里氏木霉几丁质酶基因的克隆及其同源转化研究

丝状真菌里氏木霉(Trichoderma reesei)外切几丁质酶具有β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性.根据里氏木霉基因组数据库获得了一个编号为21725的外切几丁质酶nagl基因序列,根据检索结果,从里氏木霉QM9414基因组DNA中克隆获得1.9kb的基因片段.构建了以cbhl为启动子和终止子的重组质粒pCbhNag,与含有pyr4基因的质粒pSKpyr4共转化里氏木霉pyr4缺陷株RutC30△U3.共得到99个转化子,初筛得到5株乙酰氨基葡萄糖苷酶酶活较高的转化子,其中N3菌株的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶酶活可达26.65 U/mL,而出发菌株的胞外几丁质酶几乎无酶活.成功实现了里氏木霉几丁质酶的克隆及同源表达.     

木霉对棉花枯萎病菌和黄萎病菌的作用机理

木霉对棉花枯萎病菌(Fumrium oxysporum f.sp.Vasinfectum)的幼菌丝具有强烈的寄生能力,对于老熟菌丝的寄生能力较弱。木霉能够产生琼脂扩散性和挥发性抑菌物质。绿色木霉LTR-2产生的挥发性抑菌物质能强烈抑制棉花枯萎病菌的菌丝生长。木霉生物防治作用的另外一种方式是与病原菌竞争营养物质,研究发现葡萄糖是竞争对象之一。木霉具有很强的β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶活性。培养液中添加几丁质、木霉菌或者棉花枯萎病菌菌丝干粉后培养木霉,培养液上清能够破坏枯萎病菌的菌丝尖端并导致原生质体的泄露,该现象主要与木霉的几丁质酶活性有关。木霉对棉花黄萎病菌具有相同的作用方式。     

木霉菌平板抗菌、几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活性与病害防治效果

对60株分离自不同植物根际的木霉菌菌株(包括哈茨木霉菌，绿色木霉菌，康宁木霉菌和绿木霉菌)进行了平皿对峙试验、测定了几丁质酶和β1，3-葡聚糖酶活性。所有菌株在这三个指标上均表现出明显的差异。选择38个抑菌能力、几丁质酶和β1，3-葡聚糖酶活性不同的菌株进行的盆载试验表明，所有菌株对棉花立枯病都有防治效果，但不同菌株的防治效果差异显著。相关性分析表明，木霉菌防治棉花立枯病的效果与平皿对峙抑制率，几丁质酶和β1，3-葡聚糖酶活性间没有数量上的相关关系。     

石斛共生真菌木霉菌拮抗作用的初步研究

为探讨拮抗真菌及其次生代谢产物对石斛病原菌生长的影响,从药用植物石斛中分离、鉴定和筛选出对常见病原真菌镰刀菌(Fusarium)有拮抗作用的木霉菌(Trichoderma).通过平板对峙培养,观察其对镰刀菌生长的影响;通过几丁质水解圈实验,检测木霉几丁质酶的活力.该研究所筛选获得的木霉生防菌株,可应用于石斛的栽培管理,...     

木霉菌的几丁质酶与植病生防

木霉菌的几丁质酶是其防治植物真菌性病原菌的主要机制之一，它能降解真菌的细胞壁。木霉菌的几丁质酶具有结构和编码基因多样性。已经纯化的木霉菌几丁质酶有内切和外切几丁质酶，壳二糖酶和N—乙酰—β—D—葡萄糖胺酶。已经克隆的有编码33和42—KDa内切几丁质酶和编码73—KDa的N—乙酰—β—D—葡萄糖胺酶基因。42—KDa内切几丁质酶是目前研究最多的，已经用于转基因植物的培育；对它的表达和调控也有部分了解。     

农杆菌介导的抗病基因对番茄的遗传转化

通过农杆菌介导法将含有几丁质酶基因和β-1,3-葡聚糖酶基因的双价植物表达载体pBLGC转入番茄子叶外植体。经过共培养、卡那霉素筛选和分化再生,获得了23株卡那霉素抗性植株。PCR检测和Southern Blot检测结果表明,有7株呈阳性检测反应。通过病原真菌接种试验证明,有3株转基因植株表现出较强的抗病性反应。实验结果为进一步研究番茄抗病性和培育抗病番茄新品种奠定了重要基础。     

木霉菌生防作用的生化机制研究进展

木霉菌生防作用的生化机制主要包括:代谢几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶、蛋白酶等多种胞外酶,强烈水解植物病原真菌的细胞壁,或使真菌细胞壁释放出诱导物(elicitor),启动植物的防御反应;代谢产生戊酮、辛酮、萜类、氨基酸衍生物、木霉菌素、胶霉毒素、绿木霉素、抗菌肽等抗菌素类物质;产生植物防御反应的诱导因子,诱导植物抗性;增强植物组织过氧化物酶、超氧化物歧化酶与过氧化氢酶、多酚氧化酶活性,保护膜脂不被氧化;产生毒性蛋白,或以多种机制的协同拮抗作用,抑制病原菌生长与繁殖.     

