鱼腥藻PCC 7120染色体上relBE同源基因的克隆及表达

为研究鱼腥藻PCC7120染色体上与relBE同源的基因asl4561和asl4562表达产物的毒素-抗毒素作用,从鱼腥藻细胞中提取总基因组DNA,设计特异引物PCR扩增目的基因asl4561和asl4562,与T载体连接后经XhoI和EcoR I双酶切并与表达载体pET28a（＋）连接,由IPTG诱导表达,并在IPTG浓度和诱导时间上对asl4561基因的表达条件进行了优化.琼脂糖凝胶电泳显示扩增出了264bp的asl4561基因和213bp的asl4562基因,SDS-PAGE检测表明成功表达出15.65kD和13.55kD的两蛋白,当诱导温度28℃、IPTG浓度0.4 mmol/L、诱导时间6h时,asl4561基因表达蛋白在细菌裂解液上清中表达量最大.     

鱼腥藻PCC7120质粒上毒素-抗毒素基因对alr9029/asr9028的初步研究

指出了大肠杆菌的毒素-抗毒素系统(TAs)能介导解离后致死机制维持细菌质粒的稳定性和参与环境胁迫诱导细菌生长抑制或死亡,在鱼腥藻PCC7120质粒上的基因对alr9029/asr9028具有与TA系统较高的同源性.为了证实该基因对属于TA系统,通过生物信息学分析了alr9029/asr9028的遗传结构,设计特异性引物,扩增得到大小为198 bp的asr9028和387 bp的alr9029.PCR产物经Bam H I和HindШ双酶切后被插入p MD18-T和p ET-30a中,依次构建克隆载体和表达载体.经SDS-PAGE电泳检测,含有His6标签的表达蛋白相对分子量分别为12.4k Da和19.2 k Da,且为可溶性蛋白.故初步认定asr9028为抗毒素基因,alr9029为毒素基因,二者共同构成一个TA系统.     

鱼腥藻PCC7120染色体基因对asr0757/alr0758的表达优化及其鉴定

NCBI预测鱼腥藻PCC7120染色体上的基因对asr0757/alr0758可能构成一个毒素-抗毒素系统.为研究其是否属于毒素-抗毒素系统家族,分别构建这两个基因的表达载体.用1.0 mM IPTG诱导重组菌表达,优化表达条件,并对表达出的蛋白进行纯化与western blot检测.SDS-PAGE结果显示：asr0757与alr0758在37℃下诱导6 h后,均成功诱导表达出目的蛋白asr0757(13.5 KD)和alr0758(17.9 KD).抗毒素表达量较好,毒素alr0758表达量较少.通过设置诱导时间梯度和IPTG浓度梯度优化毒素基因表达条件,优化结果显示：毒素基因alr0758在28℃,IPTG浓度为0.4 mM,诱导10 h时有最大表达量.蛋白纯化与western blot结果证实诱导表达的蛋白为目的蛋白.     

鱼腥藻PCC7120染色体MazEF同源基因对asr0757/alr0758的初步研究

鱼腥藻PCC7120染色体上的基因对asr0757/alr0758,经NCBI比对显示其与大肠杆菌中的毒素-抗毒素基因Maz EF具有较高的同源性,且具有毒素-抗毒素系统基因的保守遗传结构,为研究其是否属于Maz EF家族系统基因,构建同时含有asr0757和alr0758基因的双启动子选择性表达载体,先选择性诱导了该基因对的表达,再验证了其表达产物对细菌生长的影响.结果显示:成功诱导表达出了目的蛋白asr0757(13.5KD)和alr0758(17.5KD),当单独诱导asr0757基因表达时,细菌生长状况不受影响,单独诱导alr0758表达时细菌生长明显受到抑制,同时诱导asr0757和alr0758基因时细菌生长恢复正常,说明asr0757/alr0758构成具有生物功能的Maz EF家族系统基因对,具有毒性与抗毒性功能.     

鱼腥藻铁吸收调节蛋白基因(alr0957)的克隆和表达

依据CyanoBase提供的鱼腥藻PCC7120 furC基因(alr0957)的序列信息设计了一对特异性引物,用Touch-down PCR的方法从基因组DNA中扩增得到大小约450bp的目的片段.通过TA克隆的方法将该片段连接到pMD18-T载体上筛选出重组质粒pMD18-T-fur,然后进行双酶切,纯化furC基因,再连接到原核表达载体pET-28a(+)上,转化表达菌株BL21(DE3).经PCR、双酶切和测序鉴定,对阳性菌株进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测重组蛋白.结果表明:在25℃条件下经1mmol/L IPTG诱导20h,融合蛋白被成功表达,其分子量约为19 000,为进一步纯化蛋白和对基因的调控功能方面研究奠定了基础.     

