水稻含隐性抗白叶枯病基因xa5的24 kb片段的鉴定与基因预测

水稻xa5基因是具有重要研究和育种价值的隐性广谱抗白叶枯病基因. 利用水稻品系IR24及其近等基因系IRBB5(含xa5基因)杂交组合, 构建了含4892个单株的F₂定位群体. 同时, 利用与xa5连锁的RFLP标记筛查含xa5基因的水稻抗性品系IRBB56的BAC文库, 构建了一个覆盖目标基因位点的长约213 kb的跨叠克隆群. 根据国际水稻基因组和中国超级杂交稻基因组序列, 以及跨叠克隆群的部分亚克隆测序, 设计了一系列SSLP和CAPS标记对目标基因进行精细遗传定位. xa5基因定位在2个CAPS标记K5和T4之间且与T2共分离, 标记K5和T4之间的遗传距离为0.3 cM, 物理距离约为24 kb. 对xa5基因所在的24 kb片段DNA序列进行基因预测, 揭示出可能编码ABC转运蛋白和转录因子TFIIA小亚基的2个基因. 对这一区段及其编码基因的功能研究将阐明xa5抗白叶枯病的分子机制.     

水稻籼粳杂种不育基因座Sc的遗传图

杂种不育是水稻籼粳亚种间杂种优势利用的主要障碍. 为了克隆1个籼粳杂种不育基因Sc, 利用分子标记和近等基因系杂交产生的F2群体对Sc座位进行了精细定位. 初步的连锁分析结果表明, Sc座位与第3染色体的4个分子标记以RM218-RG369-Sc-RG227-RG391的关系连锁, 其中RG227与Sc座位之间的遗传距离为0.07 cM. 用RG227为起始探针筛选籼稻的TAC基因组文库, 并通过染色体步移构建了一个覆盖Sc座位的跨度约320 kb的克隆重叠群. 对可能覆盖Sc的2个TAC克隆M45E14和M90J01进行了部分测序. 用TAC克隆序列和RG227序列搜索水稻基因组序列数据库, 锚定了粳稻BAC克隆OSJNBb0078P24(148 kb)序列. 通过比较TAC和BAC克隆的序列, 在Sc座位区域发展了6个新的基于PCR的标记. 用这些标记进一步把Sc座位定位在一个约46 kb的区域内. 从定位结果推测该BAC克隆和TAC克隆M45E14包含Sc基因. 基因预测分析显示, 在此46 kb区域内有6个预测的ORF.     

水稻籼粳杂种不育基因座Sc的遗传图和物理图精细定位

杂种不育是水稻籼粳亚种间杂种优势利用的主要障碍.为了克隆1个籼粳杂种不育基因Sc,利用分子标记和近等基因系杂交产生的F2群体对Sc座位进行了精细定位.初步的连锁分析结果表明,Sc座位与第3染色体的4个分子标记以RM218-RG369-Sc-RG227-RG391的关系连锁,其中RG227与Sc座位之间的遗传距离为0.07 cM.用RG227为起始探针筛选籼稻的TAC基因组文库,并通过染色体步移构建了一个覆盖Sc座位的跨度约320kb的克隆重叠群.对可能覆盖Sc的2个TAC克隆M45E14和M90J01进行了部分测序.用TAC克隆序列和RG227序列搜索水稻基因组序列数据库,锚定了粳稻BAC克隆OSJNBb0078P24(148kb)序列.通过比较TAC和BAC克隆的序列,在Sc座位区域发展了6个新的基于PCR的标记.用这些标记进一步把Sc座位定位在一个约46kb的区域内.从定位结果推测该BAC克隆和TAC克隆M45E14包含Sc基因.基因预测分析显示,在此46 kb区域内有6个预测的ORF.     

水稻穗部突变体Cl的形态和定位分析

簇生穗突变体Cl表型为多数枝梗顶端有2或3个小穗簇生在一起. 利用扫描电子显微镜观察显示, Cl的功能与水稻枝梗顶部的发育有关, 同时Cl影响了顶端小穗的伸长; 而Cl突变体中穗粒数有一定降低, 提示Cl基因可能对水稻穗粒数也有一定的影响. 分别利用Cl与中花11及Cl与浙辐802 杂交的F2群体对Cl位点进行遗传定位, Cl位点初步定位在第6染色体的CAPS标记CK0214和SS0324之间. 为了进一步精细定位Cl位点, 在CK0214和SS0324之间发展了5个CAPS标记, 连锁分析表明, Cl与其中2个标记R0674E和C12560紧密连锁, 遗传距离分别为0.2和2.1 cM, 并且Cl被定位在这两个标记之间. 以此为起点, 构建覆盖Cl基因区域的PAC 重叠群, 两个PAC克隆AP004571和AP004236将Cl位点覆盖, 物理距离为196 kb, 为最终克隆Cl基因奠定了基础. 等位性测定显示, Cl与另一个水稻簇生穗突变体Cl2是等位突变.     

