耐碱细菌NTT36耐碱基因的克隆及表达产物的分析

耐碱芽孢杆菌ＮＴＴ３６总ＤＮＡ经ＥｃｏＲ１酶不完全消化,与质粒ｐＵＣ１８的ＥｃｏＲＲＩ酶切产物在体外重组后,转化大肠杆菌ＨＢ１０１,在碱性平板上直接筛选耐碱转化子,转化经检测具有氨苄青霉素抗体,分析表明转化子具有１５ｋｂ大小的重组质粒,用此重组质粒转化大肠杆菌ＨＢ１０１,ＤＨ５ａ和ＸＬ１－Ｂｌｕｅ,均产生大量同时具有耐碱性和Ａｍｐ抗性的转化子,通过Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交和点杂交证明此重组质粒（定名为     

卡介苗中具启动子活性片段克隆及分析

利用启动子探针型质粒ｐＫＫ２３２－８从卡介苗染色体ＤＡＮ的ＢａｍＨＩ酶切片段中克隆到４个具启动功能的ＤＮＡ片段,测定各重组子对氯霉素（Ｃｍ）的抗性,其中含３．３Ｋｂ外源片段的重组质粒ｐＢＣＧ２大肠杆菌转化子在ＬＭ培养基上对Ｃｍ抗性可达１７０×１０－６ｇ／ｍＬ,作了该片段的限制性酶切图谱．对ｐＢＣＧ２利用ＳａｌⅠ位点,亚克隆出４种部分重叠的具启动功能的ＤＮＡ片段,这４种重组质粒分别命名为ｐＢＣＧ２－１,ｐＢＣＧ２－２,ｐＢＣＧ２－６和ｐＢＣＧ２－８,并分析了其中插入片段的大小及其转化子对Ｃｍ的抗性．将ｐＢＣＧ２－２的ＳａｌⅠ外源片段插入到分枝杆菌启动子探针型穿梭质粒ｐＥＱ３,获得一个可在卡介苗中表达ｌａｃＺ基因的重组子ｐＥＢ２２．斑点杂交实验证明,具有启动功能的ＤＮＡ片段来源于卡介苗的染色体ＤＮＡ．结果表明克隆到一个对大肠杆菌和卡介苗均具启动子活性的ＤＮＡ片段     

蓝细菌新质粒载体pPRS－1的构建

以蓝细菌Ｐｌｅｃｔｃｎｅｍａｂｏｒｙａｎｕｍ内源小质粒ｐＰｂｓ（１．５ｋｂ）和Ｅ。ｃｏｌｉ质粒载体ｐＢＲ３２２（４．３ｋｂ）为材料，用限制性内切核酸酶ＣｌａⅠ分别消化，经Ｔ＿４ＤＮＡ连接酶连接，转化Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１感受态细胞，在含Ａｍｐ（Ａｐ）和含Ｔｅｔ（Ｔｃ）的ＬＢ琼脂培养基上筛选出Ａｍｐ￣ｒＴｅｔ￣ｓ的转化子，提取转化子的质粒，用ＣｌａⅠ消化，得１．５ｋｂ和４．３ｋｂ两片段，表明转化子所含质粒是ｐＰｂｓ和ｐＢＲ３２２的重组质粒，定名为ｐＰＲＳ－１。     

牛α—s1酪蛋白基因3‘端DNA的PCR扩增,克隆及鉴定

本研究以牛血总ＤＮＡ为模板，用ＰＣＲ技术扩增牛α－ｓ１酪蛋白基因的５＇端３．６ｋｂＤＮＡ片段和３＇端１．５ｋｂＤＮＡ片段的调控区序列，得到了相应的特异性扩增片段．用Ｋｌｅｎｏｗ处理后，将两个扩增片段分别与经Ｓｍａｌ酶切的ｐＵＣ１８质粒载体用Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接，转化大肠杆菌ＪＭ１０９．在含有Ｘ－ｇａｌ，ＩＰＴＧ和Ａｍｐ的选择培养基上培养．从白色菌落中提取质粒ＤＮＡ，进行限制酶切鉴定．结果得到一个插入有１．３ｋｂＤＮＡ片段的阳性克隆．对其进行部分序列分析表明，该片段为５＇端缺失约１７０ｂｐ的牛α－ｓ１酪蛋白基因３＇端及下游区序列．     

