雌核发育棕点石斑鱼EST-SSR的开发验证

通过人工雌核发育棕点石斑鱼(Epinephelus fuscogutatus)的转录组序列,共获得了24 359个微卫星位点,棕点石斑鱼转录组的微卫星重复基序具有不同的分布特征,其中以单碱基(34.05%)、二碱基(37.58%)和三碱基(22.75%)为主要的EST-SSR基序重复类型.根据微卫星引物设计原则,随机筛选了93个EST-SSR位点来进行引物合成和多态性检测,最终开发了48个具有多态性的微卫星标记,并在不同棕点石斑鱼群体中进行了初步的验证.结果显示:每个位点等位基因数(Na)为2～22,平均等位基因数为9;观测杂合度(H_0)为0.111～1.000,期望杂合度(He)为0.636～0.940;多态信息含量(PIC)为0.538～0.922个,表明48个EST-SSR位点均表现出高多态性(PIC 0.5).结果表明:基于雌核发育棕点石斑鱼转录组数据,开发微卫星标记是可行的.本研究所开发的具有多态性的微卫星标记可应用于棕点石斑鱼及其近缘种的遗传多样性分析和分子标记辅助育种研究.     

基于高通量测序的鹿角杯形珊瑚微卫星标记的开发

为了更深入开展珊瑚遗传结构及其多样性研究,本研究采用高通量测序对鹿角杯形珊瑚进行微卫星标记的开发。首先用人工白化的方法获得污染较低的鹿角杯形珊瑚,然后使用该样品DNA,基于高通量测序平台对鹿角杯形珊瑚简化基因组进行了测序,最终设计得到鹿角杯形珊瑚微卫星引物2 786对。利用海南三亚鹿角杯形珊瑚对其中6对多态性较高的微卫星标记进行了评价。每个微卫星位点的有效等位基因数(Ne)为2.198～5.000;观测杂合度(Ho)为0.531～0.875;期望杂合度(He)为0.512～0.816;Shannon多样性指数为0.856～1.829;多态信息含量(PIC)为0.441～0.777,其中有4对微卫星标记呈现为高度多态性(PIC 0.5),2对微卫星标记为中度多态性。经过Bonferroni校正后,只有微卫星标记LB11偏离哈迪—温伯格平衡;连锁不平衡检验结果表明,位点之间不存在连锁不平衡现象。     

红花EST-SSR分子标记开发与初步验证

旨在开发红花EST-SSR标记,为红花分子辅助育种和种质资源评价提供有力工具.先对红花转录组进行测序,选用MISA软件筛选鉴定SSR位点.在云南红花(YH)转录组中,共获得46 016个SSR位点,分布频率为32.09%,平均每3.11 kb有一个SSR.云南红花SSR位点以二,三核苷酸重复基序为主,其优势重复基序分别为AG/CT(44%)和AAG/CTT(24%).SSR位点重复次数相差较大,其中重复为5次比率最高,SSR位点数为9 369(26.63%),其次为6次(8 148, 23.16%).同时,利用Primer3.0进行引物设计,随机筛选27对引物,在60份不同来源红花种质中进行多态性验证,获得12对具有多态性稳定的引物,多态性引物比率为44.4%.结果表明,基于红花转录组序列开发SSR标记是可行的,开发的标记具有稳定扩增性,丰富多态性等优点,开发的SSR标记将有助于红花功能基因挖掘,遗传连锁图谱构建和遗传多样性分析.     