水稻紫色种皮基因Pb的精细定位与候选基因分析

紫米因其种皮内花色素苷的沉积而着色.控制种皮着色的Pb基因位于水稻第4染色体,紫色种皮对白色种皮呈显性.本研究利用培矮64S(白米)×豫南黑籼糯(紫米)和培矮64S×川黑糯(紫米)两个F2分离群体对Pb基因进行了精细定位.首先用SSR标记将Pb基因初步定位在距微卫星位点RM3820下游0.79cM的位置.然后,通过在候选区域内发展高密度的InDel标记和CAPS标记,将Pb基因限定在两个InDel标记RID3与RID4之间25kb范围以内.在该区段内,TIGR水稻基因组(R.5)标有两个注释基因:一个为与玉米Lc基因同源的Ra,为控制花色素苷代谢的Myc类转录因子;另一个为与拟南芥TT8同源的bhlh16,也与植物色素代谢有关.根据两者的性质和前人相关研究结果,推测Pb与Ra实为同一个基因.序列分析结果表明,与白米品种培矮64S,9311(籼)和日本晴(粳)相比,豫南黑籼糯和川黑糯中Ra基因第7外显子存在一个GT缺失.根据GT缺失发展了一个CAPS标记CAPSRa,并对两个F2分离群体和100余份水稻品种进行分析.结果发现,所有F2白米单株以及所有白米(n=63)和红米(n=23)品种的CAPSRa基因型与培矮64S相同,而所有紫米品种(n=20)与豫南黑籼糯和川黑糯相同.据此推测,水稻紫色种皮性状可能由Ra基因第7外显子内的GT缺失引起.     

水稻紫色种皮基因Pb的精细定位与候选基因分析

紫米因其种皮内花色素苷的沉积而着色．控制种皮着色的Pb基因位于水稻第4染色体，紫色种皮对白色种皮呈显性．本研究利用培矮64S（白米）×豫南黑籼糯（紫米）和培矮64S×川黑糯（紫米）两个F2分离群体对P易基因进行了精细定位．首先用SSR标记将P易基因初步定位在距微卫星位点RM3820下游0．79cM的位置．然后，通过在候选区域内发展高密度的InDel标记和CAPS标记，将P6基因限定在两个InDel标记RID3与RID4之间25kb范围以内．在该区段内，TIGR水稻基因组（R．5）标有两个注释基因：一个为与玉米k基因同源的砌，为控制花色素苷代谢的Myc类转录因子；另一个为与拟南芥刀四同源的bhlh16，也与植物色素代谢有关．根据两者的性质和前人相关研究结果，推测Pb与Ra实为同一个基因．序列分析结果表明，与白米品种培矮64S，9311（籼）和日本晴（粳）相比，豫南黑籼糯和川黑糯中Ra基因第7外显子存在一个GT缺失．根据GT缺失发展了一个CAPS标记CAPSRa，并对两个F2分离群体和100余份水稻品种进行分析．结果发现，所有F2白米单株以及所有白米（n=63）和红米（n=23）品种的CAPSRa基因型与培矮64S相同，而所有紫米品种（n=20）与豫南黑籼糯和川黑糯相同．据此推测，水稻紫色种皮性状可能由Ra基因第7外显子内的GT缺失引起．     

水稻阶段性返白突变体的鉴定和候选基因分析

从粳稻品种中花11 的后代中发现了一个叶色突变体sgra, 该突变体幼苗期叶色正常, 而6~8 叶期以后新生叶白化, 随后白化叶转绿. 突变体的遗传分析表明, 该突变体表型受1 对隐性核基因控制. 利用籼粳杂交F2群体对突变位点进行了基因定位, 将其定位于水稻第11 染色体的2 个标记ID343-11 和PSM415 之间, 遗传距离分别为0.9 和1.0 cM. 随后, 利用已公布的水稻序列和SSR标记, 在两标记间发展了9 对新的标记, 进一步将SGRA基因定位在IDM-2 和RM26739 之间, 物理距离约为17.6 kb. 对野生型和突变体候选区段基因组DNA 测序分析表明, 候选基因编码一个ABC 转运蛋白.     

