大鼠早期胚的快速冷冻保存

为建立大鼠胚胎冷冻保存库探索一种经挤有效的冷冻处理技术,本文着重探讨了两种不同的快速冷冻处理方法(1.把胚胎先在—30℃下保持60分钟后投入液氮;2.在液氮蒸气中停留5分钟后投入液氮)及四种不同的防冻液(添加2.8M甘油,0.5M蔗糖的PBS 20％大鼠血清或胎牛血清,生理盐水 20％大鼠血清或胎牛血清)对大鼠早期胚冷冻-解冻后发育率的影响。实验结果表明,在液氮蒸气中保持5分钟后投入液氮比在-30℃下保持60分钟的效果好,防冻液内添加胎牛血清(FCS)比大鼠血清(RS)效果好,PBS与生理盐水之间无明显差异。以含有2.8M甘油,0.5M蔗糖的PBS 20％FCS作为防冻液,用第二种方法进行冷冻处理的大鼠早期胚解冻后其发育率为81％,把用上述方法处理的135枚发育胚移植到17只受体鼠的子宫角内,有2只妊娠产仔4只。     

快速冷冻和解冻鼠胚的存活力

桑椹期鼠胚在1.0—2.5M 的二甲亚砜(DMSO)溶液中经三步程序快速冷冻到-196℃;试样在-4—-8℃诱异结晶,在-20℃的酒精浴槽保持10分钟,在—100℃液氮上垂悬10分钟,然后,立即放入液氮(—196℃)。在-20℃—-75℃之间降温速度为～17℃/分。快速解冻(360℃/分)在所有的 DMSO 浓度中培养48小时后发育到完整囊胚的比例高于慢速解冻(25℃/分)。在1.5—2.0M-DMSO 浓度中快速冷冻的胚胎获得最高的成活率(分别为36和53%)。经三步冷冻和快速解冻的胚胎用多种除去 DMSO 成分的方法进行试验。获得培养到完整囊胚的最好结果是在室温下在磷酸缓冲液(PBS) 2.0M-DMSO 0.5M 蔗糖溶液停留(2分钟),然后,在 PBS 0.5M 蔗糖溶液(2分钟)(82%)以及在30℃下分阶段稀释在 PBS 溶液中的胚胎(70%)。当胚胎快速冷冻并快速解冻后在培养液中培养到囊胚期的26个胚胎移植给2支受体得到11个仔鼠(42%)。     

小鼠胚胎快速冷冻方法的研究

3770枚小鼠胚胎随机分为以下12个试验组:三个不同浓度甘油(2.1、2.8和3.5M)分别与四个浓度蔗糖(0.25、O.5、0.75和1.00)配合成12种不同高渗快速冷冻液。通过对比筛选试验,对昆明小鼠的紧缩致密期早囊胚快速冻存试验.确定3.5M甘油和0.25M蔗糖混合成的快速冷冻液为最佳组合,用其处理的胚胎,经快速冷冻、解冻后。胚胎体外培养发育率最高,达84.3％,其中膨胀期和孵化期胚胎为78.3％,明显高于其它11种组合(P<0.01)。     

小鼠受精卵(胚)的快速冷冻法

<正> 在进行哺乳动物受精卵(胚)冷冻保存时,为了使冷冻装置简易化和缩短冷冻时间,进行了小鼠受精卵(胚)的快速冷冻实验。以甘油和蔗糖作为冷冻保护剂,将受精卵(胚)从室温直接移入液氮中,用超低温做瞬间冷冻。并对添加剂甘油和蔗糖的浓度与解冻后存活率的关系等方面进行了探讨。     

小鼠胚胎冷冻方法的研究

本试验共用小鼠胚胎7858枚,对冷冻-解冻小鼠胚胎过程中的一些环节进行了对比试验,结果表明,冷冻过程中诱发结晶温度最好为-7℃左右,致冷时间以15—20秒为宜。致冷时间过长或过短都会引起解冻后胚胎成活率的下降。将胚胎缓慢冷冻至—0——40℃再投入液氮可获得较理想成功率。而—25℃以前投入液氮的胚胎其解冻后体外发育能力明显不如—30℃以后投入者。将胚胎冷冻管投入液氮的方式,对解冻后胚胎的形态和体外发育能力均有显著影响。将胚胎冷冻管插入液氮深部的效果显著优于漂浮于液氮表面者。添加甘油的方法对解冻后胚胎的体外发育能力无显著影响,三步添加甘油和一步添加甘油的胚胎,在解冻后培养的发育率和膨胀率方面均无显著差异。脱除甘油的方法明显影响解冻后胚胎的体外发育能力,在1/3M蔗糖液中分步脱除甘油的方法。明显优于在0.5M蔗糖液中一步脱除法。缓慢冷却至—36℃投入液氮的胚胎,在30～35℃水浴中解冻后体外培养成活率最高,而在0℃,10℃和20℃解冻的胚胎成活率明显降低。     