基于高通量转录组测序技术的龙头鱼微卫星信息分析

为龙头鱼资源合理开发与保护提供有效分子标记,本研究利用IluminaHiSeq~(TM) 2500高通量测序平台对采自舟山近海的龙头鱼肌肉组织进行转录组测序,从获得的Unigenes序列中挖掘SSR位点信息并分析其分布及特征。结果显示,测序所得29 756条Unigenes中共识别出5 652个完美型SSR位点,序列总长度为86 517 bp,相对丰度为332.97个/Mb。龙头鱼转录组SSR以单碱基和二碱基重复类型居多,分别占SSR总数的67.59%和20.72%。6类完美型SSR共有重复基元148种,重复次数以10次为主,占总SSR的23.23%。SSR序列长度范围在10～92 bp之间,其中序列长度在12 bp及以上的SSR位点的含量为65.73%。综上所述,龙头鱼转录组SSR位点含量丰富、基元重复类型众多、重复次数较高,具有良好的分子标记开发潜力,获得的SSR标记可用于遗传多样性和系统发育关系研究。     

黄姑鱼转录组SSR的开发与验证

利用MISA软件对黄姑鱼转录组测序数据进行分析,共检索到微卫星(simple sequence repeats,SSR)位点12 254个,其中单碱基、二碱基、三碱基重复分别约占42.70%、32.11%、23.44%,四碱基、五碱基、六碱基重复仅分别约占1.60%、0.09%、0.06%。随机选出80个二至六碱基重复来设计PCR引物,有38对引物通过扩增可获得目的条带。利用南海海区野生黄姑鱼样本对其中的18个具有多态性的SSR位点进行扩增效果验证和评价,结果显示:18个SSR的平均等位基因数为7.67,平均有效等位基因数为4.571,平均观测杂合度为0.3984,平均期望杂合度为0.7518,平均多态信息含量为0.6799,其中有15个位点表现出高多态性(多态信息含量0.5)。与传统方法相比较,利用转录组测序数据开发微卫星标记更加省时、高效。     

基于RNA-seq的崇左金花茶EST-SSR标记开发

本研究分析了崇左金花茶(Camellia chuongtsoensis)转录组水平的EST-SSR特征.从崇左金花茶转录组数据组装获得的35 410个Unigene中,共鉴定出2~7不同核苷酸重复类型的SSR位点7 754个,分别分布于6 394条序列中,其中1 121个Unigene具有两个以上的位点.在转录组中SSR位点出现频率为21.90%,分布密度为1/3.6kb;在所有重复单元中,二碱基微卫星占主要优势,占SSR位点总数的61.3%.利用Primer 3.0设计引物,共计3 303条Unigene成功设计出引物.随机选择10对SSR引物,对一个崇左金花茶群体进行扩增多态性分析,8对引物能够扩增出符合预期大小的PCR片段,其中4对引物成功检测出多态.以上结果表明,转录组数据能够提供丰富的SSR位点,用于快速高效地开发SSR引物,所开发的引物可为崇左金花茶遗传多样性的研究以及种质资源的鉴定与保护等方面提供分子基础.     

基于转录组的曼氏无针乌贼SSR与SNP位点信息分析

利用IlluminaHiseq平台对曼氏无针乌贼进行了转录组测序,采用生物信息学方法分析了转录组序列中的SSR、SNP位点信息并设计了SSR引物。利用MISA工具筛选了转录组测序获得的127 575条Unigene序列,共得到分布于50 626条序列中的SSR位点108 685个,SSR发生率39.68%,出现频率为85.19%。平均每949 bp含有1个SSR位点。在50626条含有SSR位点的Unigene序列中,有25 548条Unigene包含SSR位点数目在2个及以上。其中单碱基重复是EST微卫星序列的主要形式(42.84%),其次是二碱基重复(28.73%),三碱基重复(14.93%)和四碱基重复(12.79%)。在所有微卫星序列所包含的重复单元中,优势重复基元类型为A/T(占总SSRs的42.23%),其次为AT/AT (13.33%),AC/GT (9.32%),AAAG/CTTT(10.00%)。运用Primer premier 5软件共设计了46 520对SSR引物。在12 323条Unigene中发掘出SNP位点64 732个,每条Unigene平均含5.25个SNP位点。其中转换(Transition) 45 975个(71.02%),颠换(Transversion) 18 757个(28.98%)。本研究通过第二代高通量测序技术,结合生物信息学方法对曼氏无针乌贼进行了SSR位点与SNP位点的开发,为其遗传多样性分析、分子辅助育种和增殖放流效果评估等提供了有力研究工具。     