水稻半矮秆基因sd-g的精细定位

矮秆基因的发掘、研究和利用是水稻株型改良育种和植物生长发育分子生物学研究的重要基础. 利用新桂矮双矮与02428杂交产生的F₂群体对sd-g进行了精细定位. sd-g基因首先被定位在水稻第5染色体上微卫星标记RM440和RM163之间, 遗传距离分别是0. 5和2.5 cM. 为了进一步精细定位sd-g基因, 利用已经公布的水稻基因组序列, 在sd-g基因附近区域寻找微卫星序列并发展新的标记, 在RM440和RM163之间发展了9个微卫星标记. sd-g基因被进一步定位在SSR5-1和SSR5-51之间, SSR5-1与sd-g之间距0. 1 cM, SSR5-51与sd-g之间相距0. 3 cM, 而SSR418与sd-g表现为共分离. 以此为基础, 构建覆盖sd-g基因区域的BAC重叠群, sd-g基因被定位在AC105319约85 kb的区段上, 这为sd-g基因的图位克隆奠定了基础.     

水稻脆性突变体的分离及其基因定位

水稻脆性突变体（嫩稻）是从γ射线诱变的籼稻品种双科早的M2代中筛选而来的茎、叶较脆突变体，被命名为fpl。利用嫩稻和C－堡杂交的F2群体对fpl位点进行了精细的遗传定位。fpl位点首先被初步定位在水稻第3染色体着丝粒附近的微卫星DNA分子标记RM16和STS分子标记G114a之间，遗传距离分别为3.1和9.1cM。为了进一步定位fpl位点，在RM16t G144a间发展了一个CAPS分子标记C524a，与fpl位点的遗传距离为0.4cM。这一结果为进一步构建覆盖fpl基因区域的BAC重叠群和最终克隆fpl基因奠定了坚实的分子基础。等位性测定表明fpl与已知的水稻茎突变基因bcl等位。     

水稻类病变突变体lmi的鉴定及其基因定位

水稻类病变突变体lmi(lesion mimic initiation)是从γ射线诱变的籼稻品种中籼3037的后代中发现的,属于起始型的类病变突变体. 无菌培养、台盼蓝染色及遮光实验表明, 该突变体受光照控制细胞自主性死亡. 遗传分析表明, 该突变性状由一对隐性基因控制. 利用lmi和93-11杂交的F2群体对lmi基因进行初步遗传定位, 发现该基因定位于水稻第8号染色体着丝粒附近的两个微卫星分子标记RM547和RM331之间, 与两者遗传距离分别为1.2和3.2 cM. 进一步利用这两个标记之间发展的CAPS标记 C4135-8, C4135-9及C4135-10对lmi基因进行精细的遗传定位, 结果表明, lmi基因与标记C4135-10共分离. 这一结果为克隆lmi基因奠定了基础.     

水稻早衰叶突变体基因psll的遗传分析和精细定位

植物叶片是最主要的光合作用器官．作物叶片生长、发育和衰老的分子机理研究与提高作物产量形成密切相关．利用水稻中花11号经C0^60辐射产生的早衰叶突变体分别与南京6号和南京11号杂交的F1及其衍生的F2群体，对早衰叶突变体进行了遗传分析和基因定位．结果表明，该早衰叶突变体是由一隐性核基因psll控制，利用SSR标记把psll定位在水稻第2染色体上．利用已经公布的水稻基因组序列，在该基因附近区域发展了34对新的STS标记，对psll进行了精细定位．以此为基础，构建了覆盖psll区域的BAC重叠群，并把目标基因定位在一个约48kb的区段上，为最终克隆目标基因奠定了基础．     

栽培稻的紧穗野生稻抗褐飞虱主效基因的遗传定位

野生稻资源是水稻育种中获取有利外源基因的一个主要来源。紧穗野生稻（Oryza eichingeri,2n=24,CC)原产于非洲,具有高抗褐飞虱、白背飞虱和白叶枯病等多种有利性状。在紧穗野生稻与栽培稻（Oryza sativa,2n=24,AA)品种02428远缘杂交后代中,利用限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism,RFLP)和微卫星（simple sequence repeats,SSR) 等分子标记,对栽培稻背景下外源遗传物质的存在进行了跟踪鉴定,并对来自紧穗野生稻的抗褐飞虱基因进行了遗传分析和染色体定位。结果表明,紧穗野生稻的染色体片段已经易位到栽培稻中;抗褐飞虱性状由一对显性主效基因控制,位于第2染色体,在两个微卫星标记RM240和RM250之间,遗传距离分别为6．1和5．5cM,暂时定名为Bphl3(t)。该基因的发现和定位将有助于对水稻褐飞虱抗性的改良。     

