表达HBHA和hIL-12融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌对结核分枝杆菌感染小鼠的免疫治疗作用

评价表达HBHA和hIL12融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌用于结核分枝杆菌感染小鼠的免疫治疗效果.结核分枝杆菌H37Rv感染小鼠4周后,用表达HBHA和hIL12融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌免疫治疗,检测免疫小鼠肺部荷菌量和组织病理变化.重组耻垢分枝杆菌可有效控制感染小鼠肺部结核分枝杆菌的荷菌量,减轻病理损伤.但在降低肺部荷菌量方面不如化疗药物.表达HBHA和hIL12融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌可有效控制结核分枝杆菌在小鼠体内的增殖,可能成为联合化疗药物控制结核病的有效候选疫苗.     

弓形虫pcDNA3-ROP1 DNA疫苗免疫小鼠诱导体液免疫应答及保护性的初步观察

目的 观察弓形虫pcDNA3-ROP1 DNA疫苗免疫BALB/C小鼠诱导其体内产生的体液免疫应答及抗虫感染的免疫保护作用.方法 重组质粒用生理盐水稀释后,肌注免疫BALB/C小鼠.分别于免疫后5周和10周用ELISA法测定IgG抗体滴度;免疫鼠腹腔注射弓形虫速殖子攻击感染.结果 经两次检测,均可测到特异性IgG抗体,且抗体的滴度随免疫时间的延长而增高;弓形虫速殖子腹腔攻击感染免疫组小鼠的平均存活时间较对照组延长,统计学有显著性差异(P<0.01).结论 弓形虫pcDNA3-ROP1质粒 DNA疫苗能诱导BALB/C小鼠产生特异性体液免疫应答及部分抗虫免疫保护作用.     

结核杆菌ESAT-6基因疫苗对结核杆菌感染小鼠的免疫保护效果研究

为研究结核杆菌ESAT-6基因疫苗的免疫原性及对小鼠结核杆菌感染的免疫保护效果,将雌性C57BL／6N小鼠32只,随机分为4组,即结核杆菌ESAT-6基因疫苗组、BCG组、pcDNA3．1（＋）组和PBS组。取小鼠脾细胞培养上清检测细胞因子水平;并按效靶比例分别为100：1、50：1、10：1进行CIL杀伤活性检测。用结核杆菌H37Rv国际标准强毒株静脉注射攻击小鼠,计数肺和脾组织中的结核杆菌菌落数,对小鼠部分肺和脾组织作病理切片,HE染色观察组织病变程度,Z—N染色检查抗酸杆菌,观察陔疫苗对小鼠结核杆菌感染的免疫保护效果。结果表明,结核杆菌ESAT-6基因疫苗对小鼠结核杆菌感染有一定的免疫保护效果,可诱导较强的抗原特异性Th1型细胞免疫应答,细胞因子IFN-γ和IL-1分泌增加,IL-4分泌减少,CTL特异件活性增加;使小鼠肺和脾组织中的结核杆菌菌落数较空载体组显著减少,组织病变明显减轻。     

分枝杆菌重组疫苗rBCG-Sj26GST对小鼠的保护作用

为了研究分枝杆菌重组疫苗rBCG-Sj26GST对小鼠的保护作用,用分枝杆菌重组疫苗rBCG-Sj26GST免疫雄性BALB/c,结核杆菌H37Ra进行攻击,检测小鼠淋巴细胞刺激指数(SI),腹腔巨噬细胞培养上清释放NO量,小鼠血清IFN-γ、IL-2的含量,并计数小鼠肝、肺活细菌数.rBCG-Sj26GST疫苗免疫的小鼠,其脾淋巴细胞刺激指数(SI)为4.12±1.11,与对照组(2.63±0.47)、载体组(1.06±0.08)和BCG组(1.50± 0.41)相比,差异具有显著意义(P＜0.05);rBCG-Sj26GST组巨噬细胞释放的NO量明显高于对照组(P＜ 0.05).小鼠血清IFN-γ的浓度较对照组高33?%,但差异无显著意义(P＞0.05);与载体组相比,差异具有显著意义(P＜0.05).血清白介素-2的浓度较对照组高43?%,较载体组高38?%,但差异无显著意义(P＞ 0.05).经rBCG-Sj26GST免疫的小鼠受结核杆菌攻击后其肺、肝脏结核菌数较对照组少.分枝杆菌重组疫苗rBCG-Sj26GST免疫小鼠后能提高小鼠淋巴细胞刺激指数,刺激IFN-γ、IL-2的分泌,说明此疫苗能诱导CD+4Th1和CD+8CTL的细胞免疫反应,增强小鼠细胞免疫功能,并使小鼠能抵抗结核杆菌的攻击.     