鱼腥藻铁调蛋白基因(alr0957)表达和Fe~(3+)对藻生长的影响

根据CyanoBase提供的鱼腥藻PCC7120 FurC基因(alr0957)序列信息设计特异性引物,用降落PCR法从染色体DNA中扩增得约450 bp目的片段.运用TA克隆将其连接到pMD18-T载体上,经筛选测序获得阳性重组质粒.再经过双酶切、纯化FurC基因,连接原核表达载体pET-28a(+),并转化表达菌株BL21和IPTG诱导表达.经测序鉴定的阳性菌株中的FurC,运用SDS-PAGE检测重组蛋白,并利用镍柱层析法纯化目的蛋白.由藻细胞密度、叶绿素a含量、可溶性糖含量等改变探讨不同Fe3+浓度对藻类生长的影响.结果表明:在37℃经1 mmol/L IPTG诱导18 h,成功表达了分子量约为19000的融合蛋白.小于0.5mg/L Fe3+促进藻生长,大于0.9 mg/L Fe3+抑制藻生长,最适藻生长Fe3+浓度为0.5⁰.9 mg/L.     

大肠杆菌caiE基因的克隆与高效表达

用聚合酶链反应（PCR）从大肠杆菌K12s中扩增大肠杆菌肉碱代谢相关酶基因cai E,将其克隆到克隆载体pBluescripy SK中，测序表明：该基因有612bp，与文献报道相比，有10个核苷酸不同，相应的翻译氨基酸有6个相异，将该基因重组到ColE1为复制子，T7为启动子控制下的分泌型表达载体pET-22b( )中，构建表达质粒pETCaiE，重组到载体pACYC184中构建以p15A为复制子，Lac为启动子的表达质粒pACYC-CaiE；重组到载体pWSK129中，构建以pSC101为复制子，T7为启动子的表达质粒pSC-CaiE。上述表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），经1mmol/L异丙基硫代－β－D－半乳糖苷（IPTG）诱导后，均可表达，SDS－PAGE分析表明表达蛋白分子质量约26ku，表达量占菌体总蛋白质的比例分别为pETCaiE30%,pACYC-CaiE8%,pSC-CaiE5%。     

HPV16、18型E6/E7融合基因痘苗病毒表达载体的构建

目的:构建一种含人乳头瘤病毒(HPV)16型、18型E6/E7融合基因痘苗病毒表达载体.方法:PCR扩增HPV16型、18型E6、E7基因,克隆到pSC-A载体中,通过定点突变方法,分别构建成含E6/E7融合基因的质粒,即pSC-A.HPV16 E6/E7和pSC-A-HPV18 mE6/E7,并将二者连接成载体pSC-A-HPV16 E6/E7-HPV18mE6/E(pSC-T,HPV16 E6/E7-HPV18mE6/E7:T),最后以痘苗病毒表达载体pJ38为转移载体,构建质粒pJ38-HPV16 E6/E7-HPV18mE6/E7(pJ38-T),对所有重组质粒进行酶切鉴定和测序分析.结果:E6/E7融合基因成功克隆到pJ38上.结论:成功构建表达HPV E6/E7融合基因重组痘苗病毒载体,为研制宫颈癌治疗性疫苗奠定基础.     

all 1691基因表达及铁元素对鱼腥藻生长的影响

为实现FurA的表达,探究铁元素对藻生长的影响,首先运用Primer5.0设计引物,克隆出鱼腥藻PCC7120染色体上all1691(furA)基因片段;构建含组氨酸融合表达标签和T7启动子标签的表达载体.IPTG诱导FurA蛋白表达.然后设计不同Fe3+浓度梯度培养基,利用SDS-PAGE检测高、中、低Fe3+浓度培养液的藻细胞总蛋白,考马斯亮蓝g-250法测定蛋白含量,并用Trizol法提取不同Fe3+浓度培养的藻细胞总RNA.结果表明,获得纯化的all 1691克隆片段,大小为456bp,pET-1691重组蛋白在1mmol/L的IPTG诱导下,于37℃下摇床培养15h得到成功表达;低浓度Fe3+促进藻生长,高浓度Fe3+抑制藻生长;Fe3+浓度为2.0mg/L时rRNA位置与亮度清晰可见,而缺铁培养的藻生长几乎停滞,转录和翻译水平都很低.     