舟山附近海域3个大黄鱼养殖群体遗传多样性的微卫星分析

利用8个微卫星多态标记分析舟山附近海域3个大黄鱼养殖群体共90个体的遗传多样性。结果显示,8个微卫星位点共检测到等位基因64个,各位点等位基因数(A)范围为5~10个,观测杂合度(Ho)的平均值为0.9111,期望杂合度(He)的平均值为0.8108,多态信息含量(PIC)平均值为0.7800,表明所选择的8个微卫星位点均表现出较高的多态性。群体的遗传多样性分析结果显示,3个群体的平均观测杂合度和平均期望杂合度分别为0.891 7、0.900 0、0.941 7和0.738 4、0.743 2、0.821 3,Shannon多样性指数分别为1.467 0、1.449 0、1.800 9,表明3个群体的遗传多样性处于较高水平。HardyWeinberg平衡检验发现只有LYC0015和LYC0009位点处于平衡状态(PHW0.05),其余6个位点都不同程度地偏离了平衡。3个群体的聚类分析表明,岱山和朱家尖西岙网箱2个养殖群体亲缘关系较近,而与舟山市水产所耐低温F2代群体亲缘关系较远。     

朱顶红转录组SSR标记的开发与遗传多样性研究

为开发朱顶红SSR标记并用于种质资源遗传特征分析,本研究从漳红2号朱顶红转录组共48 355条unigenes中搜索得到11 055个SSR位点,出现频率为25. 13%. SSR类型以一、二、三核苷酸重复为主,占总SSR比例的92. 80%,其中三核苷重复为主要基序类型,占总SSR的43. 73%.设计合成的50对SSR引物中有7对引物在51份朱顶红种质中得到有效性验证,表现扩增条带清晰、多态性好.基于SSR标记进行51份朱顶红种质的遗传多样性分析表明,在遗传相似系为0. 166时可将其分为6个类,来源于相同地域或亲缘种质大多成簇分布.研究结果表明,漳红2号朱顶红转录组测序产生的unigenes信息可作为开发SSR标记的有效来源,获得的大批量SSR标记可为朱顶红及其近缘种的遗传多样性分析和遗传图谱构建提供更加丰富可靠的标记选择.     

大分舌蜂EST-SSR微卫星分子标记开发与特征分析

【目的】构建中国油茶（Camellia oleifera）主要传粉昆虫之一的大分舌蜂(Colleles gigas)cDNA文库并利用全国几个典型样本筛选微卫星DNA(Simple sequence repeat，SSR)位点，为该蜂种群遗传多样性和遗传分化研究提供可靠的分子标记。【方法】使用10头大分舌蜂雌性幼虫构建cDNA文库，用Illumina Hiseq TM 2500高通量测序平台测定cDNA文库数据，通过SSR筛选软件MISA进行检索发掘SSR标记；利用Primer Premier 5.0软件设计引物，利用荧光标记技术进行分型。【结果】从cDNA文库序列中筛选得到16 457个SSR，其中15 563个(占比为94.57%)是完整型SSR，872个(占比为530%)是不完整型SSR，22个(占比为0.13%)是复合型SSR；完整型SSR中单碱基SSR最为丰富，共10 910个，占总SSR数量的70.11%，其余依次是二碱基SSR (2 099个，占比为13.49%)、三碱基SSR(2 408个，占比为15.47%)、四碱基SSR(136个，占比为0.87%)和五碱基SSR (10个，占比为0.06%)。对80对EST-SSR引物在6个不同地理种群32头大分舌蜂中进行验证，共有6对EST-SSR引物较好地扩增出目的片段，共获得192个等位基因，平均等位基因数为11.833 332个，平均有效等位基因数为4.149 8个，香农信息指数范围为1.362 6～2.119 2，平均观测杂合度为1.000，平均期望杂合度为0.800，多态信息含量范围为0.710～0.879，且平均值为0.761。【结论】研究所开发的6对大分舌蜂EST-SSR引物对应的产物多态性较高，遗传多样性也较高，可以应用于该蜂种的遗传多样性、遗传分化、种质资源保护等领域的后续研究。     

