两个来源于野生稻的抗褐飞虱新基因的分子标记定位

选用抗源来自药用野生稻（Oryza offcinalis Wall)的抗褐飞虱品系B5为父本,与感虫品种台中本地1号（TN1）杂交,随机选取167个F2单株构成定位群体。运用RFLP技术,采用集团分离分析法（bulked segregant analysis,BSA),对水稻抗褐飞虱基因进行分子标记定位。于第3和第4染色体找到与抗褐飞虱基因连锁的RFLP标记。构建了连锁标记附近区域的RFLP遗传连锁图谱,对这两个抗位点进行了QTL（quantitative trait locus)分析,将这两个抗褐飞虱基因分别定位于第3染色体的G1318和R1925,第4染色体的C820和S11182之间。与已报道的水稻抗褐飞虱基因位点相比较,表明这两个抗褐飞虱基因是新的抗性位点。抗褐飞虱基因新位点的发现和分子标记的建立,为水稻抗虫分子标记辅助育种和抗褐飞虱基因克隆打下了良好基础。     

与Glh, Bph-3和xa-5连锁的BAC克隆在栽培稻和疣粒野生稻中的比较物理定位

疣粒野生稻(O. granulata Nees et Arn ex Watt)是分布于我国的3种最具研究和利用价值的野生稻资源之一. 利用Southern杂交和荧光原位杂交的方法, 对水稻抗绿叶蝉基因Glh, 抗褐飞虱基因Bph-3和抗白叶枯病基因xa-5在栽培稻(Oryza sativa L)和疣粒野生稻中的同源性和物理位置进行了比较分析. Southern杂交结果表明, 在疣粒野生稻中存在与水稻抗性基因连锁的RFLP标记的同源序列. RFLP标记筛选出来的3个BAC克隆作为探针, 在栽培稻和疣粒野生稻有丝分裂中期和减数分裂粗线期染色体中均检测到杂交信号. 双色荧光原位杂交确定了3个BAC克隆中的2个(14E16和38J9)在疣粒野生稻同一对同源染色体的短臂上, 且这2个克隆在栽培稻和疣粒稻染色体上还存在共线性. 另一个BAC克隆(44B4)被定位到2个物种的另一染色体短臂末端. 虽然栽培稻和疣粒野生稻的亲缘关系较远, 在生物学特征和生态习性上有着极为明显的区别, 但疣粒野生稻被检出的染色体在相对长度、臂比和BAC克隆在染色体上的相对位置与栽培稻的结果相似.     

与Gm-6和Pi-5(t)连锁的栽培稻BAC克隆在药用野生稻中的FISH定位

用栽培稻遗传图第4连锁群中与抗稻瘿蚊和抗稻瘟病基因, Gm-6和Pi-5(t)连锁的RFLP标记RG214和RZ565及其筛选出来的2个BAC克隆作探针, 对药用野生稻荧光原位杂交. 供试探针均被定位于第4染色体长臂, 百分距分别为74.18±2.62, 52.33±3.78, 72.33±2.62和54.50± 5.43, 信号检出率为8.3%, 9.8%, 52.70%和61.2%. BAC克隆和RFLP标记探针杂交位置几乎一致, 说明在栽培稻和野生稻中RFLP标记RG214和RZ565都在同一BAC克隆的大插入片段中, 药用野生稻与抗性基因Gm-6和Pi-5(t)的同源顺序就在第4染色体信号出现的相应位置. 在未封阻的情况下, 药用野生稻多个染色体上具有信号, 这表明药用野生稻和栽培稻的Cot1DNA重复顺序也在一定的程度上具有同源性. 药用野生稻第4染色体是根据Jena等(1994)和RFLP杂交的结果确定的, 并讨论了栽培稻BAC克隆对药用野生稻原位杂交物理作图的可行性等问题.     

利用微卫星标记定位水稻红莲型细胞质雄性不育恢复基因

以 (丛广 41A×密阳 2 3)×丛广 41B回交群体为基因定位群体 ,采用群分法 ,对红莲型细胞质雄性不育恢复基因进行了定位 .在 1 5 9对微卫星引物中 ,微卫星标记RM2 5 8与红莲型细胞质雄性不育恢复基因连锁 ,从而将该基因定位于水稻第 1 0染色体上 ,距RM2 5 8约 7.8cM ,恢复基因在染色体上可能是成簇分布的     