绵羊细粒棘球蚴Ag B基因的克隆、表达及其重组蛋白纯化

为克隆、表达绵羊细粒棘球蚴Eg Ag B基因,并纯化重组蛋白,采用PCR方法从绵羊肝脏包囊病料中扩增Ag B基因,克隆入p MD18-T载体中,测序后进行序列分析。将Ag B基因亚克隆入原核表达质粒p ET-28a中,转化入E.coli BL21感受态细胞中,用IPTG诱导Ag B蛋白表达,并对重组蛋白进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果显示:克隆的Ag B基因全长333 bp,通过SDS-PAGE可以检测到分子量为20 ku的特异性重组蛋白,与预期值相符;Western blot分析结果显示,该蛋白可与Eg阳性血清发生免疫学反应。本研究在大肠杆菌中成功表达的绵羊细粒棘球蚴Ag B蛋白,并证实其具有良好的反应原性,为绵羊细粒棘球蚴感染检测试剂的研发奠定了基础。     

植物无标记转化的诱导表达Cre/loxP重组系统的构建

应用Cre/loxP系统位点专一性重组的特点构建诱导表达的定位重组系统,用以特异性的敲除转基因植物的标记基因.为了获得诱导表达启动子,从大豆基因组DNA中用pfu酶克隆热激蛋白启动子gmhsp17.5c,将其克隆到pUC118-HincⅡ载体并测序.结果表明,508nt的gmhsp17.5c与已报道序列(GenBank,AF544399)比较,核苷酸的同源性为99.8%.利用该诱导启动子分别构建了含gmhs p17.5c-cre基因组件和gmhsp17.5c-gus基因组的诱导型植物表达载体pC23HC和pC23HG.此外1个含有loxP-gus-loxP组件的组成型植物表达载体pC23LG被构建.通过对3个植物表达载体做多重酶切及亚克隆后测序分析表明载体pC23HC全长10947bp,载体pC23HG全长11396bp,载体pC23LG全长11900bp,符合预期设计.一套由pC23HC和pC23LG组成的植物无标记转化的诱导表达Cre/loxP重组系统被构建,为进一步将诱导表达的标记基因删除系统用于植物的无标记转化奠定基础.     

纳豆激酶原基因的克隆及表达

从纳豆菌中克隆具有溶血栓性质的纳豆激酶原的基因，与质粒PBV220连接，转化大肠杆菌E.coli DH5α。挑取阳性克隆用EcoR I/BamH I双酶切鉴定得到一条约1000bp的条带。阳性克隆经温度诱导表达，用SDS－PAGE电泳鉴定，在38kD处有一条明显的带，占菌体蛋白的20％左右，同时还表明该蛋白以包涵体的形式蛋白分子量为存在。包涵体经收集、蛋白变性及复性后显示溶血栓活性。     

高致病性猪链球菌双组分系统Ihk/Irr双基因缺失突变株的构建

目的构建Ⅱ型猪链球菌05ZYH33菌株双组分系统Ihk/Irr的双基因缺失突变株.方法首先对双组分系统Ihk/Irr基因进行序列分析;选取Ihk/Irr基因的相关片段克隆至p ET30a表达载体,进行可溶表达并注射家兔制备抗体;分别将ihk基因上游irr基因下游各1 kb的片段扩增,将两个片段连接起来;克隆至温敏型p JRS233的穿梭质粒中;利用两步同源重组法获得突变体;分别提取突变株的基因组DNA,RNA及菌体总蛋白,利用PCR,RT-PCR,Western-blot方法验证突变体.结果成功制备了双组分系统Ihk/Irr可溶性表达的蛋白,成功构建了重组的温敏型ikr-p JRS233重组质粒,成功将重组质粒转入猪链球菌05ZYH33中并获得突变株,基因组PCR,RTPCR及Western-blot分别证实了双组分系统Ihk/Irr双基因被成功敲除.结论成功构建重组温敏型的穿梭质粒,导入到猪链球菌05ZYH33菌株中经两步同源重组获得突变株,在基因组DNA,RNA及蛋白水平上验证了双组分系统Ihk/Irr双基因缺失株的成功构建.     