弓形虫SAG1,ROP1基因及其复合抗原基因的核酸免疫研究

目的 检测混合SAG1和ROP1编码基因真核表达质粒疫苗诱导小鼠的免疫应答,评价其抗弓形虫感染的保护性免疫效果.方法 将SAG1和编码基因片段克隆入pEGFP-N3表达载体,构建重组质粒;RT-PCR体外验证重组质粒在NH3T3细胞中的表达;通过检测抗体、抗体分型及细胞因子来评价体液免疫和细胞免疫;腹腔内注射毒性株弓形虫速殖子攻击免疫小鼠.结果 RT-PCR结果显示重组质粒能在哺乳动物细胞内表达;SAG1和ROP1混合重组质粒疫苗诱导小鼠产生很强的体液免疫和细胞免疫,对于毒性株弓形虫感染攻击具有保护作用.结论 不同候选抗原编码基因重组质粒能够诱导小鼠产生抗弓形虫感染保护性免疫,提示含有多种成分的混合DNA疫苗的研制可作为核酸免疫研究的策略之一.     

表达HCV核心蛋白的重组减毒鼠伤寒沙门菌口服免疫小鼠的研究

构建了丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白原核表达质粒pQE-HCV,转化到减毒鼠伤寒沙门菌SL7207中,SDS-PAGE和Western blot检测到该重组菌能表达3种分子量的HCV核心蛋白.以该重组菌作为口服型活疫苗灌胃接种BALB/c小鼠,检测到小鼠产生的抗HCV核心蛋白IgG及迟发型超敏反应、T细胞增殖反应和细胞毒性T淋巴细胞反应.结果表明该重组菌能有效诱导免疫应答,尤其能高效诱导细胞免疫应答,这为研制高效免疫、成本低廉、接种方便的HCV疫苗提供了一个新的可行途径.     

HCV多表位抗原基因pcxz的三串联表达及其在小鼠体内免疫原性的研究

在本实验室之前合成的多表位抗原基因pcxz的基础上,将之3次串联重复构建了3pcxz,以重组表达的3PCXZ作为抗原,HCV病人血清为检测抗体,作Western blot杂交,结果表明3PCXZ抗原能被HCV阳性血清特异识别,而同正常人的血清无反应.通过对BALB/c小鼠的免疫应答进行检测,发现合成的多表位抗原3PCXZ诱导BALB/c小鼠产生的IgG抗体滴度为5.8×105;IgG亚型分析发现,这一免疫反应主要是基于TH2方式,在细胞免疫应答方面亦能激活特异的CD4+T辅助细胞CTL效应,最高溶解率达到40.54%,在1×106脾淋巴细胞中最多可以产生(698±229)个分泌INF-γ的CD4+T细胞.     

细粒棘球蚴重组蛋白14-3-3和Eg10免疫差异的初步研究

表达纯化细粒棘球蚴重组蛋白14-3-3(rEg14-3-3)和Eg10(rEg10),分别免疫小鼠,8w后进行细粒棘球蚴原头蚴攻击感染.计算免疫保护力,检测脾组织中CD4+T、CD8+T细胞亚群以及T细胞增殖情况.实验结果表明,rEg14-3-3免疫组小鼠具有85.3%抵抗细粒棘球绦虫感染的能力,而rEg10免疫组小鼠与对照组小鼠相比无免疫保护力;与PBS对照组相比,只有rEg 14-3-3免疫组的CD4+T细胞亚群的分布有明显差异,且rEg 14-3-3抗原能诱导淋巴细胞显著增殖.因此rEgl4-3-3蛋白能抑制细粒棘球蚴的生长,诱导小鼠产生高水平的免疫保护力,可作为疫苗候选分子.     