水稻类病变突变体lmi的鉴定及其基因定位

水稻类病变突变体lmi(lesion mimic initiation)是从γ射线诱变的籼稻品种中籼3037的后代中发现的,属于起始型的类病变突变体. 无菌培养、台盼蓝染色及遮光实验表明, 该突变体受光照控制细胞自主性死亡. 遗传分析表明, 该突变性状由一对隐性基因控制. 利用lmi和93-11杂交的F2群体对lmi基因进行初步遗传定位, 发现该基因定位于水稻第8号染色体着丝粒附近的两个微卫星分子标记RM547和RM331之间, 与两者遗传距离分别为1.2和3.2 cM. 进一步利用这两个标记之间发展的CAPS标记 C4135-8, C4135-9及C4135-10对lmi基因进行精细的遗传定位, 结果表明, lmi基因与标记C4135-10共分离. 这一结果为克隆lmi基因奠定了基础.     

水稻脆性突变体的分离及其基因定位

水稻脆性突变体（嫩稻）是从γ射线诱变的籼稻品种双科早的M2代中筛选而来的茎、叶较脆突变体，被命名为fpl。利用嫩稻和C－堡杂交的F2群体对fpl位点进行了精细的遗传定位。fpl位点首先被初步定位在水稻第3染色体着丝粒附近的微卫星DNA分子标记RM16和STS分子标记G114a之间，遗传距离分别为3.1和9.1cM。为了进一步定位fpl位点，在RM16t G144a间发展了一个CAPS分子标记C524a，与fpl位点的遗传距离为0.4cM。这一结果为进一步构建覆盖fpl基因区域的BAC重叠群和最终克隆fpl基因奠定了坚实的分子基础。等位性测定表明fpl与已知的水稻茎突变基因bcl等位。     

水稻幼穗分化受阻突变体lhd的遗传分析与基因定位

从圭630/台湾粳的F1花药培养后代群体中发现了水稻幼穗分化受阻突变体lhd(leafy head), 其植株明显矮化, 叶片细小且丛生, 始终停留在营养生长阶段.遗传分析表明, lhd受一对隐性基因控制, 该突变基因拟命名为lhd(t).显然, LHD(t)是控制花序分化的关键基因.以lhd杂合体与明恢77和京花8号杂交, 建立了2个F2群体.在与京花8号杂交的F2群体中, 部分lhd植株表现出"中间类型", 说明遗传背景会影响突变性状的表现.利用已公布的水稻RM系列SSR标记及自行设计的SSR标记, 结合BSA和突变株(共498株)分析, 将LHD(t)基因定位在第10染色体长臂端, 其中标记SSR1, RM269, RM258, RM304和RM171位于一侧, 与LHD(t)的图距分别为6.4, 16.6, 18.4, 22.2和26.3 cM; SSR4和SSR5位于另一侧, 与LHD(t)的图距分别为0.6和2.2 cM.该结果为进一步对LHD(t)的克隆和表达研究奠定了基础.     

携带主效落粒基因的水稻染色体片段代换系Z481的鉴定及和SH6(t)定位

落粒性是水稻非常重要的农艺性状,适度落粒有利于减少产量损失和水稻机械化收割,提高生产效率.因此鉴定落粒基因对水稻生产具有重要意义.本研究以日本晴为受体亲本、优良恢复系R225为供体亲本,采用高代回交和SSR标记辅助选择相结合的方法,鉴定了一个携带易落粒主效单基因的水稻染色体片段代换系Z481.Z481含有4个染色体代换片段,位于第1,3,6染色体上,其代换片段长度分别为8.30,6.17,3.12和10.79 Mb,平均为7.10 Mb.与受体日本晴相比,Z481的株高、穗长、倒一节间长、倒二叶宽显著降低,剑叶宽和结实率显著增加,其他重要农艺性状如叶长、有效穗数、每穗粒数和千粒重均无显著差异.扫描电子显微镜观察表明Z481的护颖和枝梗之间的离层在成熟时期已被完全降解,而日本晴的离层完整,在细胞学上解释了Z481易落粒性产生的原因.进一步利用日本晴与Z481杂交产生的F_1和F_2群体对易落粒基因进行了遗传分析和分子定位.该易落粒性状受单基因隐性调控,最终将该基因定位于第6染色体RM253和ZTQ53之间824 kb的区域,暂命名为SH6(t).目前,在第6染色体尚无落粒基因克隆的报道.由于染色体片段代换系除代换片段外与受体亲本的遗传背景一致,且Z481易落粒遗传行为简单,基本未携带育种不利性状.因此,本研究无论对SH6(t)的克隆,还是进行基因聚合育种培育适度落粒新品种均具有重大利用价值.     

