从梨花迁粉蝶中所得微孢子虫的系统进化分析

从中国云南省野外采集的梨花迁粉蝶(Catopsilia pyranthe)中分离得到一株疑似微孢子虫,对该分离株的核糖体SSUrRNA(Small subunit ribosomal RNA)和α-tubulin 基因进行克隆测序。通过序列分析及系统进化树构建,结果发现该分离株属于 Nosema属的一种微孢子虫,命名为 Nosema sp.CP。通过对SSUrRNA系统进化分析发现,Nosema sp.CP与家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)、斜纹夜蛾微孢子虫(Nosema spodopterae)的亲缘关系相对于菜粉蝶微孢子虫Nosema sp.MPr更加接近。通过对α-tubulin 基因的系统进化分析,结果表明 Nosema sp.CP与 N.bombycis聚在一支上,进一步证实了它们的紧密关系。因此,本研究首次在粉蝶科(Pieridae)的梨花迁粉蝶中分离得到的 Nosema属微孢子虫是与家蚕微孢子虫非常近源的一类微孢子虫,并暗示了粉蝶科昆虫感染的微孢子虫具有潜在多样性。
     

从梨花迁粉蝶中所得微孢子虫的系统进化分析

从中国云南省野外采集的梨花迁粉蝶（Catopsilia pyranthe）中分离得到一株疑似微孢子虫,对该分离株的核糖体SSUrRNA（Small subunit ribosomal RNA）和α-tubulin基因进行克隆测序。通过序列分析及系统进化树构建,结果发现该分离株属于Nosema属的一种微孢子虫,命名为Nosema sp．CP。通过对SSUrRNA系统进化分析发现,Nosema sp．CP与家蚕微孢子虫（Nosema bombycis）、斜纹夜蛾微孢子虫（Nosema spodopterae）的亲缘关系相对于菜粉蝶微孢子虫Nosema sp．MPr更加接近。通过对α-tubulin基因的系统进化分析,结果表明Nosema sp．CP与N．bombycis聚在一支上,进一步证实了它们的紧密关系。因此,本研究首次在粉蝶科（Pieridae）的梨花迁粉蝶中分离得到的Nosema属微孢子虫是与家蚕微孢子虫非常近源的一类微孢子虫,并暗示了粉蝶科昆虫感染的微孢子虫具有潜在多样性。     

中华蜜蜂囊状幼虫病毒在Sf9和S2细胞系中的感染性研究

【目的】调查研究中华蜜蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)在草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)卵巢细胞系Sf9和果蝇S2胚胎细胞(Schneider’s Drosophila Line 2)中的感染性。【方法】以Sf9和S2作为CSBV体外感染的细胞系,通过RT-PCR检测CSBV的Vp1基因表达情况从而判断CSBV是否能在两种细胞中感染并增殖。【结果】在S2细胞中并未检测到CSBV,说明CSBV不能感染该细胞;接种了CSBV的Sf9细胞中并未表现出明显的致细胞病变效应(CPE),但在该细胞总RNA中可检测到Vp1基因的转录。通过克隆测序发现,从接种CSBV的Sf9细胞中克隆得到的Vp1基因序列与CSBV重庆分离株Vp1基因(NCBI登录号:KJ716806)同源性高达99%。系统进化分析显示,该序列与囊状幼虫病毒(Sacbrood virus,SBV)中国分离株聚为一簇。但是,当感染CSBV的细胞传至第3代时检测不到CSBV。【结论】CSBV不能感染S2细胞而能感染Sf9细胞,且不能在后者中进行增殖,暗示后者可能含有某类可清除CSBV的因子,从而为寻找CSBV寄生增殖所必需的细胞因子提供了线索。     

应用核型多角体病毒载体在家蚕和家蚕培养细胞中高效表达人尿激酶原cDNA基因

将人尿激酶原(pro-UK)cDNA分别插入家蚕核型多角体病毒转移载体pBK283和pBF4中,构建成两个重组质粒。所构建的这两个重组质粒与野生型家蚕核型多角体病毒DNA(BmNPV genomic DNA)共转染家蚕培养细胞,经病毒斑实验(Plaque assay)筛选出含pro-UK cDNA的稳定重组病毒株BmNPV-pk1和BmNPV-pk2。将此两株重组病毒分别感染家蚕培养细胞和家蚕幼虫4天后,用酶联免疫测定法(ELISA),纤维蛋白平板溶圈测活法和Western印迹法分析细胞培养上清及细胞和家蚕的体液及组织,证实均有pro-UK表达。家蚕培养细胞的表达量分别为0.0012mg/mL(上清液和10~6细胞)和0.0031mg/mL(上清液和10~6细胞),家蚕幼虫体液的表达量分别为0.0100mg/mL和0.0300mg/mL。从以上结果可看出,家蚕幼虫体液的表达量是培养细胞的10倍,以上表达产物在纤维蛋白平板上测活均有溶纤活性。     