二乙酰荧光素评估小鼠玻璃化冷冻胚胎活力试验

在形态学鉴定基础上，用二乙酰荧光素（ＦＤＡ）评估小鼠玻璃化冷冻胚胎的活力，并摒弃受损伤严重的胚胎，将活力较强的胚胎移植给受体，采用此法能得到较好的冻胚移植体内发育率，与鲜胚移植相比较无显著差异，冻胚解冻后只需２分钟便可鉴定出胚胎活力。     

牛体外受精卵的冷冻保存研究

将胚胎分别以PBS 20?S 10%乙二醇和PBS 20?S 10%甘油为冷冻保护液,或者在PBS 20?S 10%乙二醇中添加或不加蔗糖为保护液,用常规冷冻方法进行冷冻处理.胚胎保存1～18天后将其解冻,并在发育用培养液TCM199 10%OCS(发情母牛血清) 丙酮酸钠中培养48小时.结果表明解冻胚的形态正常率和培养后的发育率在乙二醇处理组和甘油处理组中分别为81.2%(13/19)、56.2%(9/16)和84.6%(11/13)、46.2%(6/13),两组之间无量著差异.在添加蔗糖和不加蔗糖的处理组中,胚胎解冻后的形态正常率和培养后的发育率分别为75.0%(15/20)、55.0%(11/20)和83.3%(15/18)、61.1%(11/18),两组之间也无明曼差异.试验结果证明,用乙二醇为防冻剂对牛体外受精胚胎进行冷冻保存,其效果相当于或略优于甘油,在乙二醇处理组中,添加蔗糖与否并不影响其冷冻效果.     

冷冻保存小鼠胚胎简易方法的研究

小鼠胚胎在冷冻保护剂二甲亚砜(DMSO)存在下,冷冻到-196℃,解冻以后可以存活。在无胚胎冷冻机的条件下,我们用简易冷冻装置,将不同胚龄的鼠胚放入其中,经缓慢降温后保存于液氮内。冷冻胚胎快速解冻后,胚胎回收率达67—79%。选择解冻后正常胚胎进行体外培养,48—72小时后能进一步发育为其存活标准,冷冻后胚胎存活率为66.07%。此方法简便易行便于推广。     

小鼠胚胎一步冷冻法的探讨

超排处理81只昆明小白鼠、把出现阴道栓的42只小鼠进行冲卵,得到301枚胚胎。选用205枚晚期桑椹胚进行一步法冷冻至-196℃,经37℃水浴中解冻后,回收胚胎202枚,回收率为98.5％。将解冻后形态正常的175枚胚胎,经过处理,放置在37℃的CO_2培养箱中进行培养。同时,又用64枚新鲜胚胎(晚期桑椹胚)、一并放入培养箱中进行培养。经过24小时的培养,取出镜检,经过冷冻一解冻后培养的胚胎,发育的有54枚,新鲜胚胎发育的有35枚,48小时后再次镜检结果。发育到囊胚的解冻胚胎仅有10枚,占5.7％。新鲜胚胎发育到囊胚的为9.4％。通过本试验证明:小鼠的晚期桑椹胚,经过一步法冷冻至-196℃。再经解冻后进行培养。是能够获得进一步发育的。     

奶牛胚胎简易快速冷冻及其移植试验研究

将7日龄的黑白花奶牛胚胎,采用简易冷冻仪,以液氮作冷冻源的快速冷冻、解冻法对胚胎进行冷冻.甘油作冷冻保护剂,以1℃/min的速度由室温降至-7℃,在-7℃下绣发结晶,并在-7℃下维持5分钟;又以0.3℃/min降到-10℃,最后以0.5℃/min速度降至-30℃,平衡10分钟后,胚胎直接投入液氮罐申保存。需移植时,直接在37℃温水中解冻。本试验解冻了25枚胚胎,取1,2级胚胎15枚,除去甘油后,将15枚胚胎用凯氏枪输卵器分别移植给15头同期受体的的母牛,现已产下3头牛犊.结果表明,采用简易冷冻仪、以液氮作冷冻源的快速冷冻、解冻的胚胎可以成活,且有利在生产实践中推广应用。     

