水稻半矮秆基因sd-g的精细定位

矮秆基因的发掘、研究和利用是水稻株型改良育种和植物生长发育分子生物学研究的重要基础. 利用新桂矮双矮与02428杂交产生的F₂群体对sd-g进行了精细定位. sd-g基因首先被定位在水稻第5染色体上微卫星标记RM440和RM163之间, 遗传距离分别是0. 5和2.5 cM. 为了进一步精细定位sd-g基因, 利用已经公布的水稻基因组序列, 在sd-g基因附近区域寻找微卫星序列并发展新的标记, 在RM440和RM163之间发展了9个微卫星标记. sd-g基因被进一步定位在SSR5-1和SSR5-51之间, SSR5-1与sd-g之间距0. 1 cM, SSR5-51与sd-g之间相距0. 3 cM, 而SSR418与sd-g表现为共分离. 以此为基础, 构建覆盖sd-g基因区域的BAC重叠群, sd-g基因被定位在AC105319约85 kb的区段上, 这为sd-g基因的图位克隆奠定了基础.     

水稻散生突变体的遗传和基因定位研究

分蘖角度是构成水稻理想株型和高产育种的重要农艺性状之一. 通过对水稻散生突变体的遗传学分析认为, 该散生表型受一隐性核基因控制, 与已报道的水稻散生突变体la等位, 故将此突变体命名为la-2, 而原突变体被重新命名为la-1. 利用la-2与w11和浙福802分别杂交产生的F₂群体对LA位点进行遗传定位, 发现其与第11号染色体上的微卫星标记RM202和RM229连锁, 遗传距离分别为10.0和8.0 cM. 通过进一步在两标记间发展的6个新的分子标记, 将该基因精确地定位于约0.4 cM的区间. 为进一步克隆LA基因和探讨水稻分蘖角度的控制机制奠定了良好的基础.     

水稻含隐性抗白叶枯病基因xa5的24 kb片段的鉴定与基因预测

水稻xa5基因是具有重要研究和育种价值的隐性广谱抗白叶枯病基因. 利用水稻品系IR24及其近等基因系IRBB5(含xa5基因)杂交组合, 构建了含4892个单株的F₂定位群体. 同时, 利用与xa5连锁的RFLP标记筛查含xa5基因的水稻抗性品系IRBB56的BAC文库, 构建了一个覆盖目标基因位点的长约213 kb的跨叠克隆群. 根据国际水稻基因组和中国超级杂交稻基因组序列, 以及跨叠克隆群的部分亚克隆测序, 设计了一系列SSLP和CAPS标记对目标基因进行精细遗传定位. xa5基因定位在2个CAPS标记K5和T4之间且与T2共分离, 标记K5和T4之间的遗传距离为0.3 cM, 物理距离约为24 kb. 对xa5基因所在的24 kb片段DNA序列进行基因预测, 揭示出可能编码ABC转运蛋白和转录因子TFIIA小亚基的2个基因. 对这一区段及其编码基因的功能研究将阐明xa5抗白叶枯病的分子机制.     

水稻类病变突变体lmi的鉴定及其基因定位

水稻类病变突变体lmi(lesion mimic initiation)是从γ射线诱变的籼稻品种中籼3037的后代中发现的,属于起始型的类病变突变体. 无菌培养、台盼蓝染色及遮光实验表明, 该突变体受光照控制细胞自主性死亡. 遗传分析表明, 该突变性状由一对隐性基因控制. 利用lmi和93-11杂交的F2群体对lmi基因进行初步遗传定位, 发现该基因定位于水稻第8号染色体着丝粒附近的两个微卫星分子标记RM547和RM331之间, 与两者遗传距离分别为1.2和3.2 cM. 进一步利用这两个标记之间发展的CAPS标记 C4135-8, C4135-9及C4135-10对lmi基因进行精细的遗传定位, 结果表明, lmi基因与标记C4135-10共分离. 这一结果为克隆lmi基因奠定了基础.     

