松属编码区微卫星特征和相应基因功能分析（英文）

从GenBank下载453 892条松属EST序列,序列组装后得到20 886条contig。用Sputnik软件从这些contig中查找了2 678个微卫星,其中3碱基重复微卫星占的比例最高,为59.2%,而其他重复长度的微卫星都相对较低,比例分别为:2碱基重复微卫星占12.0%,4碱基重复微卫星占13.3%,5碱基重复微卫星占15.5%。3碱基重复微卫星变化引起的基因读码框改变最小,松属树种基因区3碱基重复微卫星的富集显示了强烈的密码子选择效应。此次研究还对查找到的微卫星进行了引物设计和扩增分析。实验结果显示,设计的微卫星引物在云南松中的扩增成功率是72.9%。从扩增成功的引物中进一步选取了155对引物,对14个松属树种和1个黄杉属树种进行了引物通用性实验分析,结果显示155对引物在14个松属树种间的通用性在71.0%以上,而在黄杉属树种中的通用性只有25.2%。对松属树种中含有微卫星的基因进行了功能分类研究,结果显示基因在是否保留微卫星序列方面有显著分化,微卫星参与了如细胞成分分类的共质体组成、病毒颗粒及病毒颗粒组成、生物节律调控,以及生长素转运蛋白等生物学过程。     

松属编码区微卫星特征和相应基因功能分析

从GenBank下载453 892条松属EST序列,序列组装后得到20 886条contig。用Sputnik软件从这些contig中查找了2 678个微卫星,其中3碱基重复微卫星占的比例最高,为59.2%,而其他重复长度的微卫星都相对较低,比例分别为:2碱基重复微卫星占12.0%,4碱基重复微卫星占13.3%,5碱基重复微卫星占15.5%。3碱基重复微卫星变化引起的基因读码框改变最小,松属树种基因区3碱基重复微卫星的富集显示了强烈的密码子选择效应。此次研究还对查找到的微卫星进行了引物设计和扩增分析。实验结果显示,设计的微卫星引物在云南松中的扩增成功率是72.9%。从扩增成功的引物中进一步选取了155对引物,对14个松属树种和1个黄杉属树种进行了引物通用性实验分析,结果显示155对引物在14个松属树种间的通用性在71.0%以上,而在黄杉属树种中的通用性只有25.2%。对松属树种中含有微卫星的基因进行了功能分类研究,结果显示基因在是否保留微卫星序列方面有显著分化,微卫星参与了如细胞成分分类的共质体组成、病毒颗粒及病毒颗粒组成、生物节律调控, 以及生长素转运蛋白等生物学过程。     

基于NCBI核酸数据库资源的产黄青霉微卫星序列的筛选

利用生物信息学方法在产黄青霉基因组中筛选微卫星序列,并对其基因组中微卫星数量和丰度进行了研究.利用SSRHunter1.3软件在长度为30 090 464 bp的产黄青霉基因组中共找到163个微卫星序列.其中以两碱基重复类型数目最多,为133个,占重复序列总数目的 81.60%;其次是三碱基重复为29个,占17.79%;最后是四碱基1个,占0.61%.在两碱基重复序列中,AT(44.79%)重复类别最多,其次是AG(23.92%).在三碱基重复序列中,共发现9种重复类别,其中以AAG和ACT重复类型最多,为6个(3.68%),其次是ACC(2.45%),最少的是AGC(0.61%).四碱基重复中,只有1种重复类别,为ATGT(0.61%).同时选取二碱基的重复次数在7以上和三碱基的重复次数在6以上的微卫星序列,利用Primer Premier 5.0软件设计了引物,共得到30对引物.本研究不仅为后续产黄青霉微卫星标记的筛选奠定了基础,也丰富了其基因组学资源,对产黄青霉的种群遗传结构分析、分子标记选育和遗传多样性有重要意义.     

