一株盖姆斯木霉TW20050的鉴定及功能评价

明确木霉菌株TW20050的分类地位,并评价其生物学功能。通过形态学特征结合ITS、tef1及rpb2序列分析进行种类鉴定,利用菌丝生长速率法测定菌株的抑菌能力,利用透明圈大小定性检测菌株的水解酶活性。结果表明:菌株TW20050的形态学特征与Trichoderma gamsii一致,其ITS、tef1和rpb2序列与Trichoderma gamsii的同源性均达到99%以上,在以rpb2构建的系统发育进化树中,TW20050与Trichoderma gamsii strain S488[KJ665270.1]位于同一分支。菌株TW20050在PDA平板上对10种植物病原真菌均有抑制作用,对终极腐霉的抑制率最高,达92.0%。菌株TW20050具有蛋白酶、几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶及纤维素酶活性,其中蛋白酶活性和纤维素酶活性较高,透明圈宽度分别为9.8 mm和6.5 mm。综合形态学特征和序列分析,将菌株TW20050鉴定为盖姆斯木霉。菌株TW20050不但对植物病原真菌具有广谱抗性,而且具有多种水解酶活性,是一株较有潜力的生物防治菌株。     

木霉属中国新记录种Trichoderma paratroviride

从山东保护地土壤中分离得到木霉菌Y15,结合ITS、tef1 α和形态学特征进行鉴定。 结果发现Y15菌株为近深绿木霉（Trichoderma paratroviride）。该菌株在PDA上菌落稠密,老熟后毡状,灰绿色;分生孢子梗主轴长,着生短的二次分枝,再次分枝少,分枝成对或轮生。瓶梗通常2~4个轮状排列,烧瓶形或锥形,直或弯曲;分生孢子亚球形至卵圆形,绿色,光滑。tef1 α序列与近深绿木霉模式菌株S489和S385序列同源性高达99%,在系统进化树中与其亲缘关系也最近。该种在国内首次报道和描述,为木霉属中国新记录种。     

NaCl胁迫下哈茨木霉对黄瓜种子萌发的影响

从41个滩涂湿地样品中分离得到45株木霉菌株,并对得到的木霉菌株进行了平板耐盐实验和黄瓜种子发芽实验。结果表明,PDA平板中Na Cl浓度为0.4 mol/L时,供试菌株的耐盐率范围在17.9%~85.5%之间,大部分菌株的耐盐率在50.0%~80.0%之间,不同菌株的耐盐率存在显著性差异(p0.01),其中哈茨木霉TW20015和TW20239耐盐率最高,分别达到了81.6%和85.5%。通过黄瓜种子发芽实验表明,种子发芽率随Na Cl浓度的提高而降低;加入TW20015、TW20239后可以提高种子的耐盐阈值。在Na Cl浓度为20 mg/m L时仍有种子萌发,而对照组Na Cl浓度为16 mg/m L时已无种子萌发。2株木霉均提高了黄瓜种子的发芽率和芽长,其中TW20015效果更好。本实验为进一步应用木霉提高植物的耐盐能力奠定了基础。     

2株重寄生木霉菌丝生长的生物学特性

对2株茶藨生柱锈菌(Cronartium ribicola J.C.Fischer)重寄生木霉(Trichoderma spp.)TR1、TR2菌株菌丝生长及产孢条件进行单因素筛选及正交实验。结果表明：TR1菌丝生长速度快,且极易产生分生孢子;TR2菌丝生长速度相对较慢,产孢受一定条件限制。光照和VB2能明显刺激TR2分生孢子的产生。2株菌在以大麦粉、黄豆粉、KH2PO4、复合VB为培养基,5%接种量、120r／min、pH为 6的条件下菌丝生长最佳。TR1和TR2菌丝生长的最适温度范围及水势分别为25～30℃、-232MPa和20～25℃、-454MPa.     

木霉菌的形态学和可溶性蛋白质电泳鉴定与分类

对61株来自不同植物根际的木霉菌（Trichoderma spp.)进行了形态学鉴定，其中哈茨木霉菌（Trichoderma harzianum)有47株，绿色木霉菌（Tricoderma viride)10株，康宁木菌（Trichoderma koningii)和绿色木霉菌（Trichoderma virens)分别为两株，对这些菌株进行了可溶性蛋白质电泳分析，并采用UPGMA选取和类分析，结果表明，将距离系数D＝13.8作为聚类分析阈值，61个菌株可分为A，B，C三个组，距离系数D＝9．1时，A组可分为A1，A2，A3，A4，A5五个亚组，A组包括47株哈茨木霉菌，是主要成员。此外A组还有8株绿色木霉菌，两株绿木霉菌和一株康宁木霉菌，B组只有一株绿色木霉菌，C组由一株绿色木霉菌和一株康宁木霉组成，表明木霉菌具有明显的形态学多样性，而哈茨木霉是存在种下分类群，还发现蛋白质电泳分类结果与菌株的地缘有关。     

