表达鸡传染性支气管炎病毒SD/97/01株S1蛋白的重组杆状病毒的构建

采用BAC－TO－BAC杆状病毒表达载体体系构建了表达鸡传染性支管炎病毒（IBV）呼吸型毒株SD／97／01S1蛋白的重组杆病病毒，含SD／97／01株S1基因原重组质粒p MDSD9701S1用BamHI和SalI双酶切后，回收的片段并克琶杆病病毒转座载体pFASTBACHTa中多角体基因启动子的下游，筛选出重组转座质粒pFASTSD9701S1U并转化大肠杆菌DH10BAC后,获得重组穿梭质粒rBacmidSD9701S1，用重组穿俊质粒DNA转染昆虫Sf9细胞，获得了含SD／97／01S1基因的重组杆状病毒rAcSD9701S1，重组病毒感染Sf9细胞后，用SDS－PAGE、Westernblot和IFA对细胞表达产物进行检测和分析。结果表明：构建的重组杆状病毒能够在昆虫细胞中表达SD／97／01的S1蛋白，该蛋白具有天然蛋白的抗原性。     

大肠杆菌β－半乳糖苷酶基因在小菜蛾细胞中的表达

用携带大肠杆菌β－半乳糖苷酶（β－ｇａｌ）基因的杆状病毒转移载体．ｐＡｃ３６０－β－ｇａｌ与苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（ＡｃＮＰＶ）ＤＮＡ经钙磷沉淀法共转染小菜蛾细胞系（ＢＣＩＲＬ－ＰＸ２－ＨＮＵ２,Ｐｘ）,利用Ｘ－ｇａｌ空斑检测分析,β－ｇａｌ基因成功地插入ＡｃＮＰＶ基因组中,得到重组病毒Ａｃ－β－ｇａｌ,重组病毒在Ｐｘ细胞中表达出受ＡｃＮＰＶ多角体蛋白基因启动子控制的具有生物活性的外源基因表达产物──β－ｇａｌ．     

人粒细胞集落刺激因子在昆虫细胞中的表达

利用苜蓿尺核型多角 体病带β－Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ基因标志的非融合蛋白基因转移载体ｐＢＢ成功地构了重组杆状病毒ＡｃＮＰＶ－Ｇ－ＣＳＦ．在感染重组病毒的草地夜蛾细胞中ｈＧ－ＣＳＦ得到了高效表达。表达产物由ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ检出，其分子量约为１９ＫＤａ。     

凋亡抑制基因p35对杆状病毒增殖的影响

以野生型苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒和多角体基因缺失的ＡｃＮＰＶ分别感染Ｓｆ９－３５细胞,研究了ｐ３５的稳定表达对杆状病毒增殖的影响。     

人生长激素基因在昆虫细胞中表达的初步研究

将人生长激素hGH的cDNA片段克隆在转移载体pVL1393的多角体蛋白基因启动子下游,构成重组转移载体pVL1393hGH,将该质粒DNA与昆虫杆状病毒（AcNPV）DNA共转染秋粘虫（Spodopterafrugiperda）细胞Sf9,通过体内同源重组,hGH基因取代多角体蛋白基因,从而整合到病毒基因组上,经感染昆虫细胞后表达外源hGH基因,通过反复病毒空斑纯化,获不含多角体的重组病毒,利用免疫化学发光法测定hGH表达量达40μg／mL．     

猕猴B病毒妒和gC合成基因重组杆状病毒质粒的构建

目的构建猕猴B病毒gB和gc合成基因的杆状病毒重组质粒（rBacmid）。方法根据本室已经合成的猕猴B病毒gB基因和gc基因,利用BamHI和XhoI特异性酶切,将其亚克隆于昆虫杆状病毒的pFastBacHTA转座载体。将该阳性转座载体转化到DHlobac感受态细胞,从中筛选出阳性重组细菌,并提取重组质粒。结果获得了重组质粒bacmid—gB和bacmid—gC。结论该研究为猕猴B病毒gB和gc蛋白在杆状病毒系统内的表达奠定了基础。     

