Survivin-siRNA真核重组质粒的构建及对前列腺癌DU145细胞增殖抑制作用

目的应用RNA干扰技术(RNAi),构建针对凋亡抑制因子survivin的siRNA,并检测其对DU145细胞增殖抑制的影响.方法构建重组质粒shRNA-sur1和shRNA-sur2并分别转染DU145细胞株,通过MTT法和流式细胞术观察其对细胞的增殖抑制作用及凋亡的影响.结果成功构建针对survivin干扰的两种真核表达质粒,转染72 h后,两个实验组细胞的生长速度分别是脂质体组的(37.2%±5.8%)(n=3)和(43.5%±7.2%)(n=3).流式细胞术发现:实验组细胞的G1期细胞比例明显高于对照组,而G2期和S期细胞比例减少,细胞出现凋亡,与脂质体组比较,两实验组细胞的凋亡率分别为(21.70%±6.45%),(14.835±5.65%).结论成功构建针对survivin siRNA的真核重组质粒,两种质粒体外均可抑制DU145增殖并诱导其凋亡,为survivin介导的肿瘤基因沉默提供良好的基础.     

硒蛋氨酸对人前列腺癌DU145细胞增殖与凋亡的影响

目的观察硒蛋氨酸(selenome-thionine)对DU145前列腺癌细胞增殖及凋亡的影响,并初步探讨其作用机制.方法采用MTT比色法观察1.25,2.50,5.00μmol.L-1硒蛋氨酸对DU145细胞增殖活力的抑制作用;吖啶橙染色观察硒蛋氨酸诱导细胞凋亡情况;流式细胞术分析细胞周期及凋亡,并计算细胞平均凋亡指数;免疫细胞化学技术观察细胞内激活的caspase3的表达情况.结果经1.25,2.50,5.00μmol.L-1硒蛋氨酸处理48 h后,DU145细胞生长抑制率分别为16.35%,38.10%和73.54%,3组间比较差异有显著性(P<0.01);随硒蛋氨酸浓度升高细胞生长抑制率增加,呈明显的剂量依赖性.吖啶橙荧光染色可见经1.25,2.50,5.00μmol.L-1硒蛋氨酸处理后的细胞呈明显凋亡形态,并随药物剂量增加凋亡细胞数增多;流式细胞术结果显示,经1.25,2.50,5.00μmol.L-1硒蛋氨酸处理48 h后,其细胞的凋亡率分别为5.34%,8.71%和13.6%,3组间比较差异有显著性(P<0.05),随硒蛋氨酸浓度升高细胞凋亡率升高,呈剂量依赖关系;免疫细胞化学染色结果显示,随着硒蛋氨酸剂量增加,细胞内激活的caspase3表达上调.结论硒蛋氨酸对DU145细胞具有明显的抑制作用,其机制可能与激活的caspase途径诱导细胞凋亡有关.     

羟基磷灰石纳米粒子运载Stat3 shRNA对鼠胶质瘤C6细胞的促凋亡效应

目的探讨羟基磷灰石纳米粒子运载Stat3 shRNA对鼠胶质瘤C6细胞的促凋亡作用,并探讨相关机制.方法羟基磷灰石纳米粒子包被的Stat3 shRNA转染到C6胶质瘤细胞内,MTT法检测细胞增殖情况,应用流式细胞术及吖啶橙染色观察细胞周期分布及凋亡情况,TUNEL染色观察细胞的凋亡及增殖情况.结果羟基磷灰石纳米粒子运载Stat3 shRNA转染C6细胞后,呈时间依赖性抑制C6细胞生长和增殖.通过流式细胞术检测证实:该质粒可使细胞阻滞在细胞周期的G0/G1期,细胞凋亡率明显增加(P<0.05),与对照组比较差异有统计学意义;吖啶橙及TUNEL染色发现其明显促进细胞凋亡(P<0.05),与对照组比较差异有统计学意义;结论羟基磷灰石纳米粒子运载Stat3 shRNA体外可明显抑制胶质瘤C6细胞增殖,并促进其凋亡,是治疗胶质瘤较理想的方法.     