藏羚羊(AAC)_n微卫星富集文库构建与引物筛选

基于磁珠富集法,利用生物素标记的寡核苷酸探针(AAC)8从藏羚羊(Tibetan antelope)基因组酶切的300~1000bp片段中筛选微卫星位点,纯化的富集片段连接到pCR@2.1载体和转化到Trans5α感受态细胞.随机挑取180个白斑克隆,PCR检测到条带数大于或等于2的阳性克隆为56个,阳性率为31.1%.对阳性克隆测序,获得43条含微卫星座位的序列,微卫星重复次数在5~20次之间.舍弃不适宜设计引物的微卫星座位,试验设计并合成了20对微卫星引物;以3个样点(青海、新疆、西藏)的24个藏羚羊基因组为模板进行PCR扩增,获得8对可得到稳定扩增产物的微卫星引物,其中4对引物的扩增产物具有多态性,座位分别为AAC050、AAC056、AAC165和AAC477.上述引物可用于藏羚羊及近缘物种的遗传多样性、种群遗传结构等研究.     

基于NCBI核酸数据库资源的产黄青霉微卫星序列的筛选

利用生物信息学方法在产黄青霉基因组中筛选微卫星序列,并对其基因组中微卫星数量和丰度进行了研究.利用SSRHunter1.3软件在长度为30 090 464 bp的产黄青霉基因组中共找到163个微卫星序列.其中以两碱基重复类型数目最多,为133个,占重复序列总数目的 81.60%;其次是三碱基重复为29个,占17.79%;最后是四碱基1个,占0.61%.在两碱基重复序列中,AT(44.79%)重复类别最多,其次是AG(23.92%).在三碱基重复序列中,共发现9种重复类别,其中以AAG和ACT重复类型最多,为6个(3.68%),其次是ACC(2.45%),最少的是AGC(0.61%).四碱基重复中,只有1种重复类别,为ATGT(0.61%).同时选取二碱基的重复次数在7以上和三碱基的重复次数在6以上的微卫星序列,利用Primer Premier 5.0软件设计了引物,共得到30对引物.本研究不仅为后续产黄青霉微卫星标记的筛选奠定了基础,也丰富了其基因组学资源,对产黄青霉的种群遗传结构分析、分子标记选育和遗传多样性有重要意义.     

春小麦重组自交系及多种SSR标记构建遗传图谱

 以春小麦重组自交系(RIL)宁春4 号×宁春27 号为作图群体,利用SSR 标记构建小麦遗传连锁图谱。结果表明,用1001对SSR 引物选出亲本间表现多态性的引物307 对,多态性频率为30.7%。利用307 对多态性引物对RIL 群体进行分析,共检测到266 个多态性标记位点。通过χ²检测(P<0.05),有147 个SSR 标记表现为偏分离,偏分离率为55.3%,129 个偏向母本宁春4号,其偏分离位点主要分布在B 和D 基因组上。用Mapmaker 3.0 和Mapdraw 2.1 软件将266 个SSR 位点绘制在小麦遗传连锁图上,该图谱覆盖小麦基因组全长2187.79 cM,标记间的平均遗传距离为8.22 cM。     