表达结核分枝杆菌休眠相关抗原Rv2031c-Rv2626c融合蛋白

利用大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭表达载体pDE22,构建能够表达结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, MTB）休眠相关抗原Rv2031c-Rv2626c融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis, M.s）。采用聚合酶链反应（PCR）方法,从MTB H37Rv基因组DNA中扩增MTB休眠相关抗原Rv2031c和Rv2626c基因片段并克隆入pMD18-T载体,序列测定正确后分别亚克隆入大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭表达载体pDE22,将重组载体pDE22-Rv2031c-Rv2626c电穿孔导入M.s,42℃热诱导表达目的蛋白,并进行SDS-PAGE和Western-blot分析。利用PCR方法扩增获得MTB休眠相关抗原Rv2031c和Rv2626c基因片段,大小分别为435bp和480bp,基因测序与Genebank公布的基因序列完全一致。SDS-PAGE分析结果表明重组载体pDE22-Rv2031c-Rv2626c电穿导入M.s后能够特异性表达目的蛋白,大小约为35kDa,与理论值相符。Western-blot鉴定结果表明抗Rv2031c和抗Rv2626c的单克隆抗体均能够与目的蛋白发生特异性的反应,大小相一致。成功构建表达MTB休眠相关抗原Rv2031c-Rv2626c融合蛋白的重组M.s,并命名为Rv2031c-Rv2626c-rM.s,为其用于结核新型疫苗的研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌膜蛋白Rv0849免疫学特性的初步检测

探讨了结核分枝杆菌膜蛋白Rv0849作为药泵蛋白的转运功能及其作为外源蛋白免疫诱导C57BL/6小鼠产生免疫应答的能力.从H37Rv基因组中扩增获得Rv0849基因,酶切后连接到分枝杆菌穿梭质粒pMV261上构建重组质粒pMV0849,并以耻垢分枝杆菌为载体构建获得重组菌株SM(0849).检测药物对重组菌株SM(0849)的最小抑菌浓度(MIC)变化,用重组菌株免疫C57BL/6小鼠检测其作为外源蛋白免疫诱导小鼠产生的免疫应答反应.结果表明,重组菌株SM(0849)对药物的耐受性没有明显提高,但能够较早、较好地诱导小鼠体液免疫应答水平,并能通过刺激小鼠脾脏淋巴细胞促使其分泌高水平的肿瘤坏死因子-α和干扰素-γ.Rv0849所编码的蛋白具有较弱的药泵功能,但有潜力成为一种新的免疫抗原.     

乙肝病毒核酸疫苗诱导小鼠细胞免疫应答的研究

研究利用核酸疫苗诱生乙型肝炎病毒 (HBV)表面抗原 (S)细胞免疫应答的作用 .免疫前于BALB/C小鼠股四头肌注射 75 %盐酸布比卡因 ,三天后同样部位注射包含HBsAg基因片段的重组质粒pcDNAHBs .采用3H -TdR掺入法测定免疫小鼠脾细胞增殖能力 ;XTT法测定其脾细胞分泌IL 2活性 .结果表明注射乙肝核酸疫苗可以使小鼠脾细胞增殖 ,小鼠脾细胞分泌上清中可检测到IL - 2活性     

Specific anti-tumor effect induced by attenuated Salmonella typhimurium vaccine expressing extracellular region of vascular endothelial growth factor receptor 2

The purposes of this research were to study the stable expression of exogenous gene encoding therapeutic protein in attenuated Salmonella typhimurium, observe the metabolism of oral gene vaccine carried by attenuated Salmonella typhimurium in BALB/c mouse, and investigate the feasibility of prevention and treatment of tumors by the recombinant bacteria. Recombinant plasmid pcDNA3.1 VEGFR2(n1-7) was transformed into competent attenuated Salmonella typhimurium SL3261 to develop oral DNA vaccine SL3261-pcDNA3.1 VEGFR2(n1-7). To observe whether the exogenous gene can be expressed in the recombinant bacteria, PCR was performed to amplify the CMV promoter of the eukaryotic expression vector as the proof of stable expression of exogenous protein; transmission elec- tron microscopy (TEM) was applied to observe the morphology of the recombinant bacteria to confirm that the exogenous gene has no impact on the growth of the bacteria, and then BALB/c mice were immunized with the gene vaccine. After inoculation of the gene vaccine, the recombinant bacteria SL3261 could be detected in the tissues such as small intestine, colon, liver and spleen. And then, mice in each group were challenged with tumor cells. The results of animal experiment showed that tumor growth of the mice in experimental group was inhibited and survival time of immunized mice was prolonged compared with control groups. A higher lymphocyte infiltration in tumors from animals treated with DNA vaccine was observed. Immunohistochemical analysis of tumor samples revealed an en- hanced accumulation of CD8 cytotoxic T lymphocytes, as well as an increase in CD4 cells in the tumors of animals treated with the oral gene vaccine compared to tumors from control group mice. Ultrastructure of the tumor tissue showed that tumor cells in the samples of the immunized mice were well-differentiated. Our research confirmed that the exogenous gene can be stably expressed in the attenuated Salmonella typhimurium and has no impact on the growth of the recombinant bacteria; the exogenous gene can de delivered to the host by attenuated Salmonella typhimurium to produce anti-tumor effect with no obvious cytotoxity to the host. In this study, it is established that attenuated Salmonella typhimurium could be used as a vector for oral gene vaccine, and our study provided a theoretical basis for the body distribution and the metabolism of the recombinant bacteria. This strategy may provide a simple, safe and effective way for the prevention and treatment of tumors.     