植物组织培养中真菌污染防治方法研究

通过对组培接种室空气中真菌的分离和鉴定,发现曲霉(Aspergillus),毛霉(Mucor),青霉(Penicillum),木霉(Trichoderma),根霉(Rhizopus)等常见菌为组培的主要污染真菌.抑菌环实验表明次氯酸钠与制霉菌素抑菌效果较好.50mg/L酮康唑 50mg/L制霉菌素 0.1%次氯酸钠组成的混合杀菌剂,抑菌效果好,对植物伤害小,是良好的防真菌污染添加剂.     

过氧化物酶活性与烟草脉坏死病抗性的关系

测定了接种马铃薯Y病毒脉坏死株系后转PVY－N1b基因的抗性烟草NC89和非转基因敏感烟草NC89的叶片组织透性和过氧化物酶活性,并对过氧化物酶同工酶进行了电泳分析,结果表明：抗、敏烟草叶片的组织透性与叶片内过氧化物酶活性的变化趋势一致,两者在接种后均呈增高趋势,且敏感烟草的增高幅度明显高于抗性烟草;接种后,两者的过氧化物酶同工酶均出现了一条新酶谱,抗性烟草植物的新酶带在接种后第2天开始出现,而敏感烟草的新酶带则在接种后第6天开始出现,且活性明显强于抗性烟草。     

酿酒葡萄内生真菌群落及抗菌活性测定

从酿酒葡萄(Vitis vinifera.L)植株的各组织中共分离得到462株内生真菌,通过形态鉴定、排重、按比例缩取从中选取出64株内生真菌.采用ITS排序、系统树构建的方法对64株真菌的种属地位及发育关系进行了研究,并对植物病原真菌生长抑制能力进行了测定.系统发育树分析表明酿酒葡萄内生真菌分布于20个属,其中交链孢霉(Alternaria)17.24%,青霉(Penicillium)15.52%,镰刀菌(Fusarium)10.34%,曲霉(Aspergillus)、Discostroma、赤霉菌(Gibberella)、Passalora、Pestalotiopsis各5.17%,交链孢霉、青霉、镰刀菌是其中的优势种群.对植物病原真菌有抗性的菌株分布于15个属,其中镰刀菌属的6株菌对3种指示菌均有抑制作用,镰刀菌是酿酒葡萄植株主要抗植物病原真菌的活性物质来源之一.     

日本亮耳菌对植物病原真菌的拮抗试验

 首次报道了日本亮耳真菌对植物病原真菌的拮抗活性.结果表明:除对竹荪疫霉(Phytophthora sp.)的拮抗方式是菌丝缠绕作用外,该菌株的菌丝体及其发酵液滤液对灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、尖镰孢菌(Fusarium oxysporum)、绿色木霉(Trichoderma viride)、烟草疫霉(Phytophthora nicotianae)和稻瘟病菌(Pyricularia oryzae)均有很强的拮抗活性.     

云南烟草根结线虫拮抗真菌分离鉴定初报

 从云南省28个县采集152个土样及发病烟根,利用直接分离法和诱集分离法分别从根结线虫卵囊、卵、雌虫和幼虫分离到400株拮抗真菌,它们包括拟青霉属、镰刀菌属、普可尼亚属、木霉属、链格孢属、曲霉属、青霉属、柱孢菌属、茎点霉属、单顶孢属、钩丝孢属、节丛孢属、矛束孢属等21属及一些不产孢的拮抗真菌,其中淡紫拟青霉、厚垣孢普可尼亚菌、尖孢镰刀菌为分离频率最高,约占分离数的60%.卵囊、卵和雌虫寄生真菌种类和数量远远大于二龄幼虫寄生真菌种类和数量,不同县寄生真菌种类和数量差异较大.     

库拉索芦荟抑菌效果研究

研究了库拉索芦荟提取液对食品中常见的污染菌:大肠杆菌、青霉、根霉、曲霉、毛霉的抑制作用.研究结果表明:用不同的方法对大肠杆菌做抑菌实验,抑菌效果差别较大.滤纸片法的效果最不明显,而管碟法和实验中的新方法效果很明显;用滤纸片法和管碟法对霉菌做抑菌实验效果不明显,而用平板对峙培养法对霉菌进行抑菌实验效果明显.库拉索芦荟提取液对曲霉、毛霉、青霉都有一定的抑制作用,而对根霉的抑制作用不明显,且芦荟叶皮汁比凝胶汁的抑菌作用强,经高温处理的芦荟汁的抑菌能力无明显变化.     