松属树种种苗鉴定中AFLP指纹技术的研究

AFLP(扩增片段长度多态性)标记技术是高效而可靠的标记技术之一，特别对于那些基因组序列信息很少的物种更为有效。笔对基因组较大的松属树种的AFLP实验程序进行了优化，提供了松树树种AFLP分析中DNA酶切、引物连接、预扩增及选择性扩增的优化实验程序。结果显示．预扩增反应中利用选择碱基数不同的预扩增引物(E/M 1，E／M-2)制备的模板对后续的选择性扩增结果没有显影响；在选择性扩增反应中，对碱基数目选择进行了细致的优化．分别测试了15个E-3M-3引物组合，6个E 4/M 3引物组合及15个E 3/M 4引物组合。对于有相同选择碱基数的引物．扩增结果随选择碱基的组合不同而有较大差异。据总的扩增结果发现，选择碱基增加时．扩增谱带数明显减少，谱带清晰度增加，即当选择碱基增加到E引物末端时(M十4／E 3)，大多数引物组合的扩增谱带数要比选择碱基增加到M引物末端(E 3/M 4)的引物组合扩出的谱带数少且带型清晰。总体来看，E 4/M 3的引物组合比较适合于松属树种的AFLP分析。笔还利用单株树种子的胚乳组织对AFLP标记的遗传方式进行了研究，在所用的两个引物组合获得的标记中，约有30％左右的分离标记．分离标记中偏分离比例约为6％。另外．选用3个松属树种对选出的14个AFLP引物组合进行的验证显示，这些组合在不同种间均获得了较好的扩增结果．说明在不同松属树种中筛选出的引物组合可以为其它松属树种AFLP分析引物组合的选择提供借鉴。     

萼花臂尾轮虫(Brachionus calyciflorus)的ISSR引物筛选及其多态性检验

采用简单重复序列区间(ISSR:一种基于微卫星的分子标记,无需预知遗传背景即可研究基因组中微卫星序列的变异,适合大规模的种群遗传研究)的方法对萼花臂尾轮虫(Brachionus calyci florus)进行PCR扩增,优化出适宜的ISSR-PCR反应体系,并从100条引物中筛选出16条具有良好多态性和重复性的ISSR引物.研究结果显示,萼花臂尾轮虫简单重复序列以(AC)和(AG)的两碱基重复为主,筛选出的ISSR引物扩增共得到114个位点,66个多态位点,多态性高达57.89%,高于常用于该物种分子生态学研究的线粒体COI基因的多态性.     

油茶基因组微卫星特征分析

对油茶基因组约10%覆盖度的DNA序列进行微卫星查找,共获得11 344个重复单元长度为1～6碱基的微卫星。在此基础上,通过对这些微卫星序列分析发现:在油茶基因组中长度为二核苷酸的微卫星重复单元最为丰富,占27.1%;在单碱基重复和二碱基重复这两种类型中,最主要的优势重复单元分别是A/T以及AT/TA、AG/TC。三碱基、四碱基、五碱基重复类型中,(AAN)n、(AAAN)n和(AAAAN)n为对应的优势重复单元,这些优势重复单元中富含碱基A和T。油茶基因组中变异程度高的微卫星(长度≥20 bp)约占11.7%。分析还发现,除单核苷酸重复微卫星外,油茶基因组微卫星长度的变异速率与重复单元长度呈负相关,即油茶基因组中长度较短的微卫星变异速率较快,而较长的重复单元变异速度较慢,相对较为稳定。     

杨树微卫星序列对基因表达频率的影响及表达序列中微卫星特征的分析

微卫星是真核生物基因组中的一类高度重复的序列,一般分布在内含子区和基因间隔区中,但基因编码区也含有一定数量的微卫星。为探讨含有微卫星的基因表达频率是否偏低,对NCBI公共数据库中的421 725条杨树EST序列进行了分析,结果发现：其中53 524条EST序列中含有微卫星,含微卫星的EST序列比例是1269 %;而杨树基因组注释的45 555个基因中,有6 953个基因含有微卫星,含微卫星的基因占基因总数的比例为1526 %。对两样本频率进行差异显著性检验,结果显示微卫星在表达序列中的发生频率显著低于在注释基因中的发生频率(p<001),这说明含有微卫星的基因总体上表达水平偏低。 而对表达序列中微卫星的特征进行分析的结果显示,三碱基重复微卫星含量最丰富。在此,笔者提出了基因组中含有微卫星的基因可能总体表达水平偏低的假说,并利用杨树公共数据库中海量DNA序列对这一假说进行了验证。     