水稻白穗突变体基因的鉴定和染色体定位

从一个水稻籼粳交F₆后代自然群体中获得1例白穗突变体, 其成熟植株基部少数叶片中脉呈现白色, 抽穗后穗粒内外稃和枝梗均表现白色. 用突变体作母本与一粳稻恢复系品种制7杂交, 获得一个F₂分离群体. 初步的遗传分析表明, 该突变属单基因隐性性状. 利用已定位的微卫星标记进行连锁分析, 发现该基因位于水稻第1染色体上. 进一步根据已完成的水稻基因组序列寻找微卫星位点, 连锁分析显示, 该基因位于微卫星标记SSR101和SSR63.9之间, 分别相距2.3和0.8 cM; 并与微卫星标记SSR17呈共分离. 该基因暂定名为wp(t).     

水稻茸毛基因GL6的遗传学分析与精细定位

叶片表面茸毛是水稻形态学特征上的一个重要农艺性状,对水稻的生长及生理特性有着重要的影响.应用叶片具有茸毛特征的水稻品种75-1-127,无茸毛水稻品种明恢63,光身稻品种Lemont,9311分别杂交产生F1及F1自交产生的F2群体对水稻茸毛基因进行遗传学分析,结果表明,水稻茸毛性状为一对细胞核基因控制的显性性状.应用75-1-127/明恢63的F2隐性分离群体,结合分离群体分析法(BSA)和隐性群体分析法(RCA),并通过Mapmaker3.0/MapDraw软件分析,将水稻茸毛基因GL6初步定位在水稻第6号染色体上,位于SSR标记RM20491和RM20547之间,且两标记与该茸毛基因的相对遗传距离分别为7.2和2.2cM.进一步构建大的F2分离群体并同时挖掘新的SSR标记及插入缺失InDel标记用于茸毛基因GL6的精细定位,将茸毛基因GL6精细定位在插入缺失标记InDel-106和InDel-115之间,且两标记与该茸毛基因的相对遗传距离分别为0.3和0.1cM,结合GeneBank数据库分析,在该精细定位区域内,对应粳稻日本晴和籼稻9311的物理距离分别为79和116.82kb,分别注释有7个和8个预测基因,为进一步的基因克隆和功能研究奠定了基础.     

表达雪花莲凝集素(GNA)的转基因水稻纯系抗褐飞虱

利用基因枪法将含有潮霉素抗性基因pht,gusA报告基因和雪花莲外源凝集素基因gna的2个质粒（pWRG1515和pRSSGNA1)共转化粳稻品种鄂宜105号和鄂晚5号种子胚诱导的愈伤组织。从轰击的329块愈伤中共再生出61株独立转基因植株。PCR／Southern blot分析显示，79％的转基因植株含有所有3个外源基因。Western blot分析发现，48株含gna基因的转基因植株中有36株（75％）在不同水平上表达了GNA，GNA最高表达量占总可溶性蛋白的0．5％，遗传分析证实外源基因在转基因后代植株中大多以孟德尔方式遗传。从其R1代为3：1孟德尔分离方式遗传的后代R2代植株中，鉴定出含有并表达所有3个外源基因的5个独立转基因植株纯系。褐飞虱生物鉴定和喂养试验表明，转基因纯系对褐飞虱具有显著的抑制作用，具体表现为降低褐飞虱存活率和繁殖力、延缓褐飞虱发育进度及减少褐飞虱进食量，即表达GNA的转基因水稻纯系对褐飞虱具有抗性作用。     

水稻类病变突变体lmi的鉴定及其基因定位

水稻类病变突变体lmi(lesion mimic initiation)是从γ射线诱变的籼稻品种中籼3037的后代中发现的,属于起始型的类病变突变体. 无菌培养、台盼蓝染色及遮光实验表明, 该突变体受光照控制细胞自主性死亡. 遗传分析表明, 该突变性状由一对隐性基因控制. 利用lmi和93-11杂交的F2群体对lmi基因进行初步遗传定位, 发现该基因定位于水稻第8号染色体着丝粒附近的两个微卫星分子标记RM547和RM331之间, 与两者遗传距离分别为1.2和3.2 cM. 进一步利用这两个标记之间发展的CAPS标记 C4135-8, C4135-9及C4135-10对lmi基因进行精细的遗传定位, 结果表明, lmi基因与标记C4135-10共分离. 这一结果为克隆lmi基因奠定了基础.     