过表达hsa-miR-145对人恶性多发性畸胎瘤细胞增殖凋亡的影响

通过构建hsa-miR-145的重组体pGenesil-1-miR-145,并瞬时转染到人恶性多发性畸胎瘤细胞(NTERA-2)后,利用qRT-PCR法检测hsa-miR-145,以及肿瘤发生相关基因OCT4,SOX2,c-Myc,KLF4,FSCN1在转录水平的表达差异;同时利用MTT法和流式细胞术Annexin V-APC/7-AAD双染法检测hsa-miR-145对NTERA-2细胞增殖的生物学效应和细胞凋亡的影响.结果表明:hsa-miR-145的高表达导致NTERA-2细胞增殖明显减弱,凋亡率增加;转染重组质粒hsa-miR-145后,OCT4,SOX2,c-Myc,FSCN1基因的表达量均有所降低,提示miR-145的过表达可能通过抑制靶基因的表达从而影响生殖肿瘤细胞的生物学功能.     

泛素连接酶Nedd4调控人前列腺癌细胞的增殖与凋亡

为了研究泛素连接酶Nedd4对肿瘤细胞增殖和凋亡的影响,利用小RNA干扰技术,通过慢病毒包装,侵染前列腺癌细胞DU145,达到下调Nedd4表达的目的.MTT检测表明,下调Nedd4表达可以抑制DU145细胞的增殖;DAPI染色发现,下调Nedd4表达的DU145细胞对星形孢菌素诱导的细胞凋亡更加敏感.这些结果都说明,下调Nedd4的表达不仅可以抑制DU145肿瘤细胞增殖,而且可以促进细胞凋亡.     

过表达has-miR-145对人恶性多发性畸胎瘤细胞增殖凋亡的影响

通过构建hsa-miR-145的重组体pGenesil-1-miR-145, 并瞬时转染到人恶性多发性畸胎瘤细胞(NTERA-2)后, 利用qRT-PCR法检测hsa-miR-145, 以及肿瘤发生相关基因OCT4, SOX2, c-Myc, KLF4, FSCN1在转录水平的表达差异;同时利用MTT法和流式细胞术Annexin V-APC/7-AAD双染法检测hsa-miR-145对NTERA-2细胞增殖的生物学效应和细胞凋亡的影响. 结果表明:hsa-miR-145的高表达导致NTERA2细胞增殖明显减弱, 凋亡率增加;转染重组质粒hsa-miR-145后, OCT4, SOX2, c-Myc, FSCN1基因的表达量均有所降低, 提示miR-145的过表达可能通过抑制靶基因的表达从而影响生殖肿瘤细胞的生物学功能.     

ERK_(1,2)抑制剂联合5-FU对B16细胞增殖和凋亡的影响

目的:观察ERK_(1,2)抑制剂联合5-Fu对B16细胞增殖和凋亡的影响,并探讨作用机制.方法:用MTT法观察ERK_(1,2)抑制剂、5-FU和联合用药对细胞增殖的抑制作用,流式细胞仪检测细胞凋亡率,用RT-PCR观察ERK_(1,2)抑制剂、5-Fu和联合用药对bcl-2和caspase-9的表达的影响.结果:ERK_(1,2)抑制剂联合5-Fu组在抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡,均较对照组、单独用药组作用增强,并且下调bcl-2和上调easpase-9的表达.结论:ERK_(1,2)抑制剂联合5-Fu有协同抑制B16细胞增殖,促进凋亡的作用,其机制可能与诱导细胞凋亡,下调bcl-2和上调caspase-9的表达有关.     