多功能植病生防木霉的分离筛选与鉴定

从采集的120份土壤样品中分离获得木霉244株。对峙培养发现其中对棉花立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）具有拮抗能力的有114株;固体培养检测木霉的解磷和固氮能力,发现所有菌株都能够水解植酸钙,有74株能够水解磷酸钙,未发现具有固氮能力的菌株。对抑菌圈和解磷圈最大的19株木霉在液体培养条件下检测了解磷和解钾能力,其中菌株T13—8（1．792μg／mL）、123（1．652μg／mL）显示出较高的解磷能力,部分菌株在液体培养条件下不能解磷;部分菌株在液体培养下显示出解钾功能,其中菌株T47-4（20．585μg／mL）显示出较高的解钾能力。上述19个菌株的形态学和ITS序列分析鉴定表明,其中9个菌株为Trichoderma longibrachiatum,8个菌株为rharzianum,另外2个菌株分别为rvirens和zcitrinoviride。     

松树两种病原菌拮抗微生物的筛选

采用组织分离法从健康的和感染松枯梢病的松树针叶上分离了叶栖微生物1 862株.选取有代表性的菌株通过室内平皿对峙培养,初步筛选出对松枯梢病菌和松赤枯病菌具有较好生防潜力的菌株12株.其中,拮抗细菌菌株6株、酵母菌3株、丝状真菌木霉(Trichoderma sp.)3株,拮抗效果由强到弱依次为细菌、木霉、酵母菌,细菌无菌滤液的拮抗效果明显好于菌体本身.拮抗菌的筛选以相对抑菌效果为准,同时应考虑被抑制率和菌种本身具有的致病性.     

拮抗灰霉病菌的低温型木霉菌株的分离鉴定

木霉是一种具有良好生防潜力和应用前景的灰霉病防治菌，但是目前的木霉菌株大多是在常温条件下筛选获得，造成其对冬季低温条件下发生的灰霉病防治效果较差.筛选鉴定耐低温且拮抗效率高的木霉菌株对低温地区灰霉病的防治具有十分重要的意义.采集冷凉地区的土壤样品，利用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基)在16℃低温条件下分离培养木霉，共获得88株具有良好低温适应性的木霉菌株；利用平板对峙法对这些木霉菌株在低温条件下拮抗灰霉病菌的效率进行了研究，获得3株高效拮抗灰霉病菌的木霉菌株J4-1,J4-5,C2-7;经分子生物学与形态学相结合的方法鉴定，J4-1为棘孢木霉(Trichoderma asperellum),J4-5为非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum),C2-7为拟康宁木霉(Trichoderma koningiopsis).获得的低温环境下高效拮抗灰霉病菌的木霉菌株将为北方冷凉地区植物灰霉病的防治工作奠定基础.     

哈茨木霉复合种内3个中国新记录种的分离和鉴定

采用THSM选择性培养基,从西藏、山东和云南等地的土壤中分离获得木霉菌株Z19、CX58-4 和CY358-5。通过形态学特征、ITS rDNA和TEF-1α序列对菌株进行鉴定。结果表明,3个菌株属于哈茨木霉(Trichoderma harzianum)复合种,分别是非洲哈茨木霉(T. afroharzianum)、深褐木霉(T. atrobrunneum)和西蒙斯木霉(T. simmonsii),均为木霉属中国新记录种。     

绿色木霉LTR-2的ATMT插入突变及5,6-二氢-6-戊基-2H-吡喃-2-酮高产菌株的筛选

通过土壤杆菌介导的T-DNA转化方法,利用土壤杆菌菌株携带的Ti质粒,对绿色木霉LTR-2进行插入突变,获得木霉LTR-2突变体共400株。以串珠镰孢菌为指示菌,采用抑菌圈方法,从中筛选吡喃酮高产突变体6株,PCR和探针杂交证实,T-DNA序列已经插入到木霉LTR-2基因组。经GC-MS分析发现,其中一株突变体T-54在PDA培养基上产生的吡喃酮含量较高,在分生孢子中的含量达到了2.62 mg/g,比出发菌株提高9倍。     

萘甲酰胺衍生物TW918的合成及体外活性考察

合成一系列萘甲酰胺衍生物,初步筛选出先导化合物TW918,测定其对肿瘤细胞的活性影响,考察其与激酶分子EGFR的结合性及对EGFR蛋白表达的影响.TW918结构经¹H-NMR,¹³C-NMR和HR-MS表征确证.实验结果表明:TW918对四种肿瘤细胞均有一定的抑制活性,但对正常细胞的影响较小;分子对接显示TW918能以母核喹啉为头,深入占据到EGFR的活性口袋中,并与活性残基形成氢键,其最低自由结合能为-46.1 kJ·mol^-1;TW918能以剂量依赖性方式明显抑制四种肿瘤细胞中EGFR蛋白的表达.     