嗜碱芽孢杆菌NTT89启动子的克隆及其表达

报导了启动子探测质粒ｐＫＫ２３２－８为载体克隆嗜碱芽孢杆菌ＮＴＴ８９启动子的研究，用限制性内切酶ＨｉｎｄⅢ分别消化嗜碱芽孢杆菌ＮＴＴ８９染色体ＮＤＡ和质粒ｐＫＫ２３２－８，在体外重组，转化大肠杆菌ＤＨ５α感受态细胞，在含氨苄青霉素和氯霉素的选择性性平板上筛选转化子，结果从ＮＴＴ８９染色体ＤＮＡ中克隆到一系列带有启动子活性的ＤＮＡ片段，并在大肠杆菌中得到表达，这些转化子抗氯霉素水平在３４－５００ｍｇ     

多能硫杆菌RubisCO基因（rbcL－rbcS）的克隆及限制性内切酶图谱分析

以光合细菌圆球状红杆菌Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒｓｐｈａｅｒｏｉｏｄｅｓ的ｒｂｃＬ－ｒｂｃＳ基因为探针，与多能硫杆菌（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓｖｅｒｓｕｔｕｓ）染色体ＤＮＡ酶切谱带进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交，检测到了ｒｂｃＬ－ｒｂｃＳ基因的同源序列，又以ｐＵＣ９为载体，克隆了Ｔ．ｖｅｒｓｕｔｕｓ染色体ＤＮＡＰｓｔＩ酶切片段，构建成Ｔ．ｖｅｒｓｕｔｕｓ基因文库，并从这个基因文库中筛选到了含有ＲｕｂｉｓＣＯ基因的重组质粒，将其命名为ｐＳＤＬＳ－１０，进一步对ｐＳＤＬＳ－１０进行了限制性酶切分析，作出了ｐＳＤＬＳ－１０限制性内切酶图谱     

嗜麦芽假单胞菌质粒pSH1的限制图谱及km^r标记的克隆

对嗜麦芽假单胞菌Ｐ２菌株的质粒ｐＳＨ１进行了限制酶切分析，确定了Ｂｇ１ Ⅱ，ＥｃｏＲ Ⅰ，Ｐｓｔ Ⅰ，Ｘｂａ Ⅰ，ＢａｍＨ Ⅰ，Ｂｇｌ Ⅰ，及Ｐｖｕ Ⅱ共７种限制性内切酶在ｐＳＨ１，质粒上的切割位点，前４种酶均为单一切点，后３种依次为２，７，５个切点。通过双酶切和部分酶切的方法绘制了ｐＳＨ１质粒的限制酶切图谱。将ｐＧＰ１－２质粒上的卡那霉素抗性基因片段插入ｐＳＨ１，获得了重组质粒ｐＳＨ２．ｐＳＨ２     

环状芽胞杆菌（Bacillus circulans）基因表达效率调节DNA片段的研究

用大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）启动子探针型载体ｐＳＵＰＶ１从环状芽胞杆菌（Ｅａｃｉｌｌｕａｅｉｒｃｕｌａｎｓｃ－２）基因组中分离的启动子片段ＢＣ６能使无启动子的卡那霉素抗性基因恢复活性，并在大肠杆菌中获得高效表达（卡那霉素抗性高达１２００μｇ／ｍＬ）．当用限制酶ＸｂａⅠ去除其５′－端１．２ｋｂ片段（命名为Ｘｂ片段）后，３′－端片段仍能启动Ｋａｎ￣ｒ基因表达，其抗性水平降至４００μｇ／ｍＬ但当１．２ｋｂ片段反向插回原有位置时，其抗性水平降至６００μｇ／ｍＬ．将Ｘｂ片段正向插入另一重组质粒ｐＢＣ３中融合的Ｋａｎ￣ｒ基因启动子的上游时，卡那霉素抗性由２００μｇ／ｍＬ上升至１０００μｇ／ｍＬ．当Ｘｂ片段反向插入时，Ｋａｎ￣ｒ基因的表达却明显受到抑制，降为１００μｇ／ｍＬ．这说明Ｘｂ片段具有正向增强而反向衰减Ｋａｎ￣ｒ基因表达的能力．用ＢＣ６片段的两个亚克隆片段与ｃ－２菌株总ＤＮＡ分别作Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交时，结果显示３′－端片段以单拷贝形式存在于基因组中，而Ｘｂ片段则以多拷贝形式散布其中．由此推断Ｘｂ片段并非一定伴随该基因启动子存在．     