牛病毒性腹泻病毒牦牛株E0基因生物信息学分析及原核表达与抗原性检测

为研究牦牛BVDV E0蛋白的生物信息学及抗原性, 本研究对本实验室克隆并测序的牦牛病毒性腹泻病毒E0基因进行了生物信息学分析;同时用含有酶切位点、起始密码子、终止密码子的引物重新扩增E0基因, 并连接PMD18-T载体, 经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后, 将获得的E0片段克隆至PET-28A原核表达载体, 构建重组质粒并转入JM109.酶切、质粒PCR鉴定正确后转入rosetta(DE3)菌进行诱导表达.经SDS-PAGE检测结果显示目的基因获得了较高的表达, 表达的融合蛋白约33ku, 经western-blotting检测表明目的蛋白具良好的有抗原性.     

毛囊特异表达载体pCDsR-UI的构建以及绒山羊胎儿成纤维细胞的体外转染和筛选

构建IGF1基因的毛囊特异表达载体,可为今后通过体细胞核移植技术建立转基因克隆绒山羊准备核供体细胞.将绵羊IGF1 cDNA序列,连接到含有UHS启动子序列的克隆载体p19TU的SalI、SphI位点,获得过渡质粒载体p19TUI;pCDsRed2和过渡质粒载体分别经酶切和连接构成表达载体pCDsR-UI.以组织块贴附法分离和培养绒山羊胎儿成纤维细胞,外源性表达载体以脂质体方法转染所培养的第2代成纤维细胞,DMEM/F12+ 10％ FBS、37℃5％CO2中培养,经添加G418筛选,获得了稳定表达红色荧光蛋白的细胞克隆,经特异性PCR鉴定证实外源基因已经整合在细胞基因组中.转基因前后分析细胞生长曲线和染色体核型证明转基因细胞的生长状态良好、各项参数正常.     

细粒棘球绦虫重组pET30a-EgA31疫苗的构建和诱导表达

克隆细粒棘球绦虫EgA31抗原基因,构建pET30a-EgA31原核表达载体,并在大肠埃希菌宿主系统中表达EgA31重组蛋白,对表达产物进行SDS-PAGE分析.从细粒棘球绦虫成虫组织中提取总RNA,反转录生成cDNA,以此cDNA为模板RT-PCR 克隆获得EgA31抗原基因,将其克隆至pUCm-T载体,测序确定其正确性.利用定向克隆技术将EgA31抗原基因片段克隆至原核表达质粒pET30a上,转化E coli DH5α,根据选择标记的卡那霉素抗性基因筛选到阳性克隆,通过PCR分析和酶切鉴定筛选出阳性克隆.IPTG初步诱导和表达pET30a-EgA31重组蛋白,SDS-PAGE电泳检测,并经凝胶图像分析确定目的蛋白的表达水平.测序表明选取的pET30a-EgA31阳性克隆均为正确连接EgA31抗原基因的重组质粒.经IPTG诱导后重组蛋白得到成功表达,在相对分子量约为31 kDa处有表达条带,表达量约占菌体总蛋白质的26%.成功克隆并构建了pET30a-EgA31原核表达质粒.初步诱导表达出EgA31重组蛋白,为进一步研究其免疫特性奠定了基础.     

藻红蓝蛋白连接/异构酶重组体系

把层理鞭枝藻藻红蓝蛋白操纵子A，E和F基因分别克隆在表达载体pET30中，转入大肠杆菌表达了相应蛋白质，利用pET3载体表达的蛋白质具有6个连续组氨酸亲和标记，用Ni^2 螯合亲和层析柱提纯了表达的蛋白质，用这些纯化的蛋白质建立了藻红蓝蛋白α亚基体外重组系统，从而证明藻红蓝蛋白操作子E和F基因编码层鞭枝藻红蓝蛋白为连接／异构酶。     

HIV-1复合多表位基因的原核表达和多克隆抗体制备

为表达HIV-1复合多表位基因并制备其多克隆抗体.设计引物,以HIV-1标准株全长cDNA序列为模板,PCR扩增获得p24基因片段;合成改造后的多个表位基因MEG并且与p24片段相连接,克隆入大肠杆菌.将测序正确的p24MEG基因克隆入原核表达载体pET32a并诱导表达.采用Ni2 -NTA亲和柱纯化目的蛋白,以p24抗体对纯化蛋白进行Western-blot分析.将纯化的融合蛋白免疫家兔制备多克隆抗体.通过PCR成功获得长度为651 bp的HIV-1的p24片段,获得了与多表位基因连接后的p24MEG基因,通过诱导表达,显示在相对分子量约45 000处有预计大小的特异性条带,表明成功表达出融合蛋白.经此纯化的融合蛋白免疫的家兔能产生特异性抗体,其滴度达到1:3 200.纯化的融合蛋白和多克隆抗体为研究新型HIV疫苗奠定一定的理论和实践基础.