244C、F244Y和A288G的为7.5,比TreS-glu的8.0均下降了约0.5个单位,而F244L和F244W的为6.5,比TreS-glu的8.0均下降了近1.5个单位。与TreS-glu相比,突变酶的热稳定性均有不同程度提高,其中F244Y、F244W和A288G的Tm值比TreS-glu的提高约1℃,F244L提高约2℃,F244C提高了近4℃。     

肌红蛋白-壳聚糖-金胶纳米复合薄膜修饰电极的电化学性质

在pH=5.4的HAc-NaAc缓冲溶液中, 肌红蛋白-壳聚糖-金胶薄膜修饰电极在-0.20 V(vs. Ag/AgCl) 处有一对准可逆的氧化还原峰, 为Mb血红素辅基Fe(Ⅲ)/Fe（Ⅱ）电对的特征峰. 在壳聚糖 金胶纳米复合薄膜的微环境中， 肌红蛋白与玻碳电极之间的电子传递明显加快. 考察了扫速、 溶液pH值及支持电解质浓度等因素对肌红蛋白电子传递的影响. 紫 外光谱结果表明， 肌红蛋白在壳聚糖 金胶溶液中依然保持其原始构象， 该肌红蛋白-壳聚糖-金胶纳米复合薄膜修饰电极还可用于溶解氧的催化还原.     

蛋白质微秒级折叠过程的快速模拟

使用ff12SB力场和广义玻恩(GB Neck2)隐性水模型在GTX670 GPU上对4个蛋白质CLN025 (2ZEI)、MHA6(2I9M)、Trp Cage (1L2Y)、Villin (3TRW)的微秒级折叠过程进行了分子动力学模拟,2ZEI的折叠时间和均方根偏差为5.94 μs和0.897 ,2I9M的折叠时间和均方根偏差为0.191 μs和1.142 ,Villin的折叠时间和均方根偏差为4.23 μs和1.37 ,Trp Cage的折叠时间和均方根偏差为2.48 μs和0.63 。结果表明,蛋白质折叠模拟已经能够通过GPU计算在桌面计算机上实现。     

超高密度计算机硬盘系统磁记录材料的噪音和差错分析

为研究计算机硬盘的信号和噪音 ,建立了硬盘系统读写过程的微磁模拟模型。在写入过程中采用了模拟的三维薄膜磁头 ,在读出过程中用的是巨磁阻 (GMR)磁头。根据模拟的结果 ,分别计算出了 0 ,1信号读出电压的概率密度分布函数 ,得到了硬盘磁记录密度在 15 .5 Mb/mm2 ,31.0Mb/mm2 ,40 .3Mb/m m2 ,46 .5 Mb/mm2 几种不同情况下的数据差错率。结果表明在颗粒大小 a L=13.5 nm时 ,非 0的差错率在密度为 40 .3Mb/mm2时开始出现。本系统中 ,磁道宽 W约为比特长度 B的 5倍 ,当比特长度与颗粒大小之比 B/a L>4时 ,平均差错率很小 ;但当 B/a L<4时 ,平均差错率会急剧上升     

分子光谱的非正交变换因子分析

提出一种非正交变换因子分析法, 用于混合物光谱的解析及多组份混合物的同时测定根据其数学原理编制的计算机软件在 Ｐ Ｃ 机上顺利运行该法成功地用于四组份混合荧光光谱的解析, 以及多组份荧光物质的同时测定     

藻红蓝蛋白裂合酶F亚基中色氨酸残基的化学修饰

以N-溴代琥珀酰亚胺作为修饰剂,对藻红蓝蛋白裂合异构酶F亚基中的色氨酸(Trp)残基与酶活性的关系进行了研究.研究表明, PecF的Trp残基均位于分子内部,NBS的修饰导致了酶活性的显著降低,但并未完全失去活性.酶被修饰后的荧光和圆二色谱均发生了变化,为酶的结构和功能间关系研究提供了重要信息.