形成多角体家蚕重组病毒通用转移载体构建

从家蚕核型多角体病毒（ＢｍＮＰＶ）通用转称载体ｐＢＫ２８３和粉纹夜蛾核型多角体病毒（ＴｎＮＰＶ）转移载体ｐＳＸＩＶＶＩ＋Ｘ３系列出发，构建了一个７．２ｋｂ能形成多角体且可以用于克隆含不同读码框外源基因的ＢｍＮＰＶ通用转移载体系列ｐＢＭＸ３．ｐＢＭＸ３系列以ＢｍＮＰＶ多角体结构基因上游的１．９ｋｂ和下游１．３ｋｂ的片段作为与ＢｍＮＰＶ基因组进行体内同源重组的同源序列；ｐＳＸＩＶＶＩ＋Ｘ３系列的ＳＸＩＶ双启动子用于外源基因的表达；ＡｃＮＰＶ的多角体基因作为重组病毒形成多角体的基因．以ＢｍＮＰＶ－ＬａｃＺ（ｏｃｃ－ｇａｌ＋）为出发株病毒，ｐＢＭＸ３系列的重组病毒筛选有ｏｃｃ＋和ｇａｌ－两个遗传标记     

具全期启动子盒的杆状病毒高效表达载体的组建与应用

通过ＰＣＲ扩增，得到苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒（ＡｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａＮｕｃｌｅａｒＰｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓＶｉｒｕｓ，ＡｃＮＰＶ）具早晚期启动子元件的ｐ３５基因启动子，将其插入到杆状病毒转移载体质粒ｐＳＸＩＶＶＩ＋Ｘ３多克隆位点上游，使之与ｐＳＸＩＶＶＩ＋Ｘ３质粒中的人工合成后期启动子（ＰＳｙｎ）、多角体ＸＩＶ启动子（ＰＸＩＶ）串联构成早期、晚期、极晚期能持续启动外源基因表达的转移载体质粒ｐＳＸ３５．将ｐＳＸ３５用于组建含ＨＢｓＡｇ基因并形成多角体的重组ＴｎＮＰＶ，ＨＢ－ｓＡｇ基因的表达量显著提高，表达时间亦明显提前，从而实现了外源基因在杆状病毒表达系统的全期、高效表达．ｍＲＮＡ引物延伸试验结果显示，Ｐｐ３５在重组病毒中可产生２套转录本，分别于病毒感染的早期和晚期起始ＨＢｓＡｇ基因的表达．     

AcNPV增强子hr5增强HBsAg基因表达的研究

用形成包涵体（ＯＯＣ＋）并能利用人工合成启动序列和多角体ＸＩＶ启动子表达外源基因的转移载体质粒ｐＳＸＩＶＶＩ＋Ｘ３将多角体基因、乙型肝炎病毒表面抗原（ＨＢＳＡｇ）基因和苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒（ＡｃＮＰＶ）的增强子ｈｒ５部分序列同时插入无包涵体的粉纹夜蛾核型多角体病毒ＴｎＮＰＶ－ＳＶＩ－Ｇ基因组中，得到两株高效表达ＨＢｓＡｇ基因又形成包涵体的重组病毒ＴｎＮＰＶ－ｓｈｒ３５－ＯＣＣ＋和ＴｎＮＰＶ－ｓｈｒ２６－ＯＣＣ＋．对重组病毒的酶切鉴定、ＤＮＡ斑点杂交和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析证实，外源基因及其相应的启动子和增强子序列已正确插入病毒基因组中．插入顺序中，ｈｒ５增强子是插入ＨＢｓＡｇ基因下游，多角体基因与ＨＢｓＡｇ基因方向相反．１２５Ⅰ－固相放射免疫检测和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果表明，ＨＢｓＡｇ基因在昆虫离体细胞中得到高效表达并保留了抗原活性．ＴｎＮＰＶ－ｓｈｒ２６－ＯＣＣ＋和ＴｎＮＰＶ－ｓｈｒ３５－ＯＣＣ＋表达的ＨＢｓＡ吕蛋白与没有插入增强子序列的重组病毒ＴｎＮＰＶ—ＨＢｓ８５－ＯＣＣ＋的比较，分别提高了４０％和４６％．     