水稻穗部突变体Cl的形态和定位分析

簇生穗突变体Cl表型为多数枝梗顶端有2或3个小穗簇生在一起. 利用扫描电子显微镜观察显示, Cl的功能与水稻枝梗顶部的发育有关, 同时Cl影响了顶端小穗的伸长; 而Cl突变体中穗粒数有一定降低, 提示Cl基因可能对水稻穗粒数也有一定的影响. 分别利用Cl与中花11及Cl与浙辐802 杂交的F₂群体对Cl位点进行遗传定位, Cl位点初步定位在第6染色体的CAPS标记CK0214和SS0324之间. 为了进一步精细定位Cl位点, 在CK0214和SS0324之间发展了5个CAPS标记, 连锁分析表明, Cl与其中2个标记R0674E和C12560紧密连锁, 遗传距离分别为0.2和2.1 cM, 并且Cl被定位在这两个标记之间. 以此为起点, 构建覆盖Cl基因区域的PAC 重叠群, 两个PAC克隆AP004571和AP004236将Cl位点覆盖, 物理距离为196 kb, 为最终克隆Cl基因奠定了基础. 等位性测定显示, Cl与另一个水稻簇生穗突变体Cl2是等位突变.     

水稻不完全隐性卷叶主基因rl(t)的精细定位

利用奇妙香(QMX)为轮回亲本, 与卷叶珍汕97B(JZB)杂交并回交的BC₄F₂和BC₄F₃两群体为研究材料, 对卷叶性状进行了遗传分析, 并对卷叶基因进行精细定位. 遗传分析表明, 卷叶性状主要受1对不完全隐性主基因的控制, 命名为rl_(t), 并同时受到数量性状基因和或环境的影响. 利用500个SSR标记和新开发的15个InDel标记, 通过BSA法在卷叶DNA池和平展叶DNA池间筛选到8个多态性标记, 并用MAPMAKER/EXP3.0构建遗传连锁图. 基因定位方法采用复合区间作图法(CIM). 利用BC₄F₂分离群体将rl_(t)初步定位于第2染色体长臂, 位于标记InDel 112~RM3763之间, 两标记之间的遗传距离为2.4 cM, rl_(t)距离InDel 112约1.0 cM. 为精细定位rl_(t), 从BC₄F₂代经标记选择得到1个中度卷叶植株, 自交扩繁成855株个体的BC₄F₃代株系, 另发展4个新的InDel标记. 连锁分析表明, InDel 112.6和InDel 113位于标记InDel 112和RM 3763之间. 利用BC4F3株系中分离出的191个卷叶株和185个平展叶株, 将rl_(t)定位于InDel 112.6~InDel 113之间, 物理距离为137 kb. 对该区段进行了初步的侯选基因分析, 推测rl_(t)可能参与了microRNA(miRNA)系统对叶片发育的调控.     

水稻F1花粉不育基因座S-b的精细定位

杂种不育是水稻籼粳亚种间杂种优势利用的主要障碍, 开展杂种不育基因的克隆和功能分析对于克服和缓解亚种间杂种的不育性具有重要的意义. 本研究在S-b座位初定位的基础上, 根据水稻基因组的序列发展微卫星标记, 将S-b座位定位在微卫星标记PSM8和PSM202之间. 为了精细定位S-b座位, 以S-b座位的近等基因系为材料培育了包含有3910株的F2作图群体, 同时根据PSM8和PSM202界定范围内的基因组序列发展了2个微卫星标记, 2个插入缺失多态性标记和4个CAPS标记. 利用作图群体中的重组株进行花粉育性表型与新发展标记基因型的连锁分析, 结果表明标记W4与S-b座位完全连锁, 而标记A8和A14位于S-b座位的两侧, 与S-b座位的遗传距离分别为0.026和0.038 cM. 将多态性标记与该区域克隆的序列进行整合, 结果表明, 新发展的多态性标记锚定在了AC093089, AC079021和AC134931三个首尾相连的克隆上. 根据各标记在物理图谱上的位置, 最终将S-b座位界定在了A8与A14之间27 kb的物理距离内. RiceGAAS注释表明该区域有7个预测ORF. 该结果为S-b座位进一步的功能分析奠定了基础.     

