重组质粒βhCG-pPIC9K的构建及嗜甲醇酵母(Pichia pastoris)的转化

目的 :为用基因重组技术表达hCG避孕疫苗抗原 ,构建在酵母细胞中表达的重组质粒βhCG -pPIC9K ,转化嗜甲醇酵母 .方法 :根据βhCG的cDNA序列设计两条引物 ,使上游带EcoRI酶切位点 ,下游带NotI酶切位点 ,以质粒 βhCG -PBSKS为模板 ,进行PCR扩增反应 ;将所得的DNA片段经EcoRI和NotI双酶切后用T4连接酶与pPIC9K质粒进行连接 ,然后导入大肠杆菌DH5α ,用PCR筛选阳性克隆并用双酶切鉴定重组子βhCG -pPIC9K .再用电打孔法转化酵母 (Pichiapastoris) ,用缺组氨酸MD平板筛选阳性株并在含G4 18的YPD培养基中筛选多拷贝插入菌株 .结果 :用所设计的引物扩增出两端分别带EcoRI和NotI酶切位点的βhCGDNA片段 ,插入pPIC9K并导入DH5α获得阳性克隆 ,经PCR反应和双酶切鉴定表明重组质粒是 βhCG -pPIC9K ,并转化嗜甲醇酵母获得耐受 4mg/mLG4 18的菌株 .结论 :构建了重组质粒 βhCG -pPIC9K并获得插入重组质粒 βhCG -pPIC9K的嗜甲醇酵母     

壳聚糖-卵透明带DNA纳米微囊的制备及其体外表达

目的：发展壳聚糖-卵透明带口服DNA粘膜免疫避孕疫苗。方法：首先利用基因工程技术构建含卵透明带特异抗原pZP3α DNA的真核质粒表达载体pVAX1-pZP3α，然后用壳聚糖C390包被pVAX1-pZP3α重组质粒制备免疫微囊，测定免疫微囊对质粒DNA的包裹率，用原子力显微镜(AFM)观察壳聚糖-DNA微囊的形态结构，并体外转染HeLa细胞，用间接免疫荧光法(IIF)检测pZP3α的瞬时表达。结果：pZP30αDNA正确插入到载体pVAX1中并与壳聚糖C390形成纳米免疫微囊，对重组质粒pVAX1-pZP3a的包裹率达90％以上，AFM成像技术显示这些微囊的直径为100nm到300nm不等，平均为224.6nm，形状为球形、椭圆形等。体外转染HeLa细胞用IIF法检测到了抗原pZP3α在细胞内的表达。结论：壳聚糖-卵透明带口服DNA纳米免疫微囊制备成功，为进一步发展更安全、方便、有效的卵透明带DNA避孕疫苗打下了基础。     

卵透明带DNA避孕疫苗pVAX1—pZP3α的构建及其在体外的培养

目的：构建pVAX1-pZP3α，探讨其在体外的表达，研制卵透明带DNA避孕疫苗，方法：利用基础工程的方法构建卵透明带DNA避孕疫苗pVAX1-pZP3α,用脂质体法转染Hela细胞并采用RT-PCR和Westem blot检测卵透明带抗原pZP3α的体外表达，结果：构建了卵透明带DNA避孕疫苗pVAX1-pZP3α，并在体外表达系统检测到卵透明带抗原pZP3α mRNA和pZP3α的表达。结论：正确构建了卵透明带DNA避孕疫苗pVAX1-pZP3α。     

构建表达猪卵透明带抗原(pZP3α)的重组乳酸杆菌

目的:构建表达猪卵透明带蛋白(pZP3α)的重组乳酸杆菌.方法:用PCR方法扩增得到短小乳酸杆菌染色体中的S-层蛋白的信号肽序列和猪卵透明带的pZP3α基因,并依次克隆到乳酸杆菌整合型表达质粒pllac的lac启动子下游,得到质粒pllac-pZP3α.将质粒pllac-pZP3α电穿孔转化干酪乳酸杆菌(L.casei CECT5276),挑选转化后的耐药菌落,在含5 μg/mL红霉素的MRS培养基中培养,抽提其基因组DNA做模板,PCR鉴定验证pZP3α基因是否整合到乳酸杆菌的基因组中.筛选重组菌在无红霉素选择压力下传代培养直至发生第2次重组使红霉素抗性基因消失.结果:酶切与测序结果表明信号肽和pZP3α基因正确克隆到载体pllac中;PCR鉴定证实pZP3α基因成功重组到乳酸杆菌的基因组中,培养50 d后重组乳酸杆菌抗性消失,用斑点免疫印迹化学发光法检测到经终质量分数为0.75%乳糖诱导后的上清中有pZP3α蛋白分泌.结论:成功构建表达pZP3α的重组乳酸杆菌,pZP3α在乳酸杆菌中得到了稳定的、分泌表达.     