重庆地区家蚕微孢子虫遗传多态性分析

为探讨家蚕微孢子虫种内的遗传多样性,对本实验室保存的一株家蚕微孢子虫的SSUrDNA,rDNA—ITS,rDNA—IGS,Sec61β5’上游序列（Nb—IGS1）和Hsp70 5’上游序列（Nb—IGS2）进行了PCR扩增和序列测定．多重序列比对发现它们都存在着不同程度的多态性．其中rDNA—ITS和rDNA—IGS遗传多样性最为明显,序列中存在较大的差异区域,包括多碱基的插入或缺失、单碱基的转换和颠换;而对基因上游的调控序列分析发现,Nb—IGS1和Nb—IGS2序列中存在着少量的变异位点．结合GenBank中Nosema属微孢子虫的同源序列,分别构建rDNA-ITS和rDNA-IGS系统树,结果表明重庆地区家蚕微孢子虫遗传分化比较明显．研究表明家蚕微孢子虫种内存在遗传多样性．     

家蚕微粒子(Nosema bombycis)种群数量动态的研究

用家蚕微粒子(Nosema bombycis)对家蚕进行攻毒，诱发微粒子病发生，对染病蚕肠液、血液、体内微粒子种群数量动态分别进行了研究，结果表明：肠液内微粒子种群变化呈锯齿形上升变化，其增长规律可用一元线性回归方程表示；血液中微粒子种群随时间函数动态变化的数学模式可用3次方程来拟合；蚕体内微粒子种群则按指数增长方式随时间函数动态变化，属J型数学增长模式，从3个系统层次，3种不同的增长规律，揭示了3种完全不同的增殖机制。     

斜纹夜蛾微孢子虫在昆虫细胞系的体外培养

以受斜纹夜蛾微孢子虫(Nosema sp.)感染的斜纹夜蛾幼虫血淋巴感染草地贪夜蛾传代细胞系,建立了感染斜纹夜蛾微孢子虫的体外传代细胞.以这种体外细胞培养试验证明,斜纹夜蛾微孢子虫不能在37℃下发育,最适发育温度为25℃.用光学显微镜及电子显微镜的研究证明,斜纹夜蛾微孢子虫整个生活周期都以一对双核存在,母孢子以二分裂形成两个孢子母细胞;孢子具有一对双核的孢质、极管及极质体;极管为12～13圈,为典型的微粒子属.     

家蚕卵蛋白的 SDS-PAGE 分析(动物科学)

本研究探讨了蛋白质提取方法、十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)条件对家蚕卵蛋白分离效果的影响。分别用裂解液提取法、TCA沉淀法、冷丙酮沉淀法和TCA-丙酮沉淀法制备蛋白质样品,然后进行6%～12%、6%～15%两种梯度胶的SDS-PAGE,获得了不同提取方法和电泳条件下的电泳图谱用以比较家蚕卵蛋白分离效果。结果表明用TCA-丙酮沉淀法除盐,再用含9 mol.L-1尿素、4%CHAPS、1%DTT的裂解液重悬,最适合家蚕卵蛋白提取;6%～12%梯度胶对家蚕卵蛋白的分离较为适宜。利用这一优化方法对家蚕感染微孢子虫的蚕卵和正常蚕卵进行了比较研究,在分子量66 kD和85 kD处找到了与感染微孢子虫相关的蛋白,为进一步进行正常蚕卵和感染微孢子虫蚕卵的蛋白质组学研究奠定了基础。     

5种杀虫剂对家蚕的急性毒性评价

为评价农药对家蚕的安全性,指导农药的安全施用,避免家蚕农药中毒事件的发生。以家蚕(皓月×菁松)为试验生物,采用浸叶法对18%吡虫啉·氟酰脲悬浮剂等5种杀虫剂进行了急性毒性测试。结果表明,18%吡虫啉·氟酰脲悬浮剂、20%呋虫胺可溶粒剂、0.5%除虫菊素·苦参碱可溶液剂、20%唑虫酰胺.虫螨腈微乳剂、80%吡蚜酮·烯啶虫胺水分散粒剂5种杀虫剂对家蚕96 h的LC_(50)分别为0.451、0.923、0.766、23.18、21.40 mg a.i./L,其毒性依次为剧毒、高毒、高毒、中毒、中毒。尽管有2种农药对家蚕毒性中等,但其对家蚕96 h的LC_(50)临近中、高毒分界值20 mg a.i./L,其与另3种农药对家蚕均具有较高的风险性,不宜在桑园附近或桑叶生产中使用。     