水稻幼穗分化受阻突变体lhd的遗传分析与基因定位

从圭630/台湾粳的F₁花药培养后代群体中发现了水稻幼穗分化受阻突变体lhd(leafy head), 其植株明显矮化, 叶片细小且丛生, 始终停留在营养生长阶段. 遗传分析表明, lhd受一对隐性基因控制, 该突变基因拟命名为lhd (t). 显然, LHD(t)是控制花序分化的关键基因. 以lhd杂合体与明恢77和京花8号杂交, 建立了2个F₂群体. 在与京花8号杂交的F₂群体中, 部分lhd植株表现出“中间类型”, 说明遗传背景会影响突变性状的表现. 利用已公布的水稻RM系列SSR标记及自行设计的SSR标记, 结合BSA和突变株(共498株)分析, 将LHD(t)基因定位在第10染色体长臂端, 其中标记SSR1, RM269, RM258, RM304和RM171位于一侧, 与LHD(t)的图距分别为6.4, 16.6, 18.4, 22.2和26.3 cM; SSR4和SSR5位于另一侧, 与LHD(t)的图距分别为0.6和2.2 cM. 该结果为进一步对LHD(t)的克隆和表达研究奠定了基础.     

水稻稀穗突变体的遗传分析及基因的精细定位

水稻稀穗突变体lax影响花序发育的主要特征是: 穗轴上能形成正常的一次、二次枝梗, 侧生小穗的发育被完全阻断, 只在枝梗的顶端发育形成单个小穗, 且小花呈多种异常变异. 突变体与粳稻品种W11杂交获得F₂分离群体. 以该F₂分离群体为基础, 根据水稻基因组序列设计微卫星引物和CAPS标记, 并进行连锁分析, 将稀穗基因定位在水稻第1染色体长臂的CAPS标记HB2和微卫星标记MRG4389之间, 与两标记间的距离均为0.14 cM, 与CAPS标记LZ1共分离. RT-PCR分析结果显示, 在稀穗突变体中与花器官发育相关的B功能基因OsMADS2, OsMADS4, OsMADS16 以及C功能基因OsMADS3的转录水平明显下降, 而A功能基因 RAP1A的转录水平未受到影响.     

一个新的水稻卷叶突变体rl9(t)的遗传分析和基因定位

对水稻中调控形态发育的基因进行发掘和研究是进行水稻株型改良和植物生长发育分子生物学研究的重要基础研究工作. 本研究在粳稻中花11中鉴别了一个新的卷叶突变体, 并对其进行了遗传分析和基因定位. 结果表明, 该卷叶突变体是由一隐性单位点(rl_9(t))控制, 利用SSR标记已经把Rl_9(t)定位在水稻第9染色体上. 利用已经公布的水稻基因组序列, 在Rl_9(t)附近区域发展了30个新的STS标记, 对Rl_9(t)进行了精细定位. 以此为基础, 构建了覆盖Rl_9(t)区域的PAC重叠群, 并把目标基因定位在一个约42 kb 的区段上, 为最终克隆目标基因奠定了基础.     

水稻早衰叶突变体基因psl1的遗传分析和精细定位

植物叶片是最主要的光合作用器官. 作物叶片生长、发育和衰老的分子机理研究与提高作物产量形成密切相关. 利用水稻中花11号经Co⁶⁰辐射产生的早衰叶突变体分别与南京6号和南京11号杂交的F₁及其衍生的F₂群体, 对早衰叶突变体进行了遗传分析和基因定位. 结果表明, 该早衰叶突变体是由一隐性核基因psl1控制, 利用SSR标记把psl1定位在水稻第2染色体上. 利用已经公布的水稻基因组序列, 在该基因附近区域发展了34对新的STS标记, 对psl1进行了精细定位. 以此为基础, 构建了覆盖psl1区域的BAC重叠群, 并把目标基因定位在一个约48 kb 的区段上, 为最终克隆目标基因奠定了基础.     