gD2 DNA疫苗诱导细胞免疫应答

用生殖器疱疹gD2 DNA疫苗pcDNA3-gD转染哺乳动物细胞COS-7,鉴定gD表达．再用其免疫BALB／c小鼠,测定脾细胞增殖、CTL细胞杀伤活性,以及CD4^ 和CD8^ 细胞群．结果表明：pcDNA3-gD能够在哺乳动物细胞COS-7中表达gD抗原,其免疫小鼠脾细胞增殖活性增加,CTL活性达37．69％,明显高于pcDNA3组和生理盐水组;CD4^ 占T细胞数量的33．38％,数量较pcDNA3组和生理盐水组显著增加．     

噬菌体展示的白色念珠菌热休克蛋白90特异表位在小鼠体内诱发的免疫应答

将展示白色念珠菌热休克蛋白(HSP)90特异表位的杂合噬菌体作为抗原免疫C57BL/6J小鼠,以检测该抗原在小鼠体内诱发的体液免疫和细胞免疫.实验结果表明:抗原PA刺激机体产生了较强的抗白色念珠菌HSP90特异性抗体;脾CD4 T和CD8 T淋巴细胞出现率明显增高;脾细胞分泌IL-2的能力有增高趋势.此外,将免疫后的小鼠通过尾静脉进行系统性白色念珠菌感染,采用组织病理学方法观察了抗原对小鼠肾脏白色念珠菌寄居数量的影响,实验结果表明,抗原对系统性白色念珠菌感染具有明显的保护作用.     

Specific anti-tumor effect induced by attenuated <Emphasis Type="Italic">Salmonella typhimurium</Emphasis> vaccine expressing extracellular region of vascular endothelial growth factor receptor 2

The purposes of this research were to study the stable expression of exogenous gene encoding therapeutic protein in attenuated Salmonella typhimurium, observe the metabolism of oral gene vaccine carried by attenuated Salmonella typhimurium in BALB/c mouse, and investigate the feasibility of prevention and treatment of tumors by the recombinant bacteria. Recombinant plasmid pcDNA3.1＋ VEGFR2（n1-7） was transformed into competent attenuated Salmonella typhimuriurn SL3261 to develop oral DNA vaccine SL3261-pcDNA3.1＋VEGFR2（n1-7）. To observe whether the exogenous gene can be expressed in the recombinant bacteria, PCR was performed to amplify the CMV promoter of the eukaryotic expression vector as the proof of stable expression of exogenous protein; transmission elec- tron microscopy （TEM） was applied to observe the morphology of the recombinant bacteria to confirm that the exogenous gene has no impact on the growth of the bacteria, and then BALB/c mice were immunized with the gene vaccine. After inoculation of the gene vaccine, the recombinant bacteria SL3261 could be detected in the tissues such as small intestine, colon, liver and spleen. And then, mice in each group were challenged with tumor cells. The results of animal experiment showed that tumor growth of the mice in experimental group was inhibited and survival time of immunized mice was prolonged compared with control groups. A higher lymphocyte infiltration in tumors from animals treated with DNA vaccine was observed. Immunohistochemical analysis of tumor samples revealed an enhanced accumulation of CD8^＋ cytotoxic T lymphocytes, as well as an increase in CD4^＋ cells in the tumore of animals treated with the oral gene vaccine compared to tumors from control group mice. UI- trestructure of the tumor tissue showed that tumor cells in the samples of the immunized mice were well-differentiated. Our research confirmed that the exogenous gene can be stably expressed in the attenuated Salmonella typhimurium and has no impact on the growth of the r     