卵透明带DNA避孕疫苗pVAX1-pZP3α的构建及其在体外的表达

目的:构建pVAX1-pZP3α,探讨其在体外的表达,研制卵透明带DNA避孕疫苗.方法:利用基因工程的方法构建卵透明带DNA避孕疫苗pVAX1-pZP3α,用脂质体法转染Hela细胞并采用RT-PCR和Western blot检测卵透明带抗原pZP3α的体外表达.结果:构建了卵透明带DNA避孕疫苗pVAX1-pZP3α,并在体外表达系统检测到卵透明带抗原pZP3αmuRNA和pZP3α的表达.结论:正确构建了卵透明带DNA避孕疫苗pVAX1-pZP3α.     

球孢白僵菌海藻糖-6-磷酸合成酶基因tps1真核表达载体的构建

本研究针对球孢白僵菌的tps1基因,通过双酶切和T4连接,构建了tps1基因的真核表达载体pPIC9K/tps1.PCR鉴定和测序表明,该重组质粒包含了球孢白僵菌tps1基因的全长cDNA序列.并且Bbtps1基因被正确地插入到了pPIC9K质粒的表达框中.因此,该重组质粒可以直接用于tps1基因的酵母表达.     

球孢白僵菌海藻糖-6-磷酸合成酶基因tps1真核表达载体的构建

本研究针对球孢白僵菌的tps1基因,通过双酶切和T4连接,构建了tps1基因的真核表达载体pPIC9K/tps1。PCR鉴定和测序表明,该重组质粒包含了球孢白僵菌tps1基因的全长cDNA序列。并且Bbtps1基因被正确地插入到了pPIC9K质粒的表达框中。因此,该重组质粒可以直接用于tps1基因的酵母表达。     

重组质粒βhCG—pPIC9K的构建及嗜甲醇酵？…

目的：为用基因重组技术表达ｈＣＧ避孕疫苗抗原,构建在酵母细胞中表达的重组质粒βｈＣＧ－ｐＰＩＣ９Ｋ,转化嗜甲醇酵母,方法：根据βｈＣＧ的ｃＤＮＡ序列设计两条引物,使上游带ＥｃｏＲⅠ酶切位点,下游带ＮｏｔⅠ酶切位点,以质粒βｈＣＧ－ＰＢＳＫＳ为模板,进行ＰＣＲ扩增反应;将所得的ＤＮＡ片段经ＥｃｏＲⅠ和ＮｏｔⅠ双酶切后用Ｔ４连接酶与ｐＰＩＣ９Ｋ质粒进行连接,然后导入大肠杆菌ＤＨ５α,用ＰＣＲ筛选阳性克     

重组人细胞色素P450 2C9在毕赤酵母中的胞内表达

以含有CYP2C9基因完全编码框的克隆载体质粒DNA为模板,并在人细胞色素P4502C9的5’端插入kozak序列及3’端6×His标签进行PCR扩增,克隆至真核表达载体pPIC3.5K,利用电激法将经Sal I线性化的重组质粒pPIC3.5K-2C9转化至毕赤酵母GS115中,通过抗性、表型和PCR筛选多拷贝整合株,甲醇诱导毕赤酵母GS115/pPIC3.5K-2C9的表达,SDS-PAGE和Western blotting分析鉴定表达产物.结果表明:含有重组质粒的重组pPIC3.5K-2C9表达了大小为55KD的目的蛋白,与预期大小相符,说明人细胞色素CYP2C9可在毕赤酵母的胞内表达.     