绒山羊胚胎的体外培养,冷冻保存和移植的研究

采用体外培养和冷冻保存的方法将起排处理后的绒山羊２～８细胞期胚胎经体外在Ｍ１９９＋ＦＣＳ（对照组）、Ｍ１９９＋ＯＥＣ＋ＦＣＳ、Ｍ１９９＋ＯＥＣ＋ＥＮＧＳ和，Ｍ１９９＋ＯＥＣ＋ＮＳＳ的培养基中分别进行培养以后，选取发育为桑椹胚和早期囊胚期胚胎分别以１０％Ｇｌｙ、１０％ＥＧ为防冻剂和玻璃化方法进行冷冻保存，并将用常规和玻璃化法冷冻保存的胚胎解冻后进行移植．结果表明，体外培养胚胎的囊胚的发育率在四个培养处理组中分别为１２．５％、７０．６％、８１．８％和７３．９％，对照组与添加ＯＥＣ处理组之间具有极显著性差异（Ｐ＜０．０１），囊胚发育率在添加ＦＣＳ、ＥＮＧＳ和ＮＳＳ的实验组之间无明显差异．经冷冻保存的桑椹胚和早期囊胚的冷冻解冻胚的形态正常率在甘油、乙二醇和玻璃化三个冷冻处理组中分别为７５．０％、８６．７％和７５．０％，发育率分别为５８．３％、７８．８％和８０．０％．冷冻解冻胚的移植妊娠率在三个处理组中分别为５０％、７５％和５０％，产羔率分别为３０％、６８．８％和５０％．采用乙二醇冷冻绒山羊胚胎产生的效果优于甘油和玻璃化方法的冷冻效果。     

胚胎分割、分割胚的体外培养及移植

用玻璃微针对小鼠胚胎进行分割,分割的裸半胚经体外培养和移植到受体后,获得由半胚发育的仔鼠。小鼠早期胚胎(2细胞,8细胞阶段)在链霉蛋白酶中软化透明带后,用直径为0.5μm的玻微针徒手对胚胎进行切割。切割的半胚体外培养24～48h,观察半胚的活力、发育率、发育阶段及胚泡的大小与未切割的正常胚胎进行比较。共切割胚胎342枚,切割后成活的半胚为411枚,半胚成活率为60.08％(411/682)。2细胞和8细胞阶段切割的半胚,成活率分别为     

小鼠不同杂交组合胚胎玻璃化冷冻的研究

通过小鼠胚胎的毒性试验 ,确定对胚胎无毒性或毒性小的冷冻保护剂的种类、适宜浓度 ,以便达到提高冷冻解冻后的胚胎存活率的目的。用小鼠不同杂交组合胚胎进行玻璃化冷冻和解冻后 ,经体外培养观察胚胎的存活率和囊胚孵化率 ,确定了最佳的杂交组合     

实验小鼠胚胎冷冻技术实验研究

本文在建立和引进实验小鼠超排卵技术、卵采集技术、胚胎输卵管移植技术的基础上 ,应用小鼠初期胚的快速冷冻复苏法对实验小鼠C5 7BL 6J、BDF1 、A wy及昆明种小鼠进行了初期胚的冷冻保存与仔鼠存活率的研究 ,并将冷冻复苏胚与非冷冻胚经移植后的生存率作了比较 ,均取得了重复性的结果 ,可望为实验小鼠胚胎种子库提供参考依据。     

山羊胚胎的体外发育及冷冻保存研究

采用体外培养的方法，对山羊２～８细胞胚进行培养以后将体外发育至囊胚的胚胎进行冷冻保存，以便探讨山羊早期胚的体外培养方法和冷冻方法对体外发育胚冷冻效果的影响。将胚胎分别放入Ｍ１９９、Ｍ１９９＋输卵管上皮细胞和Ｍ１９９＋输卵管上皮细胞＋ＥＧＦ的培养液中进行培养，选取发育至囊胚期的胚胎分别以甘油和乙二醇为冷冻保护剂进行冷冻保存。结果体外培养胚的囊胚发育率在三个处理组中分别为１２．５％、７０．６％和７６．９％。使用Ｍ１９９处理组与添加输卵管上皮细胞、添加输卵管上皮细胞和ＥＧＦ的处理组之间具有极显著性差异（Ｐ＜０．０１）。冷冻解冻胚的形态正常率和发育率在以甘油和乙二醇为防冻剂的处理组中分别为６８．７、５８．３％和７８．６％、７２．８％。两组之间无明显差异，结果表明，采用与输卵管上皮细胞共同培养的方法能够提高山羊胚胎体外培养的发育率，以甘油和乙二醇为冷冻防冻剂均适合于山羊体外发育胚的冷冻保存，两者相比乙二醇的效果略优于甘油。     