青葙根水提物化感活性及抑菌活性的研究

以水稻(Oryza sativa L.)等5种植物和油菜菌核病(Sclerotinia sclerotiovum(Lib)de Bary)等4种植物病原病菌为受试材料,通过生物测定的方法研究了青葙(Celosia argenteas Linn.)根水提物化感活性及抑菌活性。结果表明,与对照相比,在250～4 000μg/mL浓度范围内,提取物对稗草(Echinochloa crusgalli(L.)Beauv.)和醴肠(Eclipta prostrate L.)种子的萌发,水稻和稗草幼苗苗高,烟草(Nicotiana tabacum L.)和醴肠幼苗的单株鲜重不产生显著影响,而在相同的浓度范围内,对千金子(Leptochloa chinensis(Linn.)Nees)幼苗的根长和单株鲜重产生显著抑制作用。对5种植物相对应的其它生长特性方面,只有在高于250μg/mL浓度时才能受到显著抑制。在25～400μg/mL的浓度范围内,提取物对油菜菌核病、小麦赤霉病(Fusarium graminearum Schw.)和杨树溃疡病(Dothiorella gregaria Sacc.)病菌的生长产生显著抑制作用,当浓度达到50μg/mL时,提取物也显著抑制烟草灰霉病(Botrytis cinerea Pers.)病菌的生长,400μg/mL时,对4种植物病原真菌的抑制率分别为45.90%、46.49%、45.64%和41.66%。上述表明,青葙根水提物具有开发为生物源农药的潜力。     

松材线虫病死木中真菌和细菌的分离

从来自江苏省和浙江省几个疫区的松材线虫(PWN)病病死木的木质部中分离出111个真菌菌株，经鉴定种类为木霉(Trichoderma spp．)、轮枝霉(Verticillium spp．)、青霉(Penicillium spp．)、镰孢霉(Fusarium spp．)、曲霉(Aspergillus spp.)、毛壳菌(Chaetomium spp．)、茎点菌(Phoma spp．)、短梗单孢霉(Dicoccum sp．)、头孢霉(Cephalosporium sp．)、交链孢霉(Alternaria sp．)，这些真菌约占分离真菌总数的60％；在43％的未鉴定菌中，除3个菌株为有孢菌外，其余均是无孢菌。可以分离出真菌的病死木占56．42％，从病死木中可分离出细菌的比例达86％，可同时分离到真菌和细菌的比例为43．6％。     

一株生防烟管菌几丁质酶表达及抗真菌活性

为了探究烟管菌BK-1的生物防治潜力,本研究测试了一株具有生防菌活性的烟管菌BK-1的抗病效果,并使用RT-qPCR分析了该菌株的8个细胞壁裂解酶基因在与不同病原真菌对峙培养中的表达水平,结果表明,在应对链格孢、茄链格孢、尖孢镰刀菌和灰葡萄孢这4种病原真菌时,几丁质酶基因BaCHIB表达上调了27.3至50.3倍,远高于其他7个基因.BaCHIB属于糖苷水解酶18家族(GH 18),并具有Chic_BD结构域,属于B类几丁质酶(CHIB).结合基因表达谱分析,该基因诱导表达上调情况的出现与抗病效果的出现高度同步.外源表达蛋白BaCHIB显示出较高的几丁质酶活性,且表现出对多种植物病原真菌,包括链格孢,链格孢和灰葡萄孢显著的抗真菌活性,显示其对部分病原真菌具有拮抗能力.     

真菌对重金属Pb(Ⅱ), Cd(Ⅱ), As(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)耐受性的比较研究

从两种不同土壤环境中筛选获得19 株真菌, 并对其重金属耐受性进行比较分析。其中, 从重金属污染严重的湖南水口山有色金属矿区土壤中筛选获得17 株真菌, 经鉴定分别属于曲霉属、木霉属、青霉属和镰孢属; 从重金属污染较轻的廊坊经济开发区绿化用地中筛选获得2 株真菌, 经鉴定均为黑曲霉。研究重金属对不同土壤环境中分离的真菌的最小抑制浓度(MICs), 分析菌种、生存环境、重金属浓度等因素对真菌重金属耐受性的影响, 探讨真菌耐受高浓度重金属的机理。研究表明, 从矿区分离获得的真菌中, Aspergillus niger PTN84 等可耐受144 mmol/L Pb(Ⅱ), A. terreus PTN21, A. flavus PTN29 和Trichoderma asperellum PTN1 可耐受36 mmol/L Cd(Ⅱ), Fusarium sp. PTN12, A. terreus PTN21 和T. asperellum PTN1 可耐受36 mmol/L Cu(Ⅱ), Fusarium sp. PTN12 可耐受72 mmol/L As(Ⅲ), 整体上其重金属耐受能力高于文献报道的菌株, 在重金属土壤修复方面具有潜在的应用价值。     

利用根癌农杆菌介导的转化方法改良木霉菌

根癌农杆菌介导的转化系统在丝状真菌的研究中具有重要的意义。通过农杆菌介导,成功实现了丝状真菌绿色木霉菌(Trichoderma viride)遗传转化,转化率约为30～80个转化子／10^5个孢子。PCR检测和几丁质酶分析表明含有编码几丁质酶外源基因(Cli 113)的T-DNA已整合进木霉菌基因组中,而且转化子都能够稳定遗传。农杆菌介导的遗传转化方法具有转化率高、操作简便、遗传稳定等优点,在丝状真菌的遗传转化中具有重要的意义。