SBHL对人宫颈癌细胞凋亡作用的实验研究

目的 研究澳洲茄胺盐酸盐(SBHL)对人宫颈癌细胞的增殖抑制作用和机制.方法 用MTT法检测SBHL对ME180细胞增殖影响,用流式细胞技术和琼脂凝胶电泳法分析细胞凋亡、细胞周期变化,用电子显微镜观察细胞超微结构的变化.结果 SBHL作用ME180细胞24 h后,细胞存活率明显下降,而且随着澳洲茄胺盐酸盐浓度的增加,抑制作用增强(P<0.01);SBHL可将ME180细胞周期阻滞于G1期,诱导细胞凋亡,细胞凋亡率明显增加(P<0.01);细胞超微结构呈现典型的凋亡特征.结论 SBHL可通过阻滞细胞周期发展发挥抑制ME180细胞增殖的作用,SBHL还可诱导细胞发生凋亡.     

人血管紧张素Ⅱ2型受体AT2R重组细胞系的构建与鉴定

目的:构建人血管紧张素Ⅱ2型受体(hAT2R)过表达稳定细胞系,探讨AT2R激动剂Compound 21等对前列腺癌细胞的作用及机制.方法:构建含hAT2R基因的慢病毒表达载体pLV-CMV-hAT2R-IRES-eGFP并包装成慢病毒.将重组慢病毒载体pLV-CMV-IRES-eGFP-hAT2R感染前列腺癌细胞,并利用流式细胞术筛选出单克隆细胞株,RT-PCR及Western blot方法检测重组细胞系中hAT2R表达水平,使用AT2R激动剂CGP42112检测受体功能.结果:重组慢病毒载体感染PC-3、DU145前列腺癌细胞24 h后均能观察到eGFP表达,用流式细胞术分别筛选出单克隆细胞株,RT-PCR及Western blot检测结果显示目的基因hAT2R在两株重组细胞系中表达显著升高,CGP42112处理24 h后,重组细胞系细胞活力较正常PC-3、DU145细胞显著降低.结论:成功构建hAT2R过表达稳定细胞系.     

脑特异性高表达蛋白TMEM59L诱导细胞凋亡的机制

TMEM59L为近年来新发现的脑特异性高表达蛋白,具有促凋亡效果,但其具体的凋亡机制还不清楚.构建了TMEM59L重组质粒,并在HEK293T细胞中过表达TMEM59L,用Annexin V-FITC/PI双染法确定了TMEM59L可以诱导细胞凋亡,之后用免疫印迹方法检测细胞内凋亡相关分子激活情况.结果显示,外源TMEM59L可以降低Bcl-2的蛋白表达水平,诱导细胞色素c从线粒体释放进入细胞质,并且激活caspase-9、caspase-7和caspase-3,但不激活caspase-8;活化的caspase-7和caspase-3进一步酶解死亡底物PARP,导致细胞凋亡;此外,用广谱caspase抑制剂Z-Val-Ala-Asp-FMK(Z-VAD-FMK)抑制caspase-7和caspase-3活性后,死亡底物PARP的酶解也基本被抑制.由此可见,TMEM59L是通过caspase依赖的线粒体途径诱导HEK293T细胞凋亡.     

过表达maspin对人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响

通过构建maspin表达质粒,在人乳腺癌MCF-7细胞中过表达maspin,研究maspin对MCF-7细胞增殖率及凋亡率的影响.MTT检测实验表明,过表达maspin能够剂量依赖性抑制MCF-7细胞的增殖率.采用TUNEL法和流式细胞术检测maspin对MCF-7细胞凋亡的影响,结果表明过表达maspin可促进MCF-7细胞凋亡进而抑制其增殖.     

新型姜黄素结构衍生物抗肝癌细胞增殖作用的研究

采用MTT法对姜黄素结构衍生物（CCM系列化合物）进行抗人肝癌细胞Bel-7402和SMMC-7721活性筛选;利用流式细胞技术和荧光显微镜检测SMMC-7721细胞凋亡及周期分布;采用Western-Blot方法检测SMMC-7721中蛋白caspase-3和剪切后p17的表达.结果表明,化合物CCM-5和CCM-14抗肿瘤活性较好,其对SMMC-7721细胞的凋亡作用呈剂量依赖性,且凋亡率与阴性对照组相比有显著差异（P<0.01）;化合物浓度增高时,G0/G1期细胞减少,S期以及G2/M期细胞增加,凋亡峰SubG1峰增大;两个化合物均可增强caspase-3的表达,随着浓度的提高,caspase-3的表达趋势减弱,而剪切形式p17亚基表达量逐渐提高.因此,姜黄素结构衍生物CCM-5和CCM-14能抑制人肝癌细胞SMMC-7721细胞的增殖,促进凋亡,其作用机制可能与化合物诱导caspase-3活性的增强有关.     