水稻花药发育相关基因OsPRP1的克隆和特性分析

利用减法杂交和RACEs从水稻颖花中克隆了一个编码富含脯氨酸残基多肽的cDNA, 并将其相应的基因命名为OsPRP1. OsPRP1由2个外显子和1内含子组成, 编码的蛋白由224个氨基酸残基组成, 其中脯氨酸含量最高, 占14.29%. 该蛋白由一个21个氨基酸残基组成的信号肽, 一个N-端结构域和一个C-端结构域组成. C-端含有2个18个氨基酸长的、嵌合PEPK基元(motif)的富含脯氨酸的重复序列. Southern blot及序列分析结果表明, 水稻基因组中存在4个拷贝的OsPRP1, 它们定位在第10染色体的20 kb的DNA片段上. RT-PCR表明, OsPRP1在幼芽和颖花中表达量较高, 在根和叶中有少量表达. 用花和幼芽进行原位杂交分析证明在花中, OsPRP1在花粉母细胞、绒毡层细胞和花器官的维管束细胞中表达; 该基因的表达有明显的时间特异性, 在花粉母细胞中表达量最高, 在单核期的小孢子中几乎不表达; 在芽中, 该基因在胚芽鞘和叶原基的表皮细胞中表达. 从该基因编码蛋白的特点可以看出它极可能是一种细胞壁蛋白.     

一个先天性小眼球家系致病基因的排除性定位

先天性小眼球是一种先天发育异常性眼科疾病. 通过基因扫描和连锁分析对一个6代常染色体显性遗传先天性小眼球中国家系的疾病相关基因进行研究. 根据已报道的与小眼球相关的5个基因座位(MITF, SOX2, PAX6, MCOP和NNO2), 在3, 11, 14和15号染色体上选取了14个微卫星标记, 以荧光标记引物的聚合酶链反应(PCR)扩增目的片段, 用ABI 377 DNA遗传分析仪对该家系成员进行基因扫描和基因分型, 并采用Linkage软件包对基因分型结果进行连锁分析. 结果显示, 该家系致病基因与这些已报道的座位均不连锁, 即该家系致病基因不是已报道的座位, 可能是一个尚未报道的对眼球发育至关重要的新基因座位.     

用EST和SSR标记定位水稻温敏不育基因tms5

利用cDNA抑制差减杂交技术建立了水稻减数分裂时期穗部特异表达的SSH文库, 从中筛选121个cDNA片段作为EST (expressed sequence tags)标记, 用RFLP (restriction fragment length polymorphism)方法分析了温敏不育系安农S-1和正常品种安农N之间的多态性, 其中一个EST标记HN57可以检测到亲本间的多态性. 共分离分析结果表明, HN57与安农S-1的温敏不育性完全共分离, 进而将安农S-1的温敏不育基因tms5定位于RGP (rice genome research program)遗传图的第二染色体的31.2 cM处. 为了进行精细定位, 在该区域设计了80对SSR (simple sequence repeat)引物对, 用12对多态性引物将tms5定位于181 kb区间.     