水稻温敏显性核不育基因的遗传分析和分子标记定位

温敏核不育材料 8987,在 2 4℃以下完成雄性不育 ,2 7℃以上恢复可育 .利用该材料与 3个可育品种杂交 ,并对F1和F2 群体进行花粉育性观察和遗传分析 ,确认 8987的不育特性受一对显性基因控制 .以F2 群体 ( 8987×地谷 )为基础 ,应用RFLP和微卫星标记结合群分法 ,发现第 6染色体的RFLP标记C2 35和微卫星标记RM5 0与显性核不育基因连锁 ;进一步将该基因定位于第 6染色体具体位置 .由于该基因是首次定位 ,暂定名为TMS .     

水稻半矮秆基因sd-g的精细定位

矮秆基因的发掘、研究和利用是水稻株型改良育种和植物生长发育分子生物学研究的重要基础. 利用新桂矮双矮与02428杂交产生的F₂群体对sd-g进行了精细定位. sd-g基因首先被定位在水稻第5染色体上微卫星标记RM440和RM163之间, 遗传距离分别是0. 5和2.5 cM. 为了进一步精细定位sd-g基因, 利用已经公布的水稻基因组序列, 在sd-g基因附近区域寻找微卫星序列并发展新的标记, 在RM440和RM163之间发展了9个微卫星标记. sd-g基因被进一步定位在SSR5-1和SSR5-51之间, SSR5-1与sd-g之间距0. 1 cM, SSR5-51与sd-g之间相距0. 3 cM, 而SSR418与sd-g表现为共分离. 以此为基础, 构建覆盖sd-g基因区域的BAC重叠群, sd-g基因被定位在AC105319约85 kb的区段上, 这为sd-g基因的图位克隆奠定了基础.     

水稻紫色种皮基因Pb的精细定位与候选基因分析

紫米因其种皮内花色素苷的沉积而着色．控制种皮着色的Pb基因位于水稻第4染色体，紫色种皮对白色种皮呈显性．本研究利用培矮64S（白米）×豫南黑籼糯（紫米）和培矮64S×川黑糯（紫米）两个F2分离群体对P易基因进行了精细定位．首先用SSR标记将P易基因初步定位在距微卫星位点RM3820下游0．79cM的位置．然后，通过在候选区域内发展高密度的InDel标记和CAPS标记，将P6基因限定在两个InDel标记RID3与RID4之间25kb范围以内．在该区段内，TIGR水稻基因组（R．5）标有两个注释基因：一个为与玉米k基因同源的砌，为控制花色素苷代谢的Myc类转录因子；另一个为与拟南芥刀四同源的bhlh16，也与植物色素代谢有关．根据两者的性质和前人相关研究结果，推测Pb与Ra实为同一个基因．序列分析结果表明，与白米品种培矮64S，9311（籼）和日本晴（粳）相比，豫南黑籼糯和川黑糯中Ra基因第7外显子存在一个GT缺失．根据GT缺失发展了一个CAPS标记CAPSRa，并对两个F2分离群体和100余份水稻品种进行分析．结果发现，所有F2白米单株以及所有白米（n=63）和红米（n=23）品种的CAPSRa基因型与培矮64S相同，而所有紫米品种（n=20）与豫南黑籼糯和川黑糯相同．据此推测，水稻紫色种皮性状可能由Ra基因第7外显子内的GT缺失引起．     

不对称体细胞杂交转移疣粒野生稻对水稻白叶枯病的抗性

疣粒野生稻(O. meyeriana (Zoll. etMor. exSteud.))对水稻白叶枯病具有高度的抗病性, 为转移这种抗病性, 进行了栽培稻+疣粒野生稻不对称体细胞杂交. 以软X射线处理过的疣粒野生稻原生质体作供体, 来源于栽培稻品种02428的原生质体经碘乙酰胺(IOA)失活后作受体, 采用PEG法诱导二者的原生质体融合. 由于代谢功能互补, 融合物经培养后得到623块愈伤组织, 最终分化出72株再生植株. 这些融合植株形态上与栽培稻接近, 采用微卫星分子标记进行了杂种鉴定. 细胞学分析表明, 融合杂种根尖细胞染色体数目在27~38条之间变化. 在成株期对融合植株进行了白叶枯病接种鉴定, 结果显示疣粒野生稻对水稻白叶枯病的抗性成功地转移到栽培稻中.     