黄姑鱼转录组SSR的开发与验证

利用MISA软件对黄姑鱼转录组测序数据进行分析,共检索到微卫星(simple sequence repeats,SSR)位点12 254个,其中单碱基、二碱基、三碱基重复分别约占42.70%、32.11%、23.44%,四碱基、五碱基、六碱基重复仅分别约占1.60%、0.09%、0.06%。随机选出80个二至六碱基重复来设计PCR引物,有38对引物通过扩增可获得目的条带。利用南海海区野生黄姑鱼样本对其中的18个具有多态性的SSR位点进行扩增效果验证和评价,结果显示:18个SSR的平均等位基因数为7.67,平均有效等位基因数为4.571,平均观测杂合度为0.3984,平均期望杂合度为0.7518,平均多态信息含量为0.6799,其中有15个位点表现出高多态性(多态信息含量0.5)。与传统方法相比较,利用转录组测序数据开发微卫星标记更加省时、高效。     

水稻亚种间基因组水平微卫星多态性分析

从公布的水稻两个亚种（籼稻9311和粳稻Nipponbare）基因组草图序列中,搜寻了所有的完整微卫星位点,发现单碱基重复中A/T重复占大多数,二碱基重复中AT/TA、GA/TC、AG/CT重复居多,三碱基中GGC/GCC、GCG/CGC、CCG/CGG重复较多。通过相互比较,不同基序和基因区域的微卫星多态性有较大差异：内含子和基因间区中微卫星的多态性较高（分别约为45%和40%）,外显子中的微卫星多为三碱基重复,而且多态性较低（约为25%）;两个亚种具多态性的微卫星间距平均约为12.7 kb和16.4 kb。     

3种金线鲃属鱼类基因组微卫星的筛选与分析

利用生物信息学的方法,基于已公布的滇池金线鲃、安水金线鲃和犀角金线鲃的全基因组序列,筛选出3种金线鲃全基因组中的微卫星,并对所得数据进行分析。结果显示:在滇池金线鲃、安水金线鲃和犀角金线鲃全基因组中分别筛选出完美微卫星851 732个、849 226个和848 258个,其丰度分别为543. 39个/Mb、561. 32个/Mb和557. 52个/Mb; 3种金线鲃鱼类基因组中二碱基重复类型最多,分别占全部微卫星总数的50. 24%、40. 72%和40. 72%,其次是单碱基四碱基三碱基五碱基六碱基;安水金线鲃和犀角金线鲃基因组中的核心重复类别比例最高的为A,而滇池金线鲃核心重复序列比例最高的为AC; 3种鱼类基因组微卫星序列分布结果表明,位于外显子上的数量远低于内含子和基因间隔区。     

长薄鳅基因组四碱基重复微卫星的分离及序列特征分析

采用生物素探针(GATA)8杂交和磁珠富集法直接从长薄鳅基因组中分离出了一批四碱基重复微卫星DNA,并对其序列特征进行了分析.随机挑取200个单克隆进行筛选,得到175个阳性单克隆(87.5%).测序发现共有117个阳性克隆含有微卫星重复单元.通过序列比对,排除重复测的序列后,得到91条重复类型和重复次数不同微卫星的序列,其中含四碱基重复的微卫星有62条.与探针相同或互补(GATA/CTAT)n的四碱基重复微卫星位点数最多,此外,还检测到其它的四碱基重复类型,如(AGAC/TCTG)n、(AAGA/TTCT)n、(GATG/CTAC)n,以及(CT)n＋(ATAG)n和(AT)n＋(ATAG)n二碱基和四碱基复合型微卫星位点.获得的长薄鳅基因组四碱基重复微卫星位点中,属于完美型的最多,有30条(48.4%),其次为复合型,有29条(46.8%),非完美型的有3条(4.8%).大多数的四碱基微卫星(31条)重复次数为10～19次,占50.0%,其次为20～29次和5～9次四碱基重复,均为22.6%,30次以上的四碱基重复较少,仅有3条(4.8%).     