绿色木霉TW-3菌株对绿豆立枯病的生物防治

通过盆栽和大田试验测定了绿色木霉(Trichoderma viride)TW-3菌株对幼苗期绿豆立枯病(Rhizoctonia solani)的生防效果,结果发现TW-3菌株可以有效防治绿豆立枯病,防治效果分别为87%～94%和81%～94%,优于多菌灵拌种的防治效果.利用平板法初步研究TW-3对绿豆立枯病菌的作用机制,发现TW-3菌株通过菌丝间缠绕,抑制绿豆立枯病菌的生长,表明重寄生作用在生物防治中具有重要作用.     

一株茶树内生放线菌的分离鉴定及抗菌活性测定

从茶树内生真菌芒果球座菌(Guignardia mangiferae)的菌落表面分离获得1株放线菌菌株BF-01,通过形态学观察和16S rDNA序列分析及抗菌活性测定,初步鉴定该菌株为卡伍尔链霉菌(Streptomycescavourensis).对其代谢产物进行了抑菌活性的初步研究,发现该菌发酵产物对除1株木霉外的7株茶树内生真菌及6株植物病原真菌均表现出不同程度的抑制作用.其发酵液氯仿萃取物对供试的5种病原细菌、1种白假丝酵母菌有较明显的抑制作用,对2种植物病原真菌的孢子萌发也有较强的抑制作用,表明菌株BF-01及其代谢产物具有广谱的抑菌活性.     

链霉菌S1的抑菌活性及其对植物病害的防治

摘要： 为了探明链霉菌S1的抑菌活性及其对植物病害的防控作用,通过抑菌圈法研究了链霉菌S1对不同病原菌的抑制作用并分析了菌株S1是否合成几丁质酶和葡聚糖酶,筛选了菌株S1的最佳发酵培养基、发酵时间和最佳接种量,进一步优化发酵培养条件。通过温室防效实验,研究了链霉菌S1发酵液对桃核腐病和番茄根结线虫的防治作用。结果表明：链霉菌S1对多种病原菌有较好的抑菌作用,其中对桃褐腐病原真菌（Monilinia fructicola）和平菇褐斑病原细菌（Pseudomonas tolaasii）的抑制效果最佳。菌株S1能够合成几丁质酶,不能合成葡聚糖酶。链霉菌S1的最佳发酵培养基为G117,最佳发酵时间为3 d,最佳接种量为8%。链霉菌S1的发酵上清液和发酵液对桃核腐病具有显著的防治作用,防效可到达80.66%。发酵代谢产物对番茄根结线虫的杀线活性最高可达90%,发酵原液对番茄根结线虫的防治效果最高到达71.02%。可见链霉菌S1具有较好的防治作用,为植物病害生物防治提供了优良的菌种资源。     

防治西洋参立枯病木霉菌株的筛选鉴定及其小区防治效果

摘要：利用平板对峙实验及小区试验,筛选高效防治西洋参立枯病的木霉菌株,并采用ITS（internal transcribed spacer)序列分析与形态学特征相结合的方法进行种类鉴定。结果表明,供试木霉菌株在PDA平板上对立枯丝核菌(R. solani)均有抑制作用,菌株HB20111效果最好,抑制率达99.33%;菌株HB20111对西洋参立枯病的小区效果显著,与其他处理间存在显著性差异(P<0.05);第1年拌种处理对西洋参立枯病的防治效果、单株参增重率及总参增重率分别达71.81%、33.54%和92.75%;第2年蘸根处理对西洋参立枯病的防治效果、单株参增重率及总参增重率分别达91.04%、158.06%和1 369.34%;菌株HB20111的分生孢子梗为典型的单侧分枝,其他形态学特征同深绿木霉(T. atroviride)一致,ITS序列与T. atroviride同源性达100.0%,将菌株HB20111鉴定为T. atroviride。HB20111生长速度快,产孢能力强,生防效果高,有望替代化学杀菌剂应用于西洋参种植中。     

