根癌农杆菌介导的丝状真菌简青霉遗传转化的研究

利用根癌农杆菌LBA4404介导,建立了丝状真菌简青霉(Penicillium simpli-cissimum)H5的遗传转化系统.潮霉素抗性筛选、PCR和Southern blot分子鉴定等结果表明:筛选获得的转化子能够稳定遗传,外源的T-DNA以单拷贝随机整合到简青霉的基因组中.实验初步研究了农杆菌浓度、乙酰丁香酮浓度和共培养时间等因素对转化效率的影响,经过优化后转化体系的效率可达50个转化子/105个孢子.农杆菌介导的遗传转化方法在简青霉上的运用,将为研究该菌的基因工程改造提供强有力的工具.     

根癌农杆菌介导的木霉插入转化及其应用

根癌农杆菌介导的遗传转化法(ATMT)已广泛地应用于真菌的转化研究,该方法具有操作简单、转化效率高和转化子遗传稳定等特点。木霉作为土传植物病原菌的重要生防真菌,对其生防分子作用机制方面的研究也越来越受到关注,目前所面临的问题是如何基因突变和基因替换。ATMT法为木霉(Trichodermaspp.)的分子生物学研究提供了一个强有力的工具,在木霉的插入突变、遗传转化以及基因标记和克隆方面起着重要的作用。本文综述了根癌农杆菌介导木霉遗传转化的原理、特点、转化方法和应用,并且对有关发展趋势进行了展望。     

里氏木霉几丁质酶基因的克隆及其同源转化研究

丝状真菌里氏木霉(Trichoderma reesei)外切几丁质酶具有β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性.根据里氏木霉基因组数据库获得了一个编号为21725的外切几丁质酶nagl基因序列,根据检索结果,从里氏木霉QM9414基因组DNA中克隆获得1.9kb的基因片段.构建了以cbhl为启动子和终止子的重组质粒pCbhNag,与含有pyr4基因的质粒pSKpyr4共转化里氏木霉pyr4缺陷株RutC30△U3.共得到99个转化子,初筛得到5株乙酰氨基葡萄糖苷酶酶活较高的转化子,其中N3菌株的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶酶活可达26.65 U/mL,而出发菌株的胞外几丁质酶几乎无酶活.成功实现了里氏木霉几丁质酶的克隆及同源表达.     

农杆菌介导抗虫基因转化芥菜型油菜的研究

用农杆菌介导法对芥菜型油菜进行了转化，并对影响根癌农杆菌转化效率的因素进行了研究，建立了以油菜子叶柄为外植体的转化体系．用携带蝎毒素(BmKITs)和几丁质酶(chi)双价基因的农杆菌转化油菜，共获得了抗卡那霉素的再生苗153株，移栽成活21株．对成活植株进行了PCR分子检测，证实有外源基因的整合．转基因植株形态正常，开花、结实．     

农杆菌介导的小麦成熟胚愈伤遗传转化研究进展

小麦是中国重要的粮食作物之一.传统的育种方法存在周期长、改良慢等缺点,基因工程育种现已成为小麦遗传改良的研究热点.因此,小麦成熟胚愈伤组织的遗传转化在小麦遗传改良研究中具有重要意义.农杆菌介导的小麦成熟胚愈伤组织的遗传转化以其自身具有的优势,得到了广泛的关注.介绍了农杆菌介导的小麦成熟胚愈伤遗传转化体系的各种影响因素,如小麦愈伤组织的诱导、分化、转化效率、农杆菌菌株和转化载体等,并对小麦成熟胚愈伤组织遗传转化的发展方向进行了展望.     

木霉菌平板抗菌、几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活性与病害防治效果

对60株分离自不同植物根际的木霉菌菌株(包括哈茨木霉菌，绿色木霉菌，康宁木霉菌和绿木霉菌)进行了平皿对峙试验、测定了几丁质酶和β1，3-葡聚糖酶活性。所有菌株在这三个指标上均表现出明显的差异。选择38个抑菌能力、几丁质酶和β1，3-葡聚糖酶活性不同的菌株进行的盆载试验表明，所有菌株对棉花立枯病都有防治效果，但不同菌株的防治效果差异显著。相关性分析表明，木霉菌防治棉花立枯病的效果与平皿对峙抑制率，几丁质酶和β1，3-葡聚糖酶活性间没有数量上的相关关系。     