质型多角体病毒在家蚕体内入侵与复制研究

采用在家蚕活体内研究家蚕质型多角体病毒(BmCPV)的入侵增殖复制过程,探讨BmCPV的入侵过程和增殖复制机制。实验用健康的三龄起蚕经口接种BmCPV后不同时间取中肠后部固定,制作电镜样品,在透射电子显微镜下观察,结果发现BmCPV病毒被食下1.5 h后,在中肠上皮组织圆筒形细胞微绒毛之间有病毒粒子存在,6 h后病毒进入微绒毛内,并向细胞质移动,9 h后观察到圆筒形细胞质中有病毒粒子。作者认为病毒入侵是以整个病毒粒子穿越中肠围食膜,吸附并进入微绒毛,感染圆筒形细胞,与前人病毒入侵只是髓核进入细胞,而病毒衣壳仍留在细胞外的推测不同。随后病毒核心物质进入细胞核,启动复制循环。经过隐潜期后病毒复制,在感染24 h后,细胞质中形成病毒发生基质,子代病毒开始形成,逐渐增多。感染48 h后,圆筒形细胞质中的多角体蛋白逐渐沉积并将病毒粒子包埋,最终形成新的多角体。     

重组痘苗病毒对不同哺乳动物细胞株的感染效率及EGFP表达水平研究

研究重组痘苗病毒对不同哺乳动物细胞的感染效率及表达水平，可为痘苗病毒表达系统宿主细胞的正确选择提供依据．本研究利用重组绿色荧光蛋白基因的痘苗病毒WR—EGFP同时感染不同的哺乳动物细胞株，利用流式细胞仪检测EGFP的表达强度．共使用20种哺乳动物细胞株，其中10种人类组织细胞，2种猴组织细胞。8种小鼠组织细胞．结果表明，重组痘苗病毒wR-EGFP对鼠细胞系BHK21和人细胞系A-549的感染效率和表达效率最佳；整体看，痘苗病毒对多数灵长类动物细胞的感染效率和表达效率优于鼠细胞；对贴壁细胞的感染效率和表达效率明显优于悬浮细胞；但没有特别的组织偏嗜性。     

Effects of Genistein on Cell Cycle and Apoptosis of Two Murine Melanoma Cell Lines

The effects of genistein on several tumor cell lines were investigated to study the effects of gen- istein on cell growth, cell cycle, and apoptosis of two murine melanoma cell lines, B16 and K1735M2. These two closely related murine melanoma cell lines, however, have different responses to the genistein treat- ment. Genistein inhibits the growth of both the B16 and K1735M2 cell lines and arrests the growth at the G2/M phase. After treatment with 60 μmol/L genistein for 72 h, apoptosis and caspase activities were de- tected in B16 cells, while such effects were not found in K1735M2. Further tests showed that after genistein treatment the protein content and mRNA levels of p53 increased in B16, but remained the same in K1735M2. The protein content and mRNA levels of p21WAF1/CIP1 increased in both cell lines after treatment. The results show that genistein might induce apoptosis in B16 cells by damaging the DNA, inhibiting topoi- somerase II, increasing p53 expression, releasing cytochrome c from the mitochondria, and activating the caspases which will lead to apoptosis.     

棉铃虫组织蛋白酶B在杆状病毒表达系统中的表达及鉴定

以棉铃虫（Helicoverpa armigera）组织蛋白酶B作外源基因重组构建克隆载体,自重组菌株HCB-DH10Bac、Histag-HCB-DH10Bac中提取穿梭质粒,脂质体法转染草地贪夜蛾卵巢细胞系Sf21细胞,转染液再感染细胞,收集感染3～4d的上清液,提取芽生病毒的DNA,PCR法鉴定外源HCB基因,感染上清进行SDS-PAGE、Western-blotting、蛋白酶活性检测．结果：感染上清中的芽生病毒的DNA作模板扩增出预期的1700bp片段,SDS-PAGE、westem-blotcing检测均在28ku处有明显表达产物,且表达产物有蛋白水解活性．     

Inhibiting mechanism of baculovirus p35 gene to apoptosis

We transfected Sf9 cells with an expressing vector p35IE1Neo containing antiapoptotic p35 gene and neomycin-resistant gene (as a selection marker). By G418 screening, we got transformed cells that appeared resistant to G418 and picked one clone named Sf9-35. By hybridization in situ, it was found that p35 gene had integrated into the chromosome of Sf9-35 cells; By using actinomycin D treatment and cellular DNA electrophoresis, Sf9-35 cells were found to resist apoptosis induced by infection of vAcΔp35 deleting p35 gene and actinomycin D treatment; And it was also found that apoptosis induced by viral infection and actinomycin D treatment can only be delayed, but can not be stopped in Sf9-35. Supported by the National Natural Science Fundation of China Li Xiaofeng: born in 1965, Lecturer     

