应用噬菌体随机肽库研究抗溶藻弧菌及其外膜蛋白单抗识别的特异性表位

用噬菌体随机七肽库筛选制备的抗溶藻弧菌及其外膜蛋白的纯化单抗，经3轮淘洗，获得较高程度富集的噬菌体，效价较高，第3轮淘洗比第1轮淘洗的产量高出近百倍。同时获得的阳性噬菌体经ELISA检测能与Va抗原发生强的阳性反应，确证了淘洗筛选的结果。     

溶藻弧菌TssJ基因的原核表达及多克隆抗体制备

Tss J是溶藻弧菌Ⅵ型分泌系统(T6SS)的一个重要基因.为了制备Tss J基因的多克隆抗体,以溶藻弧菌HN08155菌株的DNA为模板,扩增Tss J基因后利用表达载体PET-32a(+)和大肠杆菌BL21(DE3)原核表达,分离纯化后免疫大鼠获得Tss J基因的多克隆抗体.结果显示,37℃、IPTG终浓度1 mmol·L~(-1)是较适宜的表达诱导条件,表达的融合蛋白是存在于细胞内的包涵体,与预期的分子量42 k D一致,并且免疫大鼠后血清的多克隆抗体效价很高,为1∶32 768.制备的溶藻弧菌Tss J高效价多克隆抗体有助于进一步开展Tss J的定位和功能研究.     

哈维氏弧菌vgrG基因的原核表达及多克隆抗体的制备

VI型分泌系统(T6SS)是革兰氏阴性菌特有的一种多功能分泌系统,它与致病菌的致病性密切相关;而vgrG则是T6SS系统的结构蛋白之一,它与T6SS的功能直接相关.为了获得哈维氏弧菌vgrG基因的外源重组蛋白及制备其多克隆抗体,本研究以哈维氏弧菌QT520菌株的DNA为模板,在扩增获得vgrG基因后,构建了原核表达载体pET32a-vgrG并将其转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行原核表达.结果显示,在16℃和1mmol·L^-1 IPTG诱导20 h的条件下,可诱导重组蛋白rvgrG大量表达,条带大小与预期的分子量(88 kDa)一致;通过Ni²⁺亲和层析柱对融合蛋白rvgrG进行纯化,获得了纯度较高的目的蛋白rvgrG;将rvgrG重组蛋白通过腹腔注入小鼠体内后观察其毒性,结果显示rvgrG对小鼠无毒害作用;进一步用纯化蛋白rvgrG制备多克隆抗体,经ELISA检测,vgrG多克隆抗体的效价高达1∶320 000;蛋白免疫印迹(Western blot)检测表明,本实验所制备的vgrG多克隆抗体特异性强,可为后续进行vgrG蛋白的致病性及致...     

重组大肠埃希菌外膜蛋白C的表达、纯化及多克隆抗体制备

采用分子克隆方法获得大肠埃希菌外膜蛋白Omp C表达菌株;利用SDS-PAGE电泳切胶纯化、尿素梯度复性获得Omp C蛋白,免疫小鼠制备Omp C蛋白多克隆抗体。ELISA法证实Omp C抗血清滴度达1∶6 400倍,Western blotting发现Omp C抗血清具有很好的特异性。通过DNAMAN软件对Omp C序列同源性分析显示不同细菌间存在较高同源性,采用MEGA软件对Omp C的系统进化分析发现肠道致病菌亲缘关系更近。为Omp C蛋白免疫学功能研究奠定基础。     

GGPPS多克隆抗体的制备与鉴定

构建人香叶基香叶基二磷酸合成酶基因(GGPPS)原核表达载体,制备兔抗人GGPPS多克隆抗体.利用DNA重组技术构建原核表达载体pGEX-4T-GGPPS,诱导表达GGPPS融合蛋白,分离纯化该融合蛋白后,作为免疫原免疫家兔制备多克隆抗体.成功构建了pGEX-4T-1-GGPPS原核表达载体,转化Rosetta菌株后可高效表达GGPPS融合蛋白,成功制备GGPPS多克隆抗体,间接ELISA法测定抗体效价为1∶32000,并且抗体具有良好特异性.成功克隆GGPPS基因并制备了特异性的兔抗人GGPPS多克隆抗体,为进一步研究GGPPS的功能奠定了基础.     

