甘油脱水酶的理性设计: 基因杂合改善酶的性质

1,3-丙二醇是一种重要的化工原料, 越来越受到广泛的关注. 以弗氏柠檬酸菌和克雷伯氏菌的总DNA以及宏基因组为模板, 克隆并表达了3个不同来源的甘油脱水酶基因, 前两者均有活力, 而后者则没有活力. 为了改造甘油脱水酶使其更有利于工业化生产, 通过同源建模(homology modeling)构建了这3个甘油脱水酶的三维结构, 并利用一些生物信息学软件对这3个甘油脱水酶进行亚基之间的杂合改组(gene swapping)的理性设计, 根据设计结果对这3种不同来源的甘油脱水酶的大、中小亚基基因分别进行了克隆. 通过基因交换的方法对甘油脱水酶大、中小亚基进行了杂合, 得到6种异源亚基杂合酶. 部分杂合酶的酸碱稳定性、热稳定性及V_max得到了明显的改善, 同时杂合改组使本没有活力的来源于宏基因组的甘油脱水酶具有了活力而且杂合酶的热稳定性也得到了显著提高. 根据构建的三维结构分析了结构差异对酶学性质的影响.     

谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)海藻糖合成酶的定点突变及其酶学性质研究

以已知晶体结构的Pseudomonas mesoacidophila MX-45菌株海藻酮糖合成酶（MutB）的晶体结构为模板,在SWISS-MODEL模建立谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）海藻糖合成酶的立体结构,并对初始结构作能量优化,通过氨基酸序列比对,选择TreS-glu保守区内的氨基酸R245、D247、E289、F244和保守区外的氨基酸A288进行定点突变,并对突变酶F244C、F244L、F244W、F244Y、A288G、R245X、E289X、D247N、D247E进行纯化和酶学性质研究,比较突变子对酶活性和热稳定性的影响。结果表明,R245、E289突变为其它的19个氨基酸后酶活力全部丧失,D247E和D247N也丧失酶活,F244C、F244L、F244W、F244Y和A288G的比活力分别降低到TreS-glu的38%、24%、62%、64%和35%,A288突变成T288后没有酶活。与TreS-glu相比,F244C、F244W、A288G的Km值基本不变,F244L、F244Y对底物麦芽糖的亲和力降低,F244Y的最适反应温度和TreS-glu相同,均为27℃,而F244C、F244L、F244W和A288G的最适温度提高到32℃。与TreS-glu相比,突变酶的最适反应pH值均有所下降,其中F244C、F244Y和A288G的为7.5,比TreS-glu的8.0均下降了约0.5个单位,而F244L和F244W的为6.5,比TreS-glu的8.0均下降了近1.5个单位。与TreS-glu相比,突变酶的热稳定性均有不同程度提高,其中F244Y、F244W和A288G的Tm值比TreS-glu的提高约1℃,F244L提高约2℃,F244C提高了近4℃。