链霉菌H197 mtg基因毕赤酵母表达载体的构建与鉴定

将酵母胞内表达质粒pPIC3.5k重组成带有谷氨酰胺转胺酶的新型表达载体pPIC3.5k/MTG,为谷氨酰胺转胺酶（MTG）在毕赤酵母中的表达研究提供了实验基础.利用PCR的方法扩增出MTG基因片段,将目的片段和质粒pPIC3.5k进行双酶切后进行连接,构成重组质粒,然后转化至E.coli DH5α感受态细胞中,筛选阳性克隆,经测序证明为目的基因片段.结果表明：经过PCR和酶切均证明已经将目的片段转到酵母表达载体pPIC3.5k内.     

人甲状旁腺素在甲醇毕赤酵母中的分泌表达

选用酵母偏爱的密码子，人工合成长度为282bp的人甲状旁腺素(hFTH)基因，将其克隆于M13载体中，DNA测序验证正确。通过PCR从含有hFTH基因的M13载体获得了该基因，将其插入到含有AOX1启动子和α因子信号肽序列的表达载体pPIC9K中，构建了重组质粒pPIC9K-hFTH，电击法转化甲醇毕赤酵母(Picha pastoris)GS115菌株，经G418筛选得到高拷贝转化子，甲醇诱导表达，Tricine-SDS-PAGE电泳结果表明在9．3kDa处有明显的诱导蛋白带，与报道的hFTH的相对分子质量相近；酶联免疫沉淀法(ELISA)检测证明表达的蛋白具有hFTH免疫活性为132ng／L。     

pVT102U/α-bgln重组真核表达质粒的构建和鉴定

构建重组真核表达质粒pVT102U/α-bgln使之可以在酿酒酵母中表达以获得β-葡糖苷酶,用于提高从植物中提取白藜芦醇的得率.以含有从黑曲霉中获得的编码β-葡萄糖苷酶(bgln)成熟肽的cDNA的克隆质粒pMD19T-bgln为模板,用PCR的方法扩增β-葡糖苷酶基因片段(bgln),利用真核表达载体pVT102U/α构建pVT102U/α-bgln重组质粒,PCR结果显示扩增片段约2.6 kb,与预期相同.用酶切电泳验证重组结果的正确性,重组质粒酶切后显示其大小约10 kb,大小及酶切图谱与预期相同.测序检测质粒重组后序列情况,经测序发现插入片段两端序列无改变,且读码框正确.pVT102U/α-bgln质粒构建成功.     

新疆绵羊β-乳球蛋白(BLG)5′端调控区的克隆与序列测定

用聚合酶链式反应(PCR)技术,从新疆绵羊全血中扩增了β-乳球蛋白5′端调控区890bp的片段.通过T4 DNA连接酶将其连接于质粒载体pGEM-T上,转化至受体菌DH5α中.提取质粒经PCR扩增、酶切鉴定,证明重组质粒pT-BLG中含有β-乳球蛋白5′端调控区基因片段.经核苷酸序列测定,克隆的片段与发表的基因序列高度一致.     

人骨唾液酸蛋白在巴斯德毕赤酵母中的高效分泌表达

以PCR方法扩增人bsp基因，与分泌型表达载体pPICZαA重组，重组质粒经电击转化毕赤酵母GS115菌株，获得的GS115／pPICZαA－hbsp表达菌株能高效分泌表达rhBSP.SDS-PAGE和Western blot分析结果表明，产物的分子质量接近66ku，能发生特异性抗原－抗体反应。     

轮状病毒VP7基因的克隆及核苷酸序列分析

用反转录聚合酶链反应（RT－PCR）技术，从轮状病毒感染的细胞中扩增了916bp的VP7片段中抗原表位区。通过T4DNA连接酶将其直接连接于克隆载体质粒pGEM-T上，转化至受体菌DH5a中。提取质粒经PCR扩增、酶切鉴定，证明重组质粒pT-V7中含有轮状病毒的VP7基因片段。经核苷酸序列分析，表明正确克服了轮状病毒主要保护性抗VP7基因中抗原表位区。     