表面活性剂和促进剂对重组里氏木霉生物合成t-PA的影响

重组里氏木霉(Trichoderma reesei)是染色体上整合有组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)cDNA的基因工程菌株.对高产t-PA的重组里氏木霉菌株进行了筛选,并研究了乙酸钠和抗坏血酸(Vc)等促进剂及曲拉通(Triton100)、吐温80(Tween80)、十二烷基磺酸钠(SDS)和蔗糖酯等表面活性剂对菌株生物合成t-PA的影响.结果表明:乙酸钠能促进t-PA的生物合成,在发酵培养基中,其浓度为0.1%时,酶活可提高36.42%;吐温80对t-PA的合成有促进作用,其浓度为0.1%时,酶活可提高82.04%;抗坏血酸也可促进t-PA的合成,其浓度为0.05%时,酶活可提高124.82%;曲拉通和十二烷基磺酸钠加入时完全抑制t-PA的合成;蔗糖酯对t-PA的合成有部分抑制作用.     

棉花黄萎病菌拮抗木霉的筛选及其抑菌机制的研究

从实验室保存的8株高产胞外细胞壁降解酶的木霉菌株中筛选到一株对棉花黄萎病茵具有强烈抑制作用的木霉菌株SMF5．对其作用机制的研究表明,SMF5对棉花黄萎病茵的作用机制包括生境竞争、产生耐热代谢产物、产生细胞壁降解酶等．     

绿色木霉EG Ⅲ基因的克隆及其在工业酿酒酵母中的整合表达

通过RT-PCR从绿色木霉AS3.3711中克隆得到EG Ⅲ基因,序列分析显示该基因编码序列全长为1 257 bp,编码418个aa,且自身带有21个aa的信号肽序列,与里氏木霉eg3的同源性为99.6%.将该基因连入酿酒酵母多拷贝整合型表达载体pScIKP中获得重组质粒,线性化后电转化酿酒酵母工业菌株AS2.489,通过SDS-PAGE蛋白电泳、刚果红染色和酶活测定对转化子进行了分析.结果表明:转化子有明显的重组EG Ⅲ表达带,能够产生CMC水解圈,说明eg3基因已在酿酒酵母中获得了正确的分泌表达,表达EG Ⅲ的重组菌产酶高峰出现时间为60 h,最高酶活接近120 U/mL,重组酶EG Ⅲ的最适温度为60 ℃,最适pH为6.0,转化子的遗传稳定性达到99.17%,实现了绿色木霉eg3基因在工业酿酒酵母中的稳定高效表达.     

绿色木霉EG III基因的克隆及其在工业酿酒酵母中的整合表达

 通过RT PCR从绿色木霉AS33711中克隆得到EG III基因,序列分析显示该基因编码序列全长为1 257 bp,编码418个aa,且自身带有21个aa的信号肽序列,与里氏木霉 eg3 的同源性为99.6%。将该基因连入酿酒酵母多拷贝整合型表达载体pScIKP中获得重组质粒,线性化后电转化酿酒酵母工业菌株AS2489,通过SDS PAGE蛋白电泳、刚果红染色和酶活测定对转化子进行了分析。结果表明：转化子有明显的重组EG III表达带,能够产生CMC水解圈,说明 eg3 基因已在酿酒酵母中获得了正确的分泌表达,表达EG III的重组菌产酶高峰出现时间为60 h,最高酶活接近120 U/mL,重组酶EG III的最适温度为60 ℃,最适pH为6.0,转化子的遗传稳定性达到99.17%,实现了绿色木霉 eg3 基因在工业酿酒酵母中的稳定高效表达。     

转几丁质酶基因烟草对三种真菌拮抗作用的研究

几丁质酶广泛存在于高等植物体内,它可以分解真菌细胞壁中的几丁质,破坏其细胞结构,从而获得对真菌的抗性.试验以转苦瓜几丁质酶基因烟草(T-Chit)为供试植物,测定植株根系和叶片内几丁质酶活性,选取了3种具有代表性的真菌:毛霉、木霉、禾谷镰刀霉,通过抑菌试验验证了T-Chit组织萃取液对真菌的抗性.结果表明:1)T-Chit几丁质酶活性显著高于非转基因烟草(Nt-X),且转基因烟草根系几丁质酶活性比叶片高86%;2)T-Chit组织萃取液对毛霉生长具有明显抑制作用,根系强于叶片;3)T-Chit对木霉和禾谷镰刀霉的抑制具有时空效应:抑菌效果与植株部位及作用时间有关.