林可链霉菌噬菌体φSL60启动子的克隆与鉴定

以启动子探针质粒ｐＩＪ４８６为载体,变铅青链霉菌（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）ＴＫ２３作受体,克隆了林可链霉菌噬菌体ＳＬ６０ＤＮＡ上的启动子活性片段。以ｐＵＣ１８为载体构建ＳＬ６０ＤＮＡ之ＫｐｎＩ片段的基因文库,从中筛选出两个片段,分别克隆于ｐＩＪ４８６中获得ｐＵＩＳ２９和ｐＵＩＳ１９８,在ＭＭ培养基上,两者的转化子对卡那霉素的抗性均仅为１０ｍｇ／Ｌ。噬菌体ＳＬ６０ＤＮＡ的ＢｇｌＩ片段直接克隆入ｐＩＪ４８６的ＢａｍＨＩ位点,获得重组质粒ｐＭＭＳ１,其转化子的卡那霉素抗性在ＭＭ培养基上可达２５０ｍｇ／Ｌ。分析表明ｐＭＭＳ１上的插入片段约为９２０ｂｐ,含有一个ＳｓｔＩ位点,四个ＭｂｏＩ位点。该片段用ＭｂｏＩ部分酶解缩小到６００ｂｐ,亚克隆入ｐＩＪ４８６中得到重组质粒ｐＭＳＢ１４,其转化子对卡那酶素的抗性水平提高到３００ｍｇ／Ｌ。ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳显示,ｐＭＳＢ１４中的ｎｅｏ基因可以表达出氨基糖苷磷酸转移酶（ＡＰＨＩ蛋白）。这些结果表明ｐＭＳＢ１４中的插入片段可能具有较强的启动子活性。     

用聚合酶链式反应扩增抗冻肽基因并在双元表达载体中克隆

抗冻肽基因导入植物的第一步合成了５＇－末端分别带有限制性酶ｘｂａＩ和ＫｐｎＩ识别位点的一对引物，以美洲拟鲽抗冻肽的ｃＤＮＡ克隆为模板，用锚定聚合酰酶链反应扩增了抗冻肽基因，并克隆到细菌表达载体ｐＧＥＭ３２ｆ（一）和植物表达盒式载体ｐＧＡ６４３中，以限制性酶切分析和菌落杂交技术证明了转化子质粒ＤＮＡ中的含有抗冻肽基因，又用ＰＣＲ方法扩增了转化子的抗冻肽基因，从而证实了克隆成功。     

恶臭假单胞菌萘质粒ⅠNL基因的克隆及酶切图谱

恶臭假单胞菌（ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａＧ７）携带的质粒ＮＡＨ７，经限制性内切酶ＥｃｏＲＩ切割后，产生含有萘降解酶全部基因（２４，６ｋｂ）的片段，此片段插入到载体ｐＵＣ１１９的多克隆位点，构成了ｐＫＡＯ质粒，此质粒经ＨｐａＩ，ＥｃｏＲＩ酶切获得的５．１ｋｂ片段亚屯隆到ｐＵＣ１１９中，衍生出ｐＮＮ１质粒，绘制出内切酶图谱。从ｐＮＮＩ质粒上切下含目的基因ｎａｈＩ、ｎａｈＮ和ｎａｈＬ的ｋｐｎＩ－ｋｐｎＩ片段（２．３ｋｂ）．正向插入载体ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔⅡＳＫ＋中获得重组质粒ｐＮＮ２，反向插入为ｐＮＮ３，将其转化到大肠杆菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ中，目的基因得以大量增殖。     