大豆早期结瘤素基因enod2B启动子在水稻中的表达受结瘤因子诱导

在根瘤菌与宿主豆科植物形成的共生关系中, 根瘤菌分泌的结瘤因子是宿主专一性的主要决定因子. 结瘤因子信号能够诱导豆科植物根毛细胞质膜去极化、离子流动和早期结瘤素基因的表达以及根毛变形、皮层细胞分裂和根瘤原基形成等与共生有关的表型变化. 水稻是重要的粮食作物, 能否对结瘤因子信号产生应答反应是最终实现水稻结瘤固氮的关键因素. 将大豆早期结瘤素基因Gmenod2B的启动子与报告基因b-葡萄糖苷酶(GUS)基因融合构建成嵌合基因Gmenod2BP-GUS, 以此嵌合基因作为探索水稻细胞感受结瘤因子信号的分子标记. 通过根癌农杆菌介导的遗传转化系统, 获得了携带嵌合基因Gmenod2BP-GUS的水稻再生植株. 以广宿主根瘤菌NGR234(pA28)分泌的结瘤因子作为探针, 检测转基因水稻中嵌合基因Gmenod2BP-GUS的表达. 结果表明, 转基因水稻中大豆早期结瘤素基因enod2B启动子的表达可以受结瘤因子诱导, 仅在水稻根部的皮层薄壁细胞和内皮层细胞中呈特异性表达, 并且受到氮源的调控. 推测在水稻中可能存在结瘤因子所诱导的豆科早期结瘤素表达的类似机制.     

稻瘟病菌新无毒基因AvrPi7的遗传及物理作图

稻瘟病是目前最具毁灭性的作物病害之一. 本研究通过由田间菌株CHL346和CHL42杂交得到的189个子囊孢子菌株构建的分离群体, 在亲本菌株CHL346中鉴定到了与水稻稻瘟病抗性基因Pi7对应的无毒基因AvrPi7. 为了确定AvrPi7位点的染色体位置, 本研究开发了一套基于稻瘟病菌测序菌株70-15全基因组序列的121个微卫星(simple sequence repeat, SSR)标记. 利用这些SSR标记对AvrPi7位点进行了连锁分析. 结果表明, 位于第1染色体的8个SSR标记与该无毒基因连锁, 其中2个最近的侧翼标记MS1-9和MS1-15分别距离AvrPi7位点3.2和16.4 cM. 为了进一步完成该位点的精细作图, 在MS1-9和MS1-15的侧翼区域进一步开发了8个SSR标记和3个候选无毒基因(candidate avirulence gene, CAG)标记. 通过对这些标记的连锁分析, AvrPi7位点被界定于标记MS1-21和MS1-22之间1.6 cM的区域内, 并与标记CAG2共分离. 为了构建该无毒位点的物理图谱, 通过生物信息学分析(bioinformation analysis, BIA), 将与该基因连锁的分子标记分别着陆于参考菌株70-15的超重叠群(supcontig)上. AvrPi7位点最终被界定在标记MS1-21和MS1-22之间的75 kb区段内. 本研究的结果对于进一步了解真菌中普遍存在的重组不平衡和部分二倍体等现象, 以及对该基因进行克隆及其功能研究具有重要意义.     

通过转δ-OAT基因获得抗盐抗旱水稻

δ-OAT基因编码的鸟氨酸-δ-氨基转移酶是以鸟氨酸为前体合成脯氨酸途径中的关键酶. 采用基因枪法将拟南芥δ-OAT基因导入粳稻品种中作321, 通过PCR及分子杂交分析确定目的基因已插入水稻染色体中并得到超量表达. 抗盐抗旱检测结果表明, 水稻在受到渗透胁迫时会大量积累脯氨酸, 各种条件下转基因水稻积累的脯氨酸是对照的5~15倍; 同等胁迫条件下转基因株系相对生长更快, 苗与根的生物学产量都要高于对照, 最后种子产量也显著高于对照, 如在0.1 mol/L NaCl胁迫下转基因株系相对产量提高了16%~41%, 说明δ-OAT基因超量表达并积累脯氨酸在抗渗透胁迫中有着重要作用, 通过转化δ-OAT基因可以获得抗盐抗旱的基因工程水稻.     