水稻稀穗突变体的遗传分析及基因的精细定位

水稻稀穗突变体lax影响花序发育的主要特征是: 穗轴上能形成正常的一次、二次枝梗, 侧生小穗的发育被完全阻断, 只在枝梗的顶端发育形成单个小穗, 且小花呈多种异常变异. 突变体与粳稻品种W11杂交获得F₂分离群体. 以该F₂分离群体为基础, 根据水稻基因组序列设计微卫星引物和CAPS标记, 并进行连锁分析, 将稀穗基因定位在水稻第1染色体长臂的CAPS标记HB2和微卫星标记MRG4389之间, 与两标记间的距离均为0.14 cM, 与CAPS标记LZ1共分离. RT-PCR分析结果显示, 在稀穗突变体中与花器官发育相关的B功能基因OsMADS2, OsMADS4, OsMADS16 以及C功能基因OsMADS3的转录水平明显下降, 而A功能基因 RAP1A的转录水平未受到影响.     

水稻F1花粉不育基因座S-b的精细定位

杂种不育是水稻籼粳亚种间杂种优势利用的主要障碍, 开展杂种不育基因的克隆和功能分析对于克服和缓解亚种间杂种的不育性具有重要的意义. 本研究在S-b座位初定位的基础上, 根据水稻基因组的序列发展微卫星标记, 将S-b座位定位在微卫星标记PSM8和PSM202之间. 为了精细定位S-b座位, 以S-b座位的近等基因系为材料培育了包含有3910株的F2作图群体, 同时根据PSM8和PSM202界定范围内的基因组序列发展了2个微卫星标记, 2个插入缺失多态性标记和4个CAPS标记. 利用作图群体中的重组株进行花粉育性表型与新发展标记基因型的连锁分析, 结果表明标记W4与S-b座位完全连锁, 而标记A8和A14位于S-b座位的两侧, 与S-b座位的遗传距离分别为0.026和0.038 cM. 将多态性标记与该区域克隆的序列进行整合, 结果表明, 新发展的多态性标记锚定在了AC093089, AC079021和AC134931三个首尾相连的克隆上. 根据各标记在物理图谱上的位置, 最终将S-b座位界定在了A8与A14之间27 kb的物理距离内. RiceGAAS注释表明该区域有7个预测ORF. 该结果为S-b座位进一步的功能分析奠定了基础.     

水稻包穗突变体esp2 的遗传分析与基因精细定位

水稻的包穗现象主要是由倒一节间缩短造成的. 阐明包穗形成的分子机制, 对解决水稻不育系的包穗问题, 创造水稻新种质具有重要意义. 我们在籼稻品种明恢86 的组织培养后代中获得了1 个包穗突变体, 命名为esp2(enclosed shorter panicle 2), 其穗部被剑叶叶鞘完全包裹, 倒一节间几乎完全退化, 而其余各节间长度则没有明显改变. 遗传分析表明, esp2 受一对隐性基因控制, 能稳定遗传且不受遗传背景的影响. 显然, ESP2 是控制水稻倒一节间发育的一个关键基因. 利用esp2 与粳稻品种秀水13 杂交的F₂ 群体以及SSR 和InDel 标记, 将ESP2 精细定位在1 号染色体短臂末端一个14 kb 的区域内. 根据水稻基因组序列的注释, 该区域内只存在1 个完整的基因, 亦即一个假定的磷脂酰丝氨酸合成酶(putative phosphatidylserine synthase)基因. 对野生型和突变体的测序分析结果表明, 该基因内部插入了一个5287 bp 的反转座子序列. 因此, 我们将该基因作为ESP2 的候选基因. 本研究结果为ESP2 基因的克隆和功能分析奠定了基础.     

水稻茸毛基因GL6的遗传学分析与精细定位

叶片表面茸毛是水稻形态学特征上的一个重要农艺性状,对水稻的生长及生理特性有着重要的影响.应用叶片具有茸毛特征的水稻品种75-1-127,无茸毛水稻品种明恢63,光身稻品种Lemont,9311分别杂交产生F1及F1自交产生的F2群体对水稻茸毛基因进行遗传学分析,结果表明,水稻茸毛性状为一对细胞核基因控制的显性性状.应用75-1-127/明恢63的F2隐性分离群体,结合分离群体分析法(BSA)和隐性群体分析法(RCA),并通过Mapmaker3.0/MapDraw软件分析,将水稻茸毛基因GL6初步定位在水稻第6号染色体上,位于SSR标记RM20491和RM20547之间,且两标记与该茸毛基因的相对遗传距离分别为7.2和2.2cM.进一步构建大的F2分离群体并同时挖掘新的SSR标记及插入缺失InDel标记用于茸毛基因GL6的精细定位,将茸毛基因GL6精细定位在插入缺失标记InDel-106和InDel-115之间,且两标记与该茸毛基因的相对遗传距离分别为0.3和0.1cM,结合GeneBank数据库分析,在该精细定位区域内,对应粳稻日本晴和籼稻9311的物理距离分别为79和116.82kb,分别注释有7个和8个预测基因,为进一步的基因克隆和功能研究奠定了基础.     