家蚕微孢子（Nosema bombycis）对菜青虫（Pieris rapae）的感染与致病性研究

利用家蚕微孢子不污染蔬菜与环境,不感人、畜、甚至不会伤害虫天敌的特点,首次用其作为生物农药进行试验,并对重要蔬菜害虫菜青虫做了感染与致病性研究,结果证明微孢子能大量寄生在菜青虫体内,并得到理想的防治效果。     

对家蚕成品卵检疫技术的可靠性分析

成品卵检疫由于是对流通商品的质量检测，而母蛾检疫是对中间产品的质量检测，所以成品卵检疫应比母蛾检疫更具有质量保证。分析实验室试验与生产调查二方面的结果，成品卵毒率与微粒子病的遗传毒率、当代母蛾毒率及蚕茧产量间均存在明显的相关性，用成品卵毒率作为蚕种质量（这里主要指微孢子带毒率）的判定依据是可行的，也是可靠的。但是需着重强调的是，成品卵毒率的正确性与稳定性是成品卵检疫技术的关键，也是成品卵毒率可靠性的前提。     

Genistein and Daidzein Effects on Proliferation, Cell Membranes, Cell Cycles and Cell Apoptosis of Different Cell Lines

IntroductionIsoflavonoids are found mainly in soybeans,aprimary food source for humans and herbivores.The structure and function of isoflavonoids aresimilar to 1 7β- estradiol (1 7β- E2 ) ,and have dualeffects as both mammal oestrogenicity and anti-oestrogenicity,so they are also termed isoflavonicphytoestrogens(IPE) .It has been reported thatthese compounds can reduce blood fat,as well asthe risk of cancer and osteoporosis[1] .Genistein and daidzein are two principleisoflavonoids in soybe…     

Aminopeptidase N is a major receptor for the entero-pathogenic coronavirus TGEV.

Coronaviruses, like many animal viruses, are characterized by a restricted host range and tissue tropism. Transmissible gastroenteritis virus (TGEV), a major pathogen causing a fatal diarrhoea in newborn pig, replicates selectively in the differentiated enterocytes covering the villi of the small intestine. To investigate the molecular determinants of the infection, we characterized the surface molecule used by the virus for binding and entry into host cells. Here we report that aminopeptidase N, an ectoenzyme abundantly expressed at the apical membrane of the enterocytes, serves as a receptor for TGEV. Monoclonal antibodies were selected for their ability to block infection by TGEV of porcine cell lines. They recognized a brush-border membrane protein of M(r) 150K, which was identified as aminopeptidase N by amino-terminal sequencing. Two lines of evidence supported the view that the peptidase itself acts as a receptor. First, virions bound specifically to aminopeptidase N that was purified to homogeneity. Second, recombinant expression of aminopeptidase N conferred infectivity by TGEV to an otherwise non-permissive cell line.     

OA对人肝细胞HL-7702和肝癌细胞Bel-7402增殖的影响和对细胞凋亡的诱导作用研究

 以人肝细胞HL-7702和肝癌细胞Bel-7402为研究对象,通过MTT法、细胞外部形态观察、Annexin V.FITC&;PI双染法及TUNEL法等方法,研究了腹泻性贝毒的主要组分大田软海绵酸（Okadaic acid, OA）对其增殖的影响及对细胞凋亡的诱导作用。结果表明：OA对人两株细胞的增殖均有显著的抑制作用,24 h IC₅₀分别为65 ng/mL和60 ng/mL,且这种抑制作用呈剂量依赖性。OA导致两株细胞的形态均发生明显变化：细胞变圆,脱壁,细胞膜形成泡状突起,最终形成膜包裹的凋亡小体。Annexin V.FITC和PI双染法及TUNEL法检测均发现：OA能够诱导两株细胞发生不同程度的凋亡,且凋亡细胞的比例与OA的浓度相关。以上结果表明：OA能够通过抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡而对人肝细胞和肝癌细胞造成影响,且这种影响的程度与OA的浓度和作用时间密切相关。     

中国棉铃虫核多角体病毒(Heliothis armiqera NPV)VHA273毒株DNA转染传代细胞的研究

用饱和酚法抽提出VHA273-DNA。通过Ca盐共沉淀法将此DNA转染Ha,Sf,Bm三种细胞系,但多种方法未检出有该NPV及其蛋白组分产生。电镜观察表明,惟有Ha细胞核内出现明显病变,呈典型的浓核病症,并已产生大量的浓核病毒。文章认为,VHA273-DNA转染Ha细胞激活了细胞中潜伏的DNV,而DNV的大量复制抑制NPV的产生,说明VHA273-DAN有一定的活性,Ha细胞对VHA273-DNA有一定的敏感性。