ENU诱变获得4种白斑小鼠及对突变基因的染色体定位

“表型驱动法”是通过诱变、定位及克隆突变基因来研究基因功能的一种手段. 以ENU处理C57BL/6J(B6)雄鼠150只, 繁殖后代小鼠3860只, 筛查到有突变表型的小鼠210只, 经传代实验得到能够遗传的突变鼠10余种, 其中4种为呈显性遗传的白斑突变, 它们是Wbct, W^−1Bao, W^−2Bao和W^−3Bao, 共同表现为腹部、四肢末端及尾部的局部白化. 为定位这些突变基因, 选择平均分布于小鼠基因组且在B6与DBA/2J(D2)间有差异的微卫星标记39个, 区分(B6×D2)×D2的F₂代有无白斑表型后, 用39个微卫星进行基因组扫描. 结果表明, W^−1Bao突变基因与D5Mit168的LOD值为0.56, 与D5Mit352的LOD值为4.47. 在此基础上, 逐步选择接近突变基因的微卫星D5Mit290, D5Mit312, D5Mit356及D5Mit308, 扩大F₂的数量至537只, 将W^−1Bao突变基因定位在第5号染色体D5Mit356及D5Mit308之间, 距着丝粒约42.19 cM; 同理, 将W^−2Bao及W^−3Bao突变基因也定位在与W^−1Bao相近的区域, Wbct突变基因定位于第1号染色体距着丝粒约41.6 cM处. 经过检索小鼠基因组数据库和对染色体局部基因的逐个分析, 认为kit基因为W^−1Bao, W^−2Bao及W^−3Bao白斑突变的候选基因.     

Mutator转座子介导的玉米插入突变体库的构建及遗传评价

以Q105, WW51, 115F, V26-2, 919J为Mutator转座子供体材料, 与本地优良玉米自交系受体材料Hz85, W328以及S-Mo17^Rf3Rf3杂交, 获得26718单株的插入诱变F₁群体(M1). 田间鉴定M1单株的生物学特征及农艺学性状的表型突变, 室内考察突变单株自交果穗M2籽粒性状的突变类型, 并以斑点籽粒出现的频率评价Mu因子的转座频率. 结果表明, 在所构建的Mu介导的玉米插入突变体库中, 以W328为母本(BzBz)的M1群体平均田间表型突变频率为0.07; 以W328 × Mu的M2果穗斑点籽粒的出现频率评价的Mu转座频率为0.121802; 在22500个S-Mo17^Rf3Rf3 × Mu单株中, 发现了5个S型玉米细胞质雄性不育突变单株, 突变频率为2.2×10^-4. 利用优化的MuTAIL-PCR技术分析了99条转座子插入位点的侧翼序列, 归并整理后获得59条(每条约400核苷酸序列)非重复靶位点序列. 对59条序列非重复的Mu因子插入产生的9 bp靶位点正向重复序列进行同源性比较分析, 结果表明, Mu的插入有序列热点. 经生物信息学分析后注释了27条与玉米、水稻等植物核苷酸数据库中匹配值较高的功能序列. 利用比较基因组学方法将36条单一基因序列定位在玉米遗传图谱上, 有多条Mu插入靶位点序列定位在单个标记位点上. 分析发现, 8条Mu插入靶位点序列的预测功能与其相应的定位标记的功能具有一致性. Mu插入突变体库的构建与遗传评价为利用Mu转座子进一步发掘玉米基因、深入开展玉米功能基因组学研究搭建起重要的技术与材料平台.     

经ibeB基因转染的鼠胚胎干细胞分化的研究

ibeB是一个致脑膜炎大肠杆菌K1株中参与大肠杆菌侵袭人脑微血管内皮细胞的基因. 以ibeB基因转染鼠胚胎干细胞, 结果表明, 大肠杆菌脑微血管内皮细胞侵袭蛋白IbeB不但具有“侵袭”功能, 而且可诱导真核细胞向神经样细胞分化, 经ibeB基因稳定转染的鼠胚胎干细胞能特异性表达神经前体细胞标志分子——nestin. GFP标记的活细胞观察显示外源性IbeB蛋白定位于细胞核. 上述结果提示ibeB基因可能在调控nestin表达过程中发挥功能, 这为研究nestin基因的表达调控提供了资料.