甜菜夜蛾核多角体病毒（SeMNPV）gp 37基因的克隆及序列分析

通过鸟枪法克隆了甜菜夜蛾核多角体病毒（SeMNPV)基因组DNA EcoR I酶切的2．2kb片段,序列分析表明,该片段含有gp37基因,SeMNPV gp37基因的开放阅读框为801个核苷酸,编码268个氨基酸,预测蛋白质相对分子质量为30400,在gp37基因起始密码子上游有一典型的杆状病毒晚期基因启动子序列ATAAG,同其它昆虫杆状病毒和昆虫痘病毒GP37／Fusolin蛋白的比较结果表明,SeMNPV GP37与已知gp37/fusolin基因的氨基酸序列同源性较高（50－68％）,在其蛋白序列内存在类似的保守区和可能的N－连接糖基化位点,在SeMNPV gp37基因下游存在一个完整阅读框和部分get基因序列。     

重组杆状病毒的研究——Ⅱ.带标记的多角体转移载体质粒的构建

用大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因,杆状病毒ETL启动子和含多角体基因的病毒DNA片段构建了多角体转移载体质粒pEZGL,还对其特点进行了讨论。     

单细胞克隆法快速筛选重组昆虫杆状病毒

首先采用显微操作系统挑取包含有重组病毒的单细胞，成功地获得了重组杆状病毒的单细胞克隆，并得到了重组病毒的纯培养，对有多角体的和无多角体的重组病毒细胞的挑取表明，这一方法对重组杆状病毒的筛选具有普遍适用性，我们发展的这一方法比常规的空斑技术简便、便速，只需两周左右即完成重组病毒的筛选。     

分泌性BACE1蛋白在昆虫细胞的表达

为了获得有活性的重组β-secretase并研究其功能,寻找特异性抑制剂,应用RT-PCR技术,从人胚胎脑组织特异性扩增并克隆了人BACE1编码基因的胞外片断(BACE1-454)。测序后与质粒pFastBac连接,得到含BACE1-454基因的重组质粒pFast-BACE1-454。将其转化到含有杆状病毒穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中进行转座重组,用琼脂糖凝胶电泳和PCR扩增对重组穿梭载体Bacmid-BACE1-454进行鉴定。将Bacmid-BACE1-454经脂质体介导转染Sf9细胞,收获病毒。用重组杆状病毒颗粒感染昆虫细胞,表达蛋白,免疫印迹证实所获蛋白产品具有特异的免疫反应性。     

斜纹夜蛾NPV多角体基因的克隆和部分测序

本文对ＳＩＮＰＶ基因组作了酶解分析，测得其基因组大小为１４５ｋｂ，并用双酶法确定了ＳＩＮＰＶ基因组的ＨｉｎｄⅢ和ＰｓｔⅠ物理图谱。以含ＡｃＮＰＶ多角体基因的质粒ｐＡＣ－Ⅰ的ＳａｌＩ－Ｃ片段为探针，对ＳＩＮＰＶＤＮＡ酶切片段ｓｏｕｔｈｅｒｎ转印杂交结果，初步判断多角体基因定位于ＰｓｔＩ－Ｂ／Ｃ／Ｄ片段、ＢｇｌⅡ－Ｃ／Ｄ片段、ＢａｍＨＩ－Ｂ／Ｃ片段和ＥｃｏＲＩ－Ａ／Ｂ片段上，且ＳＩＮＰＶ与ＡｃＮＰＶ多角体蛋白基因有６４％的同源性，而以大肠仟菌质粒ｐＵＣ１９为载体对ＳＩＮＰＶ的多角体基因试克隆，得到带有ＢｇｌⅡ－ＰｓｔⅠ双酶切片段的２个克隆子。对这两个杂交阳性克隆子之一的核苷酸序列测定，表明插入片段与ＢｍＮＰＶ多角体基因上游序列亦有一定同源性。     

应用核型多角体病毒载体在家蚕和家蚕培养细胞中高…

将人尿激原ｃＤＮＡ分别插入家蚕核型多角体病毒转移载体ｐＢＫ２８３和ｐＢＦ４中，构建成两个重组质粒。所构建的这两个重组质粒与野生型家蚕核型多角体病毒ＤＮＡ共转染家蚕培养细胞，经病毒斑实验筛选出含ｐｒｏ－ＵＫ ｃＤＮＡ的稳定重组病毒株ＢｍＮＰＶ－ｐｋ１和ＢｍＮＰＶ－ｐｋ２。将此两株蛋白平板溶圈测活法和Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹法分析细胞培养上清及细胞和家蚕的体液及组织，证实均有ｐｒｏ－ＵＫ表达。家蚕培养细胞的     