白鹭基因组微卫星分布规律研究

【目的】研究白鹭(Egretta garzetta)的全基因组微卫星分布规律。【方法】利用生物信息学方法对已报道的白鹭全基因组进行查询和分析。【结果】白鹭全基因组中1～6个碱基重复的微卫星有255 630个,序列总长度为4 282 844bp,占全基因序列长度的0.37%。不同重复类型的微卫星中,单碱基的数量最多,有207 108个,占全部类型的81.0%;然后依次是二碱基、三碱基、四碱基、五碱基、六碱基,分别占全部类型的6.4%,5.3%,4.9%,2.0%和0.4%。A,C,AC,AT和AG是白鹭基因组微卫星序列中重复数量较多的拷贝类型,占全部重复类型的87.4%。在白鹭基因组中,按降序排列,重复类型出现次数超过1 000次的有17个,分别是T,A,AT,G,C,AC,GT,ATT,AAT,ATTT,AGG,AAAC,CCT,AAAT,CT,GTTT和AG,占全部微卫星数量的92.7%。【结论】研究结果对白鹭微卫星的筛选及深入研究提供了数据支持。     

碧桃花瓣转录组微卫星特征分析

为开发碧桃转录组微卫星信息,利用454高通量测序技术,对其花瓣转录组序列进行SSR位点发掘,结果发现含SSR的序列4 705条,共得到5 668个SSR,平均每3.49 kb出现1个SSR。微卫星序列主要以三碱基重复为主,约占总数的42.66%。笔者共发现516种碱基重复基元,所占比例最高的为(AG/CT)n(18.34%),其次是(AAG/CTT)n(12.42%)。微卫星多为重复长度小于20 bp的短序列,长度大于20 bp的微卫星仅占总数的12.13%。研究还发现碧桃花瓣微卫星的频率和长度呈显著负相关(P0.05),相关系数为-0.246。     

甜酸角基因组微卫星序列特征分析

甜酸角是干热河谷地区有多重价值的重要经济树种,对其SSR引物的开发有助于该物种的遗传学研究以及资源的利用与保护.研究通过Illumina高通量测序技术和MISA软件开发出甜酸角全基因组SSR序列,共7个类型9 447个,其中以单核苷酸重复类型最多.在不同重复类型中,A/T碱基含量显著高于G/C;在不同长度重复单元中,单核苷酸重复类型的微卫星长度变异程度最高,二核苷酸重复类型微卫星长度变异程度也较高,各重复类型微卫星的长度与微卫星出现的频率呈负相关.获得的微卫星序列以及相关分析结果,较全面地反映了甜酸角基因组微卫星的特征和潜在功能,将有助于后续的一系列遗传学研究.     

雌核发育棕点石斑鱼EST-SSR的开发验证

通过人工雌核发育棕点石斑鱼(Epinephelus fuscogutatus)的转录组序列,共获得了24 359个微卫星位点,棕点石斑鱼转录组的微卫星重复基序具有不同的分布特征,其中以单碱基(34.05%)、二碱基(37.58%)和三碱基(22.75%)为主要的EST-SSR基序重复类型.根据微卫星引物设计原则,随机筛选了93个EST-SSR位点来进行引物合成和多态性检测,最终开发了48个具有多态性的微卫星标记,并在不同棕点石斑鱼群体中进行了初步的验证.结果显示:每个位点等位基因数(Na)为2～22,平均等位基因数为9;观测杂合度(H_0)为0.111～1.000,期望杂合度(He)为0.636～0.940;多态信息含量(PIC)为0.538～0.922个,表明48个EST-SSR位点均表现出高多态性(PIC 0.5).结果表明:基于雌核发育棕点石斑鱼转录组数据,开发微卫星标记是可行的.本研究所开发的具有多态性的微卫星标记可应用于棕点石斑鱼及其近缘种的遗传多样性分析和分子标记辅助育种研究.     

异源多倍化引起的小麦微卫星序列变异

利用80对小麦微卫星引物调查了小麦黑麦双二倍体形成过程中微卫星序列的变异情况.结果显示: 8对引物能从杂交F1植株及亲本小麦植株的基因组中扩增出相同的带型,而在新合成的双二倍体中条带缺失;4对引物从杂交F1植株及亲本小麦植株的基因组中扩增出相同的带型,而在新合成的双二倍体中扩增的条带变短;其余引物从亲本小麦、F1植株及双二倍体中扩增的带型相同.将有长度变化的条带回收测序,发现双二倍体中的条带变短现象是由二核苷酸重复单位减少所致.这些结果表明:常发生在二倍体生物中的微卫星序列变异现象在植物异源多倍化过程中也会发生,异源多倍化可能是促进微卫星进化的又一个不可忽视的动力.和二倍体生物一样,异源多倍化诱导的微卫星序列进化也表现为长的重复序列趋向缩短.     