棉花黄萎病菌遗传转化载体构建和农杆菌转化

载体构建是建立真菌遗传转化体系的基础。本研究以pCAMBIA1305.1双元载体为基本骨架,构建棉花黄萎病菌遗传转化T-DNA质粒双元载体,通过限制性内切酶酶切、补平、连接以及去磷酸化等措施将pCAMBIA1305.1上Hygromycin抗性基因的CaMV 35S启动子替换成构巢曲霉的trpC启动子。经大肠杆菌转化后对转化子进行酶切验证,并将新构建的载体1305-3分别转入农杆菌菌株LBA4404和EHA105。为农杆菌介导的黄萎病菌遗传转化体系的建立和优化提供了存在于不同农杆菌菌株中的供试载体。     

根癌农杆菌介导脂肪酶在无孢黑曲霉中的高效表达

黑曲霉(Aspergillus niger)具有高效的蛋白表达和分泌能力.为实现异源蛋白在无孢黑曲霉中的高效重组表达,在优化遗传筛选标记的基础上,建立了根癌农杆菌介导的、以潮霉素抗性基因为筛选标记的黑曲霉转化体系.利用该体系介导米黑根毛霉脂肪酶(RML)转化黑曲霉SH-1,通过PCR鉴定、酶活检测、镍柱亲和层析及SDS-PAGE电泳检测等确定成功获得了RML的黑曲霉转化子,并通过发酵条件优化实现了RML的高效表达,对硝基苯酚比色法测得转化子酶活最高可达15 U/mL,是其在酵母中表达水平的10倍以上.     

高产柠檬酸工业Aspergillus niger菌株转化体系构建及衣康酸发酵

柠檬酸高产菌株Aspergillus niger YX-1217无法成功建立遗传转化体系,极大地限制了其代谢机制和分子机制的研究。对该菌株进行遗传改造,最终建立了一种农杆菌(Agrobacterium tumefacien)介导的遗传转化体系:农杆菌AGL-1作为介导菌株、A.niger YX-1217孢子密度为1×107m L-1、孢子与农杆菌的体积比为1∶9、乙酰丁香酮浓度为300μmol/L。在最佳转化体系下获得25±1个转化子(以107个分生孢子计)。基于上述遗传转化技术,对A.niger YX-1217产柠檬酸的应用进行拓展,通过引入乌头酸脱羧酶cad A基因构建衣康酸的合成途径,基于搅拌转速三阶段控制利用补料分批发酵生产衣康酸,质量浓度最高达到4. 21 g/L,最大产率为0. 040 g/(L·h),从而延伸原有柠檬酸的代谢通路来实现衣康酸的生产。     

Agrobacterium tumefaciens-mediated Transformation of CryⅠA(b) gene to Trichoderma harzianum

In this study, Cry ⅠA(b) gene was successfully transferred into the biocontrol fungus Trichoderma harzianum with an efficiency of 60-180 transformants per 10^6 spores by using Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. Putative transformants were analyzed to test the presence of Cry ⅠA(b) gene by Southern blot. Most transformants contained a single T-DNA copy. RT-PCR analysis showed that the Cry ⅠA(b) gene was transcribed. Antifungal activities and insecticidal activities of the transformants were examined. There was no obvious difference in antifungal activities between the transformants and their wild strains. The modified mortalities of the transformants T1 and T2 were 69.57% and 91.30%, respectively. The tranformation system mediated by A. tumefaciens proved to be a powerful tool for the filamentous fungi transformation and functional genomic study with its high transformation frequency, simplicity of T-DNA integration, and genetic stability of transformants.     

T-DNA transfer and integration as a tool for insertional mutagenesis in the taxol-producing fungus

Agrobacterium tumefaciens-mediated DNA transformation method was applied to transform Nodulisporium sylviforme fusant HDF-68, a taxol-producing fungus. We constructed a binary vector pBI121-43 carrying a hygromycin-resistant gene cassette between the right and left borders of T-DNA. Optimal co-cultivation of N.sylviforme with A.tumefaciens containing pBI121-43 led to 110～130 hygromycin-resistant transformants per million conidia. Putative transformants were found to be mitotically stable. The molecular analysis of transformants demonstrated the random integration of single copy of the T-DNA into the host genome. This transformation system serves as a basic tool for insertional mutagenesis in N.sylviforme fusant HDF-68, and the development of such system lays a solid foundation for constructing high-yied gene engineering strain and clarifying taxol biosynthesis pathway in this fungus.     