B7-1和新型隐球菌DHA1基因嵌合重组质粒的构建

目的构建包含新型隐球菌细胞免疫主要相关基因-迟发超敏反应抗原基因(delayed-type hypersentivity antigen 1，DHA1)与小鼠共刺激分子B7-1的嵌合重组质粒。方法设计合成两对寡核苷酸引物。用PCR法分别从pUCmB7-1TM和新型隐球菌重组质粒pcDNA3-DHA1中特异扩增出编码B7-1和DHA1的基因片段(921和984bp)。分别用HindⅢ、EeoRⅠ、XbaⅠ酶切后。逐个定向连接到质粒pcDNA3中，转化宿主菌DH-5α．分别用上述内切酶酶切及DNA测序鉴定重组质粒。结果酶切鉴定示所切下的片段大小均与预计相符，测序结果与献报道序列及预计结果一致。证实符合表达框架。结论本实验成功构建了新型隐球菌嵌合重组质粒pcDNA3-B7-1-DHA1。为进一步研究新型隐球菌DNA免疫奠定了基础。     

β葡聚糖酶杂合基因bglHAM的克隆及在P.pastoris中的表达

采用PCR的方法,以Bacillus macerans总DNA为模板,构建出β-1,3-1,4葡聚糖酶杂合基因bglHAM,与巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K重组,得到重组质粒pPIC9K-HAM,电脉冲转化法转化酵母菌GS115,KM71,在MM,MD平板上筛选表型,YPD-G418平板上筛选多拷贝重组子,重组菌株经甲醇诱导后,刚果红平板染色法检测到β-葡聚糖酶活性,SDS-PAGE证明表达产物的分子量约为24kD,摇瓶诱导培养筛选到的重组菌株,胞外每mL发酵液最高酶活达240U。     

分泌性BACE1蛋白在昆虫细胞的表达

为了获得有活性的重组β-secretase并研究其功能,寻找特异性抑制剂,应用RT-PCR技术,从人胚胎脑组织特异性扩增并克隆了人BACE1编码基因的胞外片断(BACE1-454)。测序后与质粒pFastBac连接,得到含BACE1-454基因的重组质粒pFast-BACE1-454。将其转化到含有杆状病毒穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中进行转座重组,用琼脂糖凝胶电泳和PCR扩增对重组穿梭载体Bacmid-BACE1-454进行鉴定。将Bacmid-BACE1-454经脂质体介导转染Sf9细胞,收获病毒。用重组杆状病毒颗粒感染昆虫细胞,表达蛋白,免疫印迹证实所获蛋白产品具有特异的免疫反应性。     

胞壁形式表达融合蛋白Der p2-PEB1重组BCG的构建和鉴定

利用重组BCG技术,构建能以胞壁形式表达屋尘螨Der p2和PEB1抗原的重组BCG口服哮喘疫苗pCW-Der p2-PEB1-rBCG,以pCW-Der p2质粒和pUC-PEB1质粒DNA为模板扩增基因,构建出重组质粒pCW-Der p2-PEB1.将重组质粒电穿导入BCG感受态细胞,潮霉素抗性筛选rBCG阳性克隆.阳性rBCG经PCR特异性扩增目的基因片段Der p2及PEB1,证实其中含有目的基因.用抗Der p2单克隆抗体和制备的小鼠PEB1抗血清对rBCG进行间接免疫荧光鉴定.结果成功扩增了Der p2及PEB1基因,构建出重组质粒pCW-Der p2-PEB1,并将质粒电穿入BCG中,免疫荧光法鉴定其成功.说明成功地构建了胞壁表达Der p2-PEB1融合蛋白重组BCG pCW-Der p2-PEB1-rBCG.为基因工程疫苗的研制奠定了基础.     

长片断引物反向PCR方法构建重复序列的重组质粒

构建重复序列的重组质粒比较困难,因为扩增重复序列会产生多聚物.利用长片断引物反向PCR方法构建重组质粒pET20b-C1-Xyn-C1,将碳水化合物结合模块C1连接在木聚糖酶Xyn两端,为类似质粒的构建提供新方法.第一步,以C1特异性正向引物LF、载体特异性反向引物VRP从pET20b-Xyn-C1模板上扩增C1-pET20b长片断DNA,作为第二步的正向引物;第二步,以pET20b-C1-Xyn为模板,Xyn特异性反向引物RX,正向引物与模板上pET20b同源区域匹配,阻止了模板上C1同源区域的匹配,从而抑制多聚物产生;反向PCR扩增得到线性重组质粒C1-pET20b-C1-Xyn,将此线性产物用T4 DNA连接酶连接后转化DH5α感受态细胞,得到含重复序列的pET20bC1-Xyn-C1转化子.