封闭群比格犬微卫星的筛选及初步应用

摘要:目的 筛选可用于比格犬遗传检测的微卫星位点,并对小型比格犬群体进行了遗传结构分析。 方法 选取来自文献的微卫星位点 120 个,包括比格犬位点 23 个和其他犬类遗传检测的位点 97 个。 用 DNA 池对这些位点进行 PCR 条件优化后,挑选扩增效果优良的位点对常用比格犬群体进行荧光标记 STR 扫描和群体遗传结构分析,依据期望杂合度( He)和香农指数挑选符合要求微卫星位点计算群体遗传参数。 结果 在候选的 120 个位点中共有73 个位点扩增效果优良,STR 扫描后选用 49 个位点进行遗传分析,结果显示该群体有效等位基因数、期望杂合度、平均杂合度、香农指数、多态性信息含量分别为 4. 9230、0. 7574、0. 7375、1. 6625、0. 7038,证明该群体遗传多态信息丰富,群体遗传多样性高。 结论 所选 49 个微卫星位点可用于比格犬遗传检测,这些位点还需用更多群体进行验证和优化。     

基于5’锚定PCR法和磁珠富集法的西藏沙棘多态性SSR引物开发

简单序列重复(SSR)是共显性遗传标记,可有效地反映个体遗传信息和亲缘关系,在杂交检测、物种鉴定及种群遗传学研究等方面应用广泛.作为重要的经济植物,西藏沙棘是青藏高原植物生态适应与进化研究的极佳材料,但目前还缺乏对其种质资源和遗传结构的了解.利用5’锚定PCR方法和磁珠富集法开发西藏沙棘的SSR引物.共得到13个种内多态性的SSR位点,分别有2~4个等位基因,观测杂合度(HO)从0.00到0.74不等,预期杂合度(HE)从0.04到0.54不等.两种方法所得到的引物可用于西藏沙棘的种质资源鉴定、遗传结构研究等多个方面.     

应用微卫星标记对海南和广西恒河猴遗传多样性的研究

目的研究微卫星DNA多态性在海南和广西恒河猴遗传多样性中的应用。方法利用11个微卫星位点,对来自这两个地区的恒河猴进行了遗传检测,并通过POPGEN32软件计算各个微卫星座位的等位基因频率、有效等位基因数目(Ne)、多态信息含量(PIC)和遗传杂合度(H)。结果所选择的11个微卫星位点均存在高度的遗传多态性,H为0.6848~0.8785;PIC为0.5826~0.8345;Ne为3.0000~7.1553。以11个微卫星标记为测度,广西恒河猴的Ne、PIC和H的平均值均高于海南猴,分别为4.2583、0.7090、0.7706(广西恒河猴)和4.2054、0.7025、0.7656(海南恒河猴)。结论这种差别可能与地域来源有关。这些研究为微卫星标记分析恒河猴遗传多样性提供理论基础。     

SSR分子标记在作物遗传多样性研究中的应用现状

微卫星(microsatellites)或简单序列重复(simple sequence repeats,SSRs)是以1-6个碱基为基本单元的串联重复序列,具有含量丰富、多态性高、共显性和检测方法简单等优点,是研究植物遗传多样性的主要的分子标记方法之一,已被用于多种农作物的遗传多样性研究。概述了微卫星DNA标记的原理及特点,探讨了其在农作物物遗传多样性研究中的应用和发展前景。     

基于Illumina测序技术的枸杞微卫星引物的开发

目的:分离和鉴定红、黑枸杞基因组中的简单重复序列(SSR)位点.方法:Illumina Hiseq 2000进行红、黑枸杞的高通量转录组测序后,生物信息分析SSR的分布频率和重复基元的类型特征,PCR扩增和聚丙烯酰胺电泳验证SSR位点及引物.结果表明:转录组测序共得到了192,869条reads,总长度205,220,696bp.拼接后序列的数量为35,572条,序列平均长度约为1064bp.从中共预测到44,828个SSR位点,其中单、二、三、四、五、六个碱基重复单元的微卫星位点数分别有25,800、9186、8479、363、464和536个.从中随机选择30个位点,设计引物进行验证.23对引物在红黑枸杞中能扩增出产物,其中5对仅一个材料中有扩增产物,另有5个位点扩增产物能明显区分红黑枸杞.结论:利用Illumina测序技术得到的枸杞转录组中SSR位点出现频率高,类型丰富,对今后枸杞遗传多样性的研究以及种质资源鉴定打下了良好的理论基础.     