野油菜黄单胞菌NK－01生物合成黄原胶的分子遗传学分析

本文采用甲基磺酸乙酯（ＥＭＳ）诱变野油菜黄单胞菌ＮＫ－０１得到多糖合成缺陷的不产粘突变株。经ＳａｌＩ部分酶切得到ＮＫ－０１染色体ＤＮＡ片段，将其连接到广泛寄主载体ｐＲＫ２９３上，在Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１中建立完整的ＮＫ－０１基因文库。在协助质粒ｐＲＫ２０１３存在下，不产多糖突变株分别与含基因文库的Ｅ．ｃｏｌｉ菌落群进行三亲接合转移，筛选具有卡那霉素抗性的产粘接合后体。对接合后体进行重组质粒的酶切分析表明，所克隆的ＤＮＡ具有片段重叠。上述重组质粒对另外９株不产多糖突变株互补检测及遗传学分析表明，１３．４ｋｂ的ＤＮＡ片段含有合成黄原胶所必需的基因。     

环状芽胞杆菌基因启动子的分离与鉴定

环状芽胞杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｉｒｃｕｌａｎｓ）总ＤＮＡ经Ｓａｕ３ＡＩ酶切后插入到启动子探针型载体ｐＳＵＰＶ１的ＢａｍＨＩ位点，转化大肠杆菌后，在卡那霉素的平板上筛选到５０个抗性菌落。从随机挑取的２９个抗住菌落所分离到的质粒ＤＮＡ经限制酶切和琼脂糖凝胶电泳后表明，各质粒均有ＤＮＡ插入片段，对２９个样品进行卡那霉素抗性试验显示，抗性最高的可超过１０００μｇ／ｍＬ这表明来自环状芽胞杆菌的某些基因启动子能在大肠杆菌中十分有效地启动基因表达，选取两个最大的克隆ＤＮＡ片段ＢＣ３和ＢＣ６作为探针与Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓｃ－２．总ＤＮＡ作Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交，均获得杂交带。斑点杂交结果表明，这两个ＤＮＡ片段来自不同的基因启动子。对ＢＣ６和ＢＣ３分别进行了限制酶谱分析，并绘制了限制酶图。     

小灵猫华东亚种线粒体DNA限制性位点图

提纯了小灵猫华东亚种（ＶｉｖｅｒｒｉｃｕｌａｉｎｄｉｃａｐａｌｉｄａＧｒａｙ）的肝脏ｍｔＤＮＡ．用ＢａｍＨⅠ、ＢｇｌⅡ、ＥｃｏＲⅤ、ＨｐａⅠ、ＫｐｎⅠ、ＭｌｕⅠ、ＰｓｔⅠ、ＰｖｕⅡ、ＳａｃⅡ、ＳａｌⅠ和ＸｈｏⅠ等１１种识别６碱基对的限制性内切酶对小灵猫华东亚种ｍｔＤＮＡ进行消化分析，１１种限制性内切酶均有１～５个位点；根据单酶消化和双酶消化片段的数目和分子量，构建了小灵猫华东亚种ｍｔＤＮＡ限制性位点图     

HSV1-tk基因的部分DNA序列分析

采用ＰＣＲ技术从商品质粒ｐＨＳＶ１０６扩增出ＨＳＶ１－ｔｋ基因（１１２８ｂｐ）,ＰＣＲ产物用ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ双酶切后定向克隆至真核表达载体ｐｃＤＮＡ３,然后以重组质粒ｐｃＴＫ为模板ｔｋ基因的５端引物为ＤＮＡ测序引物进行部分ＤＮＡ序列分析,部分ＤＮＡ序列分析证明ＰＣＲ产物为ＨＳＶ１－ｔｋ基因正确无误,成功筛选到ＨＳＶ１－ｔｋ基因的真核表达载体ｐｃＴＫ,并为利用ｔｋ基因在实验动物体内进行自杀性基     