hPNAS-4腺病毒载体的构建及其体外抗肿瘤作用

[摘要] 目的：构建携带人的凋亡相关新基因PNAS-4(hPNAS-4)的重组腺病毒,并观察其感染人肺癌A549细胞所引起的hPNAS-4过表达对体外肿瘤细胞凋亡的影响。方法：用RT-PCR从293A细胞中克隆hPNAS-4编码区cDNA,将其酶切后连接至pENTR11载体上,再通过pENTR11与腺病毒骨架载体pAd/CMV/V5-DEST之间的同源重组作用将hPNAS-4基因片段重组至pAd/CMV/V5-DEST上,最后经293细胞的包装扩增后得到携带hPNAS-4基因的重组腺病毒;将重组腺病毒体外感染人肺癌A549细胞;用RT-PCR检测感染细胞中hPNAS-4的过表达情况;通过MTT、流式细胞术及DNA Ladder分别检测感染细胞的增殖与凋亡情况。结果：从293A细胞中中克隆到hPNAS-4全长cDNA并成功构建腺病毒表达载体Ad-hPNAS-4,经测定其滴度为：2.4×108 pfu/ml,感染人肺癌A549细胞后：经RT-PCR测得其mRNA表达明显上调,MTT检测结果为细胞增殖受到明显抑制,流式细胞术测得细胞凋亡率明显升高,琼脂糖凝胶电泳显示其基因组DNA有明显的梯状条带（DNA ladder）;结论：hPNAS-4腺病毒载体感染人肺癌A549细胞后,发现hPNAS-4过表达对肿瘤细胞的生长有明显的抑制和诱导凋亡作用,为今后研究其分子机制以及hPNAS-4腺病毒载体应用于肿瘤动物实验和肿瘤基因治疗提供实验资料。     

CPUY013对胰腺癌Capan2的生长抑制与诱导凋亡作用

探讨CPUY013对体外培养人胰腺癌细胞Capan2生长抑制及诱导凋亡作用.采用MTT法、克隆原形成法检测CPUY013对Capan2细胞生长的抑制作用,采用流式细胞仪分析CPUY013对细胞周期的影响,Western Blot法检测TopoⅠ、野生型p53、caspase-3、bcl-2和bax蛋白表达的变化.MTT法、集落形成试验结果显示,CPUY013对体外培养的人胰腺癌细胞Capan2有明显的生长抑制作用,处理72 h的IC50值为7.3×10^-7mol/L（MTT法）,CPUY013在8.0×10^-8mol/L浓度可以明显抑制Ca-pan2细胞的集落形成,抑制率为69.6%.同时,CPUY013可剂量依赖地降低Capan2细胞G1期细胞的比例,升高S期细胞的比例,呈现明显的S期阻滞.CPUY013可下调TopoⅠ蛋白的表达,上调细胞中p53、caspase-3、bax蛋白表达,下调bcl-2蛋白表达,并呈剂量依赖性.CPUY013对Capan2细胞具有明显的生长抑制作用,阻滞细胞周期进程,诱导Capan2细胞凋亡,其可能与降低细胞内TopoⅠ蛋白表达,增加p53、caspase-3、bax蛋白表达,降低bcl-2蛋白表达有关.     