水稻紫色种皮基因Pb的精细定位与候选基因分析

紫米因其种皮内花色素苷的沉积而着色.控制种皮着色的Pb基因位于水稻第4染色体,紫色种皮对白色种皮呈显性.本研究利用培矮64S(白米)×豫南黑籼糯(紫米)和培矮64S×川黑糯(紫米)两个F2分离群体对Pb基因进行了精细定位.首先用SSR标记将Pb基因初步定位在距微卫星位点RM3820下游0.79cM的位置.然后,通过在候选区域内发展高密度的InDel标记和CAPS标记,将Pb基因限定在两个InDel标记RID3与RID4之间25kb范围以内.在该区段内,TIGR水稻基因组(R.5)标有两个注释基因:一个为与玉米Lc基因同源的Ra,为控制花色素苷代谢的Myc类转录因子;另一个为与拟南芥TT8同源的bhlh16,也与植物色素代谢有关.根据两者的性质和前人相关研究结果,推测Pb与Ra实为同一个基因.序列分析结果表明,与白米品种培矮64S,9311(籼)和日本晴(粳)相比,豫南黑籼糯和川黑糯中Ra基因第7外显子存在一个GT缺失.根据GT缺失发展了一个CAPS标记CAPSRa,并对两个F2分离群体和100余份水稻品种进行分析.结果发现,所有F2白米单株以及所有白米(n=63)和红米(n=23)品种的CAPSRa基因型与培矮64S相同,而所有紫米品种(n=20)与豫南黑籼糯和川黑糯相同.据此推测,水稻紫色种皮性状可能由Ra基因第7外显子内的GT缺失引起.     

褐飞虱诱导的水稻RH3基因的克隆及其表达特性

组蛋白H3基因的表达与个体发育、细胞组织特异性以及胁迫反应等相关. 在褐飞虱取食后的水稻cDNA差减文库中筛选到编码水稻组蛋白H3(RH3)的EST(GenBank登录号: BU572343), 以该EST为探针, 从褐飞虱取食后的水稻cDNA文库中分离到RH3基因的全长cDNA. 该基因编码一个含136个氨基酸残基的H3蛋白, 与以前克隆出的一种抗病相关蛋白基因(GenBank登录号: AF467728)只有1个碱基的差异, 蛋白质的氨基酸序列第126位上由赖氨酸取代了天冬氨酸. 应用Northern blot技术, 研究了褐飞虱取食后不同时间段水稻RH3基因的表达水平, 同时分析了植物激素、干旱、盐胁迫及机械损伤等因素对其转录水平的影响. 结果表明, 褐飞虱取食8 h后RH3基因表达开始增强, 96 h后达到峰值. 干旱处理和稻瘟病菌接种能诱导RH3基因的表达增强, 而脱落酸处理则对该基因的表达起负调控作用. 利用RNA原位杂交技术, 对接种褐飞虱48 h后水稻的茎叶切片进行了RH3 mRNA的原位定位. 结果显示, 在褐飞虱取食后, RH3基因的转录本在维管束及短细胞中的积累尤其明显. 水稻组蛋白H3基因的表达与水稻对褐飞虱的应激反应相关.     

蛋白酶抑制剂mRNA在抗褐飞虱水稻中的原位定位

利用RNA原位杂交技术, 对抗虫水稻B5植株接种褐飞虱若虫72 h后的根、茎、叶组织切片进行了蛋白酶抑制剂基因(E61932)的原位定位. 结果显示, 在未接虫的材料中, 该基因在根、茎、叶等部位都有表达, 但表达水平很低; 褐飞虱取食后, 蛋白酶抑制剂基因在水稻茎、叶的薄壁组织中大量表达, 根中表达较弱, 说明受褐飞虱若虫取食诱导该基因表达上升.     

亚洲栽培稻与宽叶野生稻种间杂种的获得及其原位杂交分析

将亚洲栽培稻(Oryza sativa, 染色体组型为AA)与宽叶野生稻(O. latifolia, 染色体组型为CCDD)进行杂交, 结合胚拯救手段, 获得了这两个种的种间杂交种. 杂种F₁在株高、分蘖力、生长繁茂性等方面表现明显的杂种优势, 穗部性状明显偏向于父本宽叶野生稻的特征, 表现为长芒、小粒、大而外露的紫色柱头极易落粒. 根尖细胞染色体鉴定证明杂种染色体数为2n = 36. 进一步利用基因组原位杂交(genomic in situ hybridization, GISH)和荧光原位杂交(fluorescent in situ hybridization, FISH)技术, 鉴定了杂种F1的染色体组成及其在减数分裂中的配对行为. 结果表明, 杂种染色体的组成为ACD, 在减数分裂中, 绝大部分染色体以单价体形式存在, 很少有配对现象发生, 因而杂种表现完全雄性不育.