萝卜叶绿体rbcL基因定位及ctDNA基因文库的构建

用改进的高离子强度法分离的萝卜叶绿体经ＳＤＳ６０℃裂解，抽提的ｃｔＤＮＡ只需简单纯化即可用于酶切分析，萝卜ｃｔＤＮＡ用４种限制性内切酶ＢａｍＨＩ，ＰｓｔＩ，ＨｉｎｄⅢ和ＥｃｏＲⅠ分别进行单酶完全酶解，推算其分子量和长度分别为８２．５×１０６６Ｔ １２５ＫＢ。     

小菜蛾颗粒体病毒DNA限制性酶切分析及基因组DNA片段克隆

小菜蛾颗粒体病毒ＤＮＡ用ＢａｍＨＩ和ＸｈｏＩ酶切，经０．７５％琼脂糖凝胶电泳，分别得到１２条带和８条带，平均分子量为１１３．０ｋｂ。用Ｓｕｐｅｒｃｏｓ１ Ｃｏｓｍｉｄ作载体，将Ｓａｕ３ＡＩ部分消化的ＰｘＧＶ－ＤＮＡ随机片段插入该载体的ＢａｍＨＩ酶切位点，转化于ＸＬ１－Ｂｌｕｅ受体菌，经Ａｍｐ平板筛选转子，挑出２５６个Ａｍｐ＾＋菌落，以＾３２Ｐ－ｄＣＴＰ标记的ＰｘＧＶ－ＤＡＮ为探针，斑点杂交筛选得到     

豌豆中GPAT基因编码cDNA的克隆及分析

参照国外报道的豌豆ＧＰＡＴ基因ｃＤＮＡ序列，设计并合成一对寡核苷酸引物，通过ＲＴＰＣＲ技术，从云南地方栽种的豌豆品种中分离到了ＧＰＡＴ基因的编码ｃＤＮＡ片段，并将其纯化后直接克隆到ｐＧＥＭＴ载体系统中，经ＮｃｏⅠ和ＮｏｔⅠ双酶切鉴定，所得的重组质粒中含有１３８０ｂｐ左右的片段．采用ＰｓｔⅠ，ＨｉｎｄⅢ两种限制性内切酶进行酶切，酶切图谱分析表明所克隆的豌豆ＧＰＡＴ基因编码ｃＤＮＡ的酶切图谱与国外所报道的该基因ｃＤＮＡ的酶切图谱一致，暗示了该基因在进行上具有一定的保守性．     

重组质粒βhCG—pPIC9K的构建及嗜甲醇酵？…

目的：为用基因重组技术表达ｈＣＧ避孕疫苗抗原,构建在酵母细胞中表达的重组质粒βｈＣＧ－ｐＰＩＣ９Ｋ,转化嗜甲醇酵母,方法：根据βｈＣＧ的ｃＤＮＡ序列设计两条引物,使上游带ＥｃｏＲⅠ酶切位点,下游带ＮｏｔⅠ酶切位点,以质粒βｈＣＧ－ＰＢＳＫＳ为模板,进行ＰＣＲ扩增反应;将所得的ＤＮＡ片段经ＥｃｏＲⅠ和ＮｏｔⅠ双酶切后用Ｔ４连接酶与ｐＰＩＣ９Ｋ质粒进行连接,然后导入大肠杆菌ＤＨ５α,用ＰＣＲ筛选阳性克     

旋毛虫排泄分泌抗原p49基因的克隆

应用ＤＮＡ重组技术将编码旋毛虫肌幼虫４９ＫＤａ抗原的基因克隆于大肠杆菌中．设计特异的ＰＣＲ引物,用ＰＴ－ＰＣＲ技术直接从旋毛虫肌幼虫总ＲＮＡ中反转录并扩增出约１．１Ｋｂ的靶ＤＮＡ．用ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ酶解后将其克隆到质粒载体ｐＵＣ１９中,用Ｘ－ｇａｌ培养基筛选重组子．该重组子经相同的核酸内切酶水解获得约２．７Ｋｂ和１．１Ｋｂ两个片段,分别与ｐＵＣ１９和目的基因的大小相同,目的基因经序列分析并与文献报道的序列比较发现具有９７．８％的同源性．