人生长激素基因在昆虫细菌中表达的初步研究

将人生长激素ｈＧＨ的ｃＤＮＡ片段克隆在转移载体ＰＶＬ１３９３的多角体蛋白基因启动子下游,构成重组转移载体ＰＶＬ１３９３ＨＧＨ     

利用Tn5转座子构建杆状病毒AcMNPV随机突变体的初步研究

以杆状病毒模式种AcMNPV为研究对象,应用基于Tn5转座子的随机转座的方法,构建杆状病毒突变体库将果蝇hsp70启动子后接绿色荧光蛋白基因后插入Tn5转座子,构建了可以在昆虫细胞中表达,易于跟踪的转座载体．利用体外转座系统将转座子随机插入AcMNPV基因组,并用转座反应液转染Sf21细胞,得到了表达绿色荧光蛋白的病毒突变体库进一步纯化了两株病毒B9F和Li6A,进行了转座子插入位点的分析,确定两株病毒中,转座子分别插入了94K基因和p10基因．该方法将为杆状病毒功能基因组研究提供重要的手段。     

AcMNPV p95基因一段339 bp序列在病毒复制中的作用

杆状病毒苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)的p95基因编码的P95蛋白是病毒核衣壳的组成部分,也是虫体经口感染相关因子PIF(Per os Infectivity Factor)复合体的组成部分.前期研究表明,完整的P95蛋白对病毒的复制是非必需的,其中一段450bp的序列可以部分弥补p95基因的作用.本研究将p95基因一段339bp的片段(Core339,AcMNPV基因组位置:69 576~69 914bp)以正反两个方向分别插入到p95基因敲除的AcMNPV基因组中多角体位点的polyA之后,构建了两株重组病毒vP95K/EGFP/339+和vP95K/EGFP/339-.该两株病毒能在Sf9细胞中正常复制,复制水平与p95基因正常的AcEGFP相当,但复制速度较慢.重组病毒感染细胞的Western blot分析未检测到P95蛋白的表达.这一结果表明P95蛋白的缺失对病毒在细胞中的复制没有显著影响,但核心片段Core339对于病毒复制具有关键作用.     

全长和截短的δ内毒素cryIAc基因在昆虫杆状病毒表达？…

在昆虫病毒转移载体ｐＶＬ１３９３多角体基因启动子下游克隆了全长的苏芸金杆菌δ内毒素基因ｃｒｙＩＡｃ，得到了重组转移载体ｐＶＬＹ１，用ＫｐｎＩ将ｃｒｙＩＡｃ基因进行了截短，得到了重组转移载体ｐＶＬＹ２。随后在两种重组转移载体ｃｒｙ基因的下游引入了ＩＥ１启动子驱动的ｎｅｏ基因作为筛选标记和ＳＶ４０小ｔ抗原终止区作为ｃｒｙ基因的终止信号，得到了重组转移载体ｐＶＬＹ１ｎｅｏ和ｐＶＬＹ２ｎｅｏ，分别用两种重     

斜纹夜蛾核型多角体病毒日本株(C3)p10基因的克隆及序列分析

从斜纹夜蛾核多角体病毒(Spodoptera litura mukieapsid nucleopolyhedrovirus，Splt MNPV)日本株(C3)基因组中克隆了p10基因．核苷酸序列分析表明，该克隆片断涵盖了318bp的读码框及5’端启动子区191bp和3’端终止区62bp的序列．在起始密码子ATG上游-63～-59bp处有一杆状病毒晚期和晚晚期启动子基序TAAG．联配分析表明，Splt MNPV日本株(C3)的核苷酸序列和氨基酸序列与其它9种核多角体病毒的同源性有较大差异．以p10基因为基础绘制的杆状病毒分子进化树将家蚕核多角体病毒(Bombyx mori nuchopolyhedrovirus，BmNPV)与苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒(Autographa californica multicapcid nucleopolyhedrovirus，AcMNPV)归到同一分枝，这与以gp37基因和egt基因为基础绘制的杆状病毒分子进化树结果一致．