基于RNA-seq的崇左金花茶EST-SSR标记开发

本研究分析了崇左金花茶(Camellia chuongtsoensis)转录组水平的EST-SSR特征.从崇左金花茶转录组数据组装获得的35 410个Unigene中,共鉴定出2~7不同核苷酸重复类型的SSR位点7 754个,分别分布于6 394条序列中,其中1 121个Unigene具有两个以上的位点.在转录组中SSR位点出现频率为21.90%,分布密度为1/3.6kb;在所有重复单元中,二碱基微卫星占主要优势,占SSR位点总数的61.3%.利用Primer 3.0设计引物,共计3 303条Unigene成功设计出引物.随机选择10对SSR引物,对一个崇左金花茶群体进行扩增多态性分析,8对引物能够扩增出符合预期大小的PCR片段,其中4对引物成功检测出多态.以上结果表明,转录组数据能够提供丰富的SSR位点,用于快速高效地开发SSR引物,所开发的引物可为崇左金花茶遗传多样性的研究以及种质资源的鉴定与保护等方面提供分子基础.     

基于转录组的曼氏无针乌贼SSR与SNP位点信息分析

利用IlluminaHiseq平台对曼氏无针乌贼进行了转录组测序,采用生物信息学方法分析了转录组序列中的SSR、SNP位点信息并设计了SSR引物。利用MISA工具筛选了转录组测序获得的127 575条Unigene序列,共得到分布于50 626条序列中的SSR位点108 685个,SSR发生率39.68%,出现频率为85.19%。平均每949 bp含有1个SSR位点。在50626条含有SSR位点的Unigene序列中,有25 548条Unigene包含SSR位点数目在2个及以上。其中单碱基重复是EST微卫星序列的主要形式(42.84%),其次是二碱基重复(28.73%),三碱基重复(14.93%)和四碱基重复(12.79%)。在所有微卫星序列所包含的重复单元中,优势重复基元类型为A/T(占总SSRs的42.23%),其次为AT/AT (13.33%),AC/GT (9.32%),AAAG/CTTT(10.00%)。运用Primer premier 5软件共设计了46 520对SSR引物。在12 323条Unigene中发掘出SNP位点64 732个,每条Unigene平均含5.25个SNP位点。其中转换(Transition) 45 975个(71.02%),颠换(Transversion) 18 757个(28.98%)。本研究通过第二代高通量测序技术,结合生物信息学方法对曼氏无针乌贼进行了SSR位点与SNP位点的开发,为其遗传多样性分析、分子辅助育种和增殖放流效果评估等提供了有力研究工具。     

分子标记及AFLP技术

分子标记类型可以基因表达的结果为基础,对基因的间接反映;分子标记则是DNA分子碱基序列变异的直接反映.早期利用限制性内切酶,酶切生物体DNA后来检测不同遗传位点等位变异(RFLP)和以一个碱基顺序随机排列的寡核苷酸序列为引物,利用对基因组DNA随机扩增来鉴别DNA多态性(RAPDs).真核生物基因组中普遍存在的重复序列产生了微卫星(microsatellites)标记技术.而RFLP与RAPDs有机结合形成了有着更为广阔的应用前景的AFLP技术.SNP标记利用大多数基因位点上都会有若干个等位型(alleles)为DNA芯片技术应用于遗传作图提供了基础.     

口虾蛄转录组微卫星标记开发

采用高通量测序技术获得的口虾蛄转录组测序数据,筛选具有多态性的SSR标记。结果共获得87 355条Unigene,67 657个微卫星位点,其中双碱基重复和三碱基重复的SSR较多,分别有30 235个和17 590个,占总数的44.69%和26%。获得230种重复类型,其中双碱基中的AC/GT重复和三碱基中的AGG/CCT重复是重复次数较多的重复类型。从中挑选碱基重复次数较多的微卫星引物共50对进行合成。用北海24个口虾蛄样品进行验证,获得条带清晰和多态性好的引物6对。6个微卫星位点在口虾蛄北海群体的遗传多样性分析中均表现出较高的多态性。平均有效等位基因数(k)为5.17,观测杂合度(Ho)为0.437 2,平均期望杂合度(He)为0.672 4,多态信息含量为(PIC)为0.602 3,这说明开发的6对SSR标记均适合群体遗传多样性研究。为口虾蛄进一步遗传多样性的研究奠定了基础。