水稻穗部突变体Cl的形态和定位分析

簇生穗突变体Cl表型为多数枝梗顶端有2或3个小穗簇生在一起. 利用扫描电子显微镜观察显示, Cl的功能与水稻枝梗顶部的发育有关, 同时Cl影响了顶端小穗的伸长; 而Cl突变体中穗粒数有一定降低, 提示Cl基因可能对水稻穗粒数也有一定的影响. 分别利用Cl与中花11及Cl与浙辐802 杂交的F₂群体对Cl位点进行遗传定位, Cl位点初步定位在第6染色体的CAPS标记CK0214和SS0324之间. 为了进一步精细定位Cl位点, 在CK0214和SS0324之间发展了5个CAPS标记, 连锁分析表明, Cl与其中2个标记R0674E和C12560紧密连锁, 遗传距离分别为0.2和2.1 cM, 并且Cl被定位在这两个标记之间. 以此为起点, 构建覆盖Cl基因区域的PAC 重叠群, 两个PAC克隆AP004571和AP004236将Cl位点覆盖, 物理距离为196 kb, 为最终克隆Cl基因奠定了基础. 等位性测定显示, Cl与另一个水稻簇生穗突变体Cl2是等位突变.     

水稻类病变突变体lmi的鉴定及其基因定位

水稻类病变突变体lmi(lesion mimic initiation)是从γ射线诱变的籼稻品种中籼3037的后代中发现的,属于起始型的类病变突变体. 无菌培养、台盼蓝染色及遮光实验表明, 该突变体受光照控制细胞自主性死亡. 遗传分析表明, 该突变性状由一对隐性基因控制. 利用lmi和93-11杂交的F2群体对lmi基因进行初步遗传定位, 发现该基因定位于水稻第8号染色体着丝粒附近的两个微卫星分子标记RM547和RM331之间, 与两者遗传距离分别为1.2和3.2 cM. 进一步利用这两个标记之间发展的CAPS标记 C4135-8, C4135-9及C4135-10对lmi基因进行精细的遗传定位, 结果表明, lmi基因与标记C4135-10共分离. 这一结果为克隆lmi基因奠定了基础.     

水稻早衰叶突变体基因psl1的遗传分析和精细定位

植物叶片是最主要的光合作用器官. 作物叶片生长、发育和衰老的分子机理研究与提高作物产量形成密切相关. 利用水稻中花11号经Co⁶⁰辐射产生的早衰叶突变体分别与南京6号和南京11号杂交的F₁及其衍生的F₂群体, 对早衰叶突变体进行了遗传分析和基因定位. 结果表明, 该早衰叶突变体是由一隐性核基因psl1控制, 利用SSR标记把psl1定位在水稻第2染色体上. 利用已经公布的水稻基因组序列, 在该基因附近区域发展了34对新的STS标记, 对psl1进行了精细定位. 以此为基础, 构建了覆盖psl1区域的BAC重叠群, 并把目标基因定位在一个约48 kb 的区段上, 为最终克隆目标基因奠定了基础.     

水稻雄性不育突变体OsMS-L的遗传与定位分析

通过对粳稻9522辐射诱变, 得到一隐性核不育的水稻雄性不育突变体OsMS-L, 对OsMS-L进行组织切片观察发现, 在小孢子时期绒毡层不退化, 小孢子不能发育成花粉粒. 花粉发育后期绒毡层异常增大, 小孢子破碎. OsMS-L与籼稻龙特甫B杂交, 自交获得F2代分离群体进行遗传定位. 通过遗传定位方法, 首先将突变基因座位定位在水稻第2染色体SSR标记RM109和RM7562之间. 为了对OsMS-L座位进行精细定位, 我们在RM109和RM7562之间发展了11对有多态性InDel分子标记, 将该基因座位定位在LHS10和LHS6之间, 距离二者都为0.4 cM, 物理距离为133 kb, 为最终克隆OsMS-L基因奠定了基础.