结核分枝杆菌Hsp16．3对感染巨噬细胞凋亡的影响

为研究结核分枝杆菌Hsp16．3对感染巨噬细胞凋亡的影响。分别用结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv株（H37Rv）、结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv株Hsp16．3基因缺失突变株（△H37Rv）、卡介苗（BCG）和卡介苗Hsp16．3基因缺失突变株（△BCG）感染RAW264．7巨噬细胞株,使用流式细胞技术于感染1、3、6及12h检测各组感染巨噬细胞的凋亡率,并分析其变化。结果显示,巨噬细胞感染结核分枝杆菌后凋亡率升高,其中在感染1、3、12h,BCG组与H37Rv组比较差异具有统计学意义（P〈O．05）;在感染1、3h,△BCG组与AH37Rv组比较差异具有统计学意义（P〈0．05）;在感染3、6、12h,△H37Rv组与H37Rv组比较差异具有统计学意义（P〈0．05）,△BCG组与BCG组比较差异具有统计学意义（P〈0．05）。由此可知,结核分枝杆菌Hspl6．3可抑制感染巨噬细胞的凋亡。     

HIV-1C亚型DNA疫苗诱导小鼠免疫反应的研究

 构建含中国流行株HIV-1 C亚型核心蛋白gag基因的重组质粒pVAX-gag,并在体外进行了表达与鉴定.同时构建了含此gag基因的原核表达质粒pGEX-gag,表达纯化并鉴定重组蛋白Gag.以质粒pVAX-gag免疫Balb/C小鼠后,用ELISpot和流式细胞仪检测其细胞免疫反应.再以纯化后的重组蛋白Gag作为包被抗原,用ELISA检测其体液免疫反应.结果显示重组质粒pVAX-gag免疫小鼠后可有效地诱导机体产生细胞免疫和体液免疫反应,且免疫剂量和免疫效果存在一定的正相关性.重组原核表达质粒pGEX-gag的表达产物能与抗p24单克隆抗体发生特异性反应,可用于抗HIV抗体检测.     

熊果酸对H22荷瘤小鼠抗肿瘤及免疫调节作用

目的 探讨熊果酸（UA）对H22荷瘤小鼠抗肿瘤作用及免疫功能的影响.方法 皮下移植建立H22荷瘤小鼠模型,腹腔注射不同剂量UA,检测抑瘤率和免疫器官指数,MTT法检测脾脏T、B淋巴细胞增殖能力,流式细胞术检测CD4＋、CD8＋T细胞亚群含量及比例,ELISA法检测血清细胞因子IL-2、IL-4和TNF-α的表达量.结果 UA对小鼠皮下移植性肿瘤H22有显著的抑制作用,可降低免疫器官中异常增大的脾指数,增强脾脏中T、B淋巴细胞增殖能力,提高淋巴细胞亚群CD4＋T细胞表达及CD4＋/CD8＋T细胞亚群比例,促进血清IL-2、TNF-α表达,降低IL-4表达.结论 UA可抑制小鼠肝癌H22肿瘤生长,体内可以提高荷瘤小鼠的免疫能力,其抗肿瘤作用可能与机体的免疫调节作用相关.     

季节性流感病毒裂解疫苗在小鼠中的 安全性和免疫原性研究

目的 评价季节性流感病毒裂解疫苗在动物体内的安全性和免疫原性。 方法 按《 中国药典》 三部( 2015 版)方法进行 BALB / c 小鼠异常毒性试验。 免疫原性试验将 BALB / c 小鼠随机分为 2 组,试验组每只小鼠肌肉注射 0. 1 mL 测试疫苗,空白对照组注射 0. 1 mL PBS。 接种后连续观察 49 d,每天记录动物的活动、饮食及体质量情况。 分别于接种后 0、14、28、35 和 49 d,采血并分离血清,红细胞凝集抑制试验( hemagglutination inhibition,HI)检测血清 抗体水平。 结果 异常毒性试验结果提示该疫苗的安全性良好,对小鼠的生长无影响,符合《中国药典》 三部( 2015 版)判定标准。 免疫原性试验结果显示,BALB / c 小鼠免疫后 28 d,血清抗 A( H1N1) pam09 和 A( H3N2) HI 抗体阳 转率均达到了 100% ;免疫后 35 d,抗 B( Victoria 系) 的抗体阳转率达到 70% 。 BALB / c 小鼠抗 A( H1N1) pam09、A ( H3N2)和 B( Victoria 系)抗体水平均达到峰值。 结果表明,该季节性流感病毒裂解疫苗对小鼠进行一次性免疫, 即能达到良好的免疫效果。 结论 该流感病毒裂解疫苗在 BALB / c 小鼠中具有良好的安全性和免疫原性。