依地福新抑制Jurkat细胞生长机制的研究

目的观察依地福新对体外培养的Jurkat细胞的生长抑制作用,并进一步探讨其作用机制。方法应用MTT法检测细胞增殖活性;流式细胞仪检测细胞周期分布;Annexin V—FITC染色法检测细胞凋亡率。结果不同浓度依地福新处理Jurkat细胞24～96h后,细胞增殖显著受到抑制,并呈现浓度及时间依赖性;1．0μmol／L、5．0ymol／L、10．0μmol／L依地福新处理72h后,Jurkat细胞G0／G1期细胞数量显著增加,S期细胞数量显著降低（P〈0．01）;各浓度组细胞凋亡率均显著增加（P〈0．01）。结论依地福新对Jurkat细胞具有生长抑制作用,其机制与阻滞细胞周期及诱导凋亡有关。     

重组hFGF-7腺病毒对角质形成细胞的生物学效应

目的:研究重组腺病毒导入人成纤维细胞生长因子7(hFGF-7)对人皮肤角质形成细胞(HaCat)的生物学效应.方法:通过倍比稀释和感染实验,测定重组腺病毒rAd-hFGF-7的滴度;流式细胞术检测重组腺病毒感染HaCat细胞的感染效率;MTT法检测rAd-hFGF-7对HaCat细胞增殖的影响;重组腺病毒对HaCat细胞周期的影响通过流式细胞术进行检测.结果:高滴度重组腺病毒可高效感染HaCat细胞,其促细胞增殖作用随着重组腺病毒MOI值的增加而增强,当MOI值为50时,感染细胞进入S期和G_2期的细胞比率显著增加.结论:重组腺病毒rAd-hFGF-7可促进HaCat细胞的增殖,改变HaCat细胞周期.     

吲哚乙酸结合辣根过氧化物酶对K562细胞增殖的影响

应用MTT实验、细胞计数法检测吲哚乙酸结合辣根过氧化物酶,流式细胞仪(FCM)和DNA末端标记法(TUNEL)检测IAA/HRP对细胞增殖周期和细胞凋亡的作用,研究了吲哚乙酸(indole-3-acetic acid IAA)结合辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase HRP)对K562细胞增殖的影响.结果表明,与对照组相比,IAA和HRP单独处理组对K562细胞的生长具有部分抑制作用,但无显著性差异;而IAA与HRP结合后对K562细胞的抑制作用明显增强.流式细胞仪检测结果表明,K562细胞阻滞于G2/M期.IAA/HRP具有明显的诱导K562细胞凋亡的作用,且诱导凋亡的作用与IAA浓度呈正相关(r=0.971,P<0.01).IAA/HRP能明显抑制K562细胞生长,将细胞周期阻滞于G2/M期,诱导细胞凋亡.     

重组质粒pEgr-1-TRAIL辐射诱导乳腺癌细胞效应的实验研究

目的将具有辐射诱导表达特性的重组质粒p Egr-1-TRAIL转入乳腺癌MCF-7细胞中,诱导肿瘤杀伤基因TRAIL的表达,实现辐射和基因对MCF-7细胞的双重杀伤效应.方法用ELISA法检测不同剂量X射线诱导TRAIL表达的量效关系及2 Gy X射线照射后不同时间TRAIL的表达;用流式细胞仪检测不同处理组MCF-7细胞早期凋亡情况.结果不同剂量X射线照射转染p Egr-1-TRAIL重组质粒的乳腺癌细胞MCF-7,TRAIL表达量明显高于假照组(P0.001~0.05),其中5 Gy X射线照后表达量最高,TRAIL表达量为假照组的5.1倍.2 Gy X射线照射后4 h,TRAIL表达量明显升高(P0.05),并随时间延长逐渐增加,照射后32 h达峰值,表达量为照射前的4.6倍.MCF-7-p Egr-1-TRAIL/0 Gy组早期凋亡细胞百分数较MCF-7/0 Gy和MCF-7-p3.1Egr/0 Gy组明显增加(P0.01),随着照射剂量的增加,MCF-7-p Egr-1-TRAIL/5 Gy组细胞早期凋亡率与其他处理组比较均存在统计学意义(P0.001~0.05),MCF-7/0 Gy组细胞生长最快,而MCF-7-p Egr-1-TRAIL/8 Gy组细胞生长最慢.结论乳腺癌细胞转染p Egr-1-TRAIL重组表达质粒联合X射线照射能够增加MCF-7细胞凋亡,抑制其生长.