根癌农杆菌介导的异角状拟盘多毛孢菌转化系统研究

以携带潮霉素B磷酸转移酶抗性基因(hph)的pBHt1作为转化载体,根癌农杆菌AGL-1作为转化介体,实施转化异角状拟盘多毛孢菌。研究发现,异角状拟盘多毛孢菌的最优转化体系为:异角状拟盘多毛孢菌分生孢子悬浮液浓度为1×106个/mL,根癌农杆菌OD600为0.3,共培养时间48 h,共培养温度为25℃,诱导培养基中乙酰丁香酮(AS)浓度为200μmol/L,选择培养基添加250μg/mL潮霉素B、250μg/mL头孢噻肟钠。1×106个异角状拟盘多毛孢菌分生孢子可以产生200～300个转化子,随机挑选10个转化子进行PCR检测,均能扩增出预期条带,且在不含潮霉素B的PDA培养基平板上转化子连续培养5代后,hph基因仍能稳定遗传,这表明T-DNA已经插入到异角状拟盘多毛孢菌的基因组中。此次建立的异角状拟盘多毛孢菌的转化体系可为该病菌的功能基因研究和寄主与病原菌的互作研究提供有效的工具。     

根癌农杆菌介导的百脉根遗传转化体系的优化研究

百脉根(L otus corn icu la tus L.)是世界著名的多年生优良豆科牧草之一,也是常见的庭院观赏植物.本文通过比较不同根癌农杆菌转化百脉根的效率和优化百脉根子叶遗传转化的条件,建立了一套有效的遗传转化体系.实验结果表明,EHA 105作为宿主菌对百脉根进行转化较LBA 4404和GV 3101具有更高的转化率;5 d苗龄的子叶最适合作为转化的外植体;浸染过程中0.05 M Pa负压处理5 m im以及在共培养培养基中添加20 m g/L的乙酰丁香酮均可提高转化效率.卡那霉素抗性植株经3次选择继代培养后,PCR检测全部为阳性.对部分PCR阳性植株进行PCR-Sou thern杂交,证实PCR产物真实可靠,表明外源基因已整合进入百脉根基因组中.     

影响根癌农杆菌转化水稻频率的因素研究

根癌农杆菌与来自水稻成熟种子的愈伤组织共培养,将外源基因导入水稻愈伤组织,并获得了转基因植株．通过比较影响根癌农杆菌转化频率的各种因素,表明在转化过程中酚类化合物和单糖的加入使农杆菌的转化频率提高了０．９％～１７．４％．在共培养时农杆菌的稀释方式也是影响农杆菌转化频率的重要因素     

多基因双T-DNA植物表达载体的构建及拟南芥转化

多基因植物表达载体用于植物遗传转化是培育具有多种优良品质作物的有效策略. 双T-DNA系统是实现筛选完成后选择标记基因删除的一种简便可行的方式. 为培育高度抗逆或去除标记基因的农作物，构建了多基因双T-DNA植物表达载体2T-bbgdD，其中含有一个抗除草剂基因bar, 3个抗逆相关基因(DREB1A, Na+依赖性Pi转运体基因（d5）, betA)和一个报告基因gfp. 利用农杆菌介导法将该载体转入拟南芥，获得了多基因共转化及去除标记基因的转基因拟南芥. 可将此植物表达载体进一步用于作物的遗传转化.     

红曲菌转化子性状分析及分子验证

以根癌农杆菌（Agrobacterrium tumefaciens）介导的紫色红曲菌（Monascus purpureus）突变体库中的538株转化子菌株为材料,通过菌落形态观察并结合显微特征分析,筛选获得了9株形态特征变化显著的转化子,对其进行了分子验证和遗传稳定性检测,证明转化子基因组DNA中含有T-DNA插入片段,并能稳定遗传.在此基础上,采用乙醇提取法和改良的纸色谱法分别对转化子的主要代谢产物红曲色素和γ-氨基丁酸（γ-Ami-nobutyric Acid,GABA）进行了分析,发现突变株产生次级代谢产物的能力有不同程度的变化.