湿地松转录组SSR分析及EST-SSR标记开发

【目的】湿地松是南方地区优先推广的优质产脂树种。但湿地松分子遗传基础薄弱,基因组序列信息匮乏,影响了湿地松基因组学的深入研究。目前,湿地松分子研究所用的SSR标记主要来自其他近缘种或利用公共数据库中有限的基因序列资源开发的SSR标记,其多态性和通用性较差。为解决这一问题, 笔者根据湿地松转录组测序数据开发EST-SSR位点,并揭示其在转录组序列中的分布类型及特征,为湿地松分子标记辅助育种奠定基础。【方法】利用MISA软件对转录组序列进行SSRs查找和分布特征分析。查找标准参数设置为: 单核苷酸重复>10次,二核苷酸重复>6次,三、四、五、六核苷酸重复>5次。根据SSR位点两端的保守区域,利用Primer3.0设计并随机挑选120对SSR引物,通过琼脂糖电泳和毛细管电泳对来自美国和吉安的113份家系个体进行遗传多样性分析,确定引物多态性。【结果】79 574条unigenes序列中搜索到3 818个SSR位点,出现频率为4.80%,平均18.27 kb出现1个SSR位点,3 373个unigenes含有SSR位点,SSR发生频率(含SSR位点的序列数/搜索序列总数)为4.24%,其中2 980条序列含1个SSR位点,含1个以上SSR位点的序列有393条。在检测到的3 818个SSR标记中,单核苷酸分布最多,其次是二核苷酸和三核苷酸,SSR数量分别占总数的63.54%、19.15%和16.27%,而四、五、六核苷酸重复类型所占比例较小,分别为0.52%、0.13%和0.31%。SSR重复单元的重复次数分布在5~22次之间,除单核苷酸重复外的1 391个SSR中,重复5次的数量最多,为498个(35.80%);重复6次和7次的次之,分别为417个(29.98%)和198个(14.23%);重复10次以上的仅有38个(2.73%)。在检测到的731个二核苷酸重复SSR中,最常出现的重复单元为AT/AT,数量为491个(12.86%),AG/CT和AC/GT两种类型的重复单元出现的次数次之,分别为156(4.09%)和81个(2.12%)。在检测到的621个三核苷酸重复中,AAT/ATT是出现频率最高的单元,共139个(3.64%),其次是AAG/CTT,共122个(3.20%)。3 818个SSR中有24.59%的位置未知,其余的SSR则分布在非编码区域(untranslated region,UTR)或者编码区(coding sequence,CDS)上,分布数量表现为3'UTR>5'UTR>CDS。参试的120对SSR引物,有92对扩增成功(76.78%),其中24对呈现多态(20%)。24对引物(13个二核苷酸重复、7个三核苷酸重复和4个四核苷酸重复)共检测出81个等位基因,每个位点的等位基因数为2~9,平均为3.38个。多态性信息含量(polymorphism information content,PIC)为0.103~0.726,平均为0.349。【结论】通过对湿地松转录组数据的挖掘,共获得 3 818个SSR位点,主要重复单元为AT/AT和AAT/ATT,可扩增出多态性位点的引物重复单元以二、三核苷酸重复为主。基于湿地松转录组序列的SSR标记开发是可行的。     

检疫性杂草假高梁及其近似种SSR分子标记的遗传多样性

利用SSR标记对8个假高粱及其近似种样品的遗传多样性进行研究,结果发现：（1）在11对SSR引物中,有5对扩增出多态性,这5对引物共检测到25个多态性位点,每对引物平均能检测到5个多态性位点;（2）根据Nei’s遗传距离分析的聚类树显示：这8个高粱属物种共可分为2个类群,7个亚类群;假高粱和黑高粱、拟高粱和明福1号间的亲缘关系极近;（3）SSR结果揭示出所测8个群体的Gst为0．0864,说明本文研究的Sorghum属8个物种的群体遗传分化程度属于中度。