七叶树种子离体胚的超低温保存

通过对七叶树种子离体胚超低温(-196 ℃)保存后生活力、相对电导率和脱氢酶活性的测定分析,初 步研究其长期保存的可行性。结果表明：含水率是影响七叶树种子离体胚超低温保存的重要因素,超低温 保存时应对种子进行适度脱水。超低温保存后,七叶树离体胚生活力最高为93 %,其处理组合中57.3 %含 水率+缓速冷冻+快速解冻+10 %二甲基亚砜+10 %蔗糖+20 %聚乙二醇为最佳处理方案。     

C57BL/6J胚胎冷冻小鼠的遗传监测和分析研究

目的用生化标记和微卫星检测法观察近交系C57BL/6J小鼠胚胎冷冻后的遗传质量是否发生改变。方法采用国标(GB/T 14927.1-2008)生化标记基因检测法对4只玻璃化冷冻、解冻移植后获得的C57BL/6J F1代小鼠的13个生化位点进行预检测,再根据微卫星DNA多态性的遗传监测方法进行多态性分析。结果4只玻璃化冷冻后移植获得的C57BL/6 F1代小鼠的遗传概貌与国标(GB/T 14927.1-2008)中的14个生化位点完全一致;并与本文作者已建立"几种常用近交系小鼠微卫星DNA多态性的分析研究"的遗传监测结果完全相符。结论玻璃化冷冻法(EFS40,straw)对C57BL/6J冷冻胚胎小鼠的遗传物质并未造成影响,其遗传特性保持稳定,是可行的小鼠胚胎冷冻方法。     

非极性表面活性剂对小鼠早期胚胎冷冻保护作用的初步研究

许多研究者报道了某些非极性表面活性剂在防止蛋白质低温冷冻变性方面有着明显的效果．本研究就某些非极性表面活性剂对胚胎的防冻作用作了初步探索．方法是分别将不同浓度的两种表面活性剂Ｐｏｌｙｓｔｅｎ２０（Ｐ２０）和ＳＹ－ｇｌｙｓｔｅｒＭＬ－７５０（ＭＬ７５０）添加于改进的磷酸缓冲液（ＰＢ１）和本研究采用的防冻液（ＦＳ：ＰＢ１＋３ｍｏｌ乙烯二醇＋０．２５ｍｏｌ乳糖）中，处理小鼠早期胚２０ｍｉｎ后培养并观察对胚胎发育的影响，以确定它们对胚胎的临界安全浓度（ＣＳＣ）．在ＰＢ１中，两种表面活性剂的ＣＳＣ值均为０．５％，而在ＦＳ中，则为０．０５％．然后将两种表面活性剂Ｐ２０和ＭＬ７５０分别以０．０５％和０．０３％两种浓度添加于ＦＳ中，以ＦＳ作为对照组．在室温下平衡处理小鼠桑椹胚和早期囊胚５ｍｉｎ后连同防冻液一起装入塑料冷冻细管中．在液氮蒸气（－１７０℃）中预冷冻１ｍｉｎ后即投入液氮内保存．在３８℃水浴中快速解冻并去除防冻剂后在Ｗｈｉｔｔｅｎ培养液中培养２４ｈ．分别观察和统计冷冻－解冻胚的形态正常率和发育率．结果表明：处理组与对照组在冷冻－解冻胚形态正常率方面无显著差异（Ｐ＞０．０５），而添加０．０３％Ｐ＿２Ｏ或ＭＬ７５０的两     

小鼠胚胎冷冻保存与移植

<正> 为了建立小鼠胚胎库,从1986年开始筹建实验动物低温生物学研究组,首先对小鼠胚胎冷冻保存与移植进行研究。两年多来,冻存小鼠胚胎取得成功,在冻存于-196℃液氮中,经10天至半年时间,解冻复苏后,形态学鉴定,其存活率可达58.99％。自从1972年D.G.Whittingham和I.Wilmut首先研究冷冻小鼠胚胎成功以后,     

影响玻璃化法冷冻保存胚胎的一些因素

探讨了用玻璃化法冷冻保存小鼠桑椹胚的一些影响因素。冷冻胚胎的保护剂采用性质较温和的甘油和1,2-丙二醇组成的玻璃化液,以37℃,体积分数5％CO2条件下能发育到囊胚期为保持正常生命力的指标。结果表明,玻璃化液中的甘油和丙二醇的浓度是冷冻保存胚胎的关键因素,而甘油和丙二醇比例对保存效果也有影响。在所用的不同组合的玻璃化液中,含2．5mol／L甘油和3．5mol／L1,2-丙二醇效果最好。0．25mL的冷冻管比0．5mL的效果更好。