创伤弧菌OmpU与嗜水气单胞菌OmpⅡ外膜蛋白二联表达及其初步免疫原性

从发病的养殖鳗鲡中分离出创伤弧菌(Vibrio vulnificus)和嗜水气单胞菌(Aeromona shydrophila),提取其基因组DNA,再通过PCR法克隆创伤弧菌外膜蛋白Omp U和嗜水气单胞菌外膜蛋白OmpⅡ的基因全长。采用融合PCR法体外连接这2个基因表达膜外片段的序列并成功构建了二联表达载体(p GEX-2T-Vibr-Aero-his)。在大肠杆菌(BL21)的吸光度A_(600)为0.6~1.0时,采用1.0 mmol/L IPTG诱导剂,16℃过夜诱导表达。表达产物经离心柱亲和层析纯化后获得分子量为82.2 ku的外膜蛋白。蛋白经透析复性后免疫于鳗鲡以测定其血清抗体效价。结果表明,重组蛋白注射组的鳗鲡血清抗体效价在免疫后第14天和第21天显著(P0.05)高于PBS对照组,第28天和第42天达到极显著(P0.01)水平。     

卵形鲳鲹Hepcidin-5的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

为了制备高效的卵形鲳鲹hepcidin-5蛋白多克隆抗体和对其特异性进行鉴定,本研究通过PCR扩增的方法获得了卵形鲳鲹抗菌肽hepcidin-5(Tro H5)的成熟肽cDNA序列,并构建了原核表达载体pET-32a(+)/TroH5,然后将其转入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中进行原核表达.经IPTG诱导,成功表达了相对分子质量约为35kDa的融合重组蛋白.经不同诱导条件的优化,最终确定在IPTG终浓度为0. 1mmol/L和温度为20℃时,其表达量最大.可溶性分析表明:该融合蛋白主要存在于上清中.经镍柱亲和层析纯化获得了纯度较高的融合蛋白,然后以免疫小鼠制备多克隆抗体,经ELISA法检测,其效价达到1∶105.蛋白免疫印迹(Western blot)检测表明:所制备的多克隆抗体特异性强.本研究为进一步探究hepcidin-5的生物学功能奠定了基础.     

重组盐藻14-3-3蛋白基因的原核表达及分离纯化

根据克隆的杜氏盐藻14-3-3蛋白的基因序列设计引物,采用RT-PCR方法扩增杜氏盐藻14-3-3蛋白的基因.经原核表达、Ni2+亲和层析法纯化,免疫动物制备抗体. 抗体蛋白质印迹分析检测结果表明抗体能特异结合盐藻细胞分子量为29 kD的多肽.     

BIG-3的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备与鉴定

原核表达、纯化骨形态发生蛋白诱导基因（BIG-3,BMP-2-induced gene 3kb）所编码的融合蛋白并制备其多克隆抗体。将BIG-3基因插入原核表达载体PGEX-4T-2的多克隆位点获得pGEX-4T-2-BIG-3重组表达载体,转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株,诱导表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白表达情况及Sepharose4B层析柱亲和层析法纯化的融合蛋白;用纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备其多克隆抗体,并以Western blot鉴定其特异性。结果在大肠杆菌中获得BIG-3-GST融合蛋白高水平的诱导表达,经Sepharose4B层析柱亲和层析,GST-BIG-3融合蛋白在电泳图片上显示较为清晰的单一条带,所制备的多克隆抗体具有较高的特异性。说明在大肠杆菌中成功表达且以亲和层析法纯化得到了BIG-3-GST融合蛋白,并制备了特异性较高的多克隆抗体。     

抗胸腺素α1(Tα1)多克隆抗体的纯化及转基因藻中Tα1的检测

采用不同浓度的硫酸铵分级盐析纯化抗Tα1多克隆抗体,然后用不同量的牛血清白蛋白(BSA)与兔抗Tα1抗体进行中和,以去除血清中的抗BSA抗体,并利用纯化后的抗Tα1多克隆抗体检测转基因藻中Tα1.结果表明:采用25%(NH4)2SO4进行分离纯化,并将BSA加入到血清中进行中和,37℃处理30min,BSA的量与血清的比例以1μL血清 15μgBSA可达到中和血清中的抗BSA抗体的目的.获得的抗Tα1抗体效价与未进行分离前基本相同,并且阴性本底低.采用ELISA方法检测野生藻和转基因藻中的Tα1,转基因藻的Tα1OD450值比野生藻的高2.1倍以上,提示Tα1在转基因藻中成功表达.实验证明,此方法能有效纯化抗胸腺素α1多克隆抗体,获得特异性强的抗胸腺素Tα1抗体,并且效价不受影响.     

解藻酸弧菌株ATCC 17749中海藻酸裂解酶基因的克隆与鉴定

以解藻酸弧菌株(Vibrio alginolyticus)ATCC 17749为研究对象,利用生物信息学寻找并预测得到5个可能的海藻酸裂解酶基因algV1、algV2、algV3、algV4和algV5。通过构建5个以pET-28a(+)为载体的大肠杆菌表达质粒pET28a-algV1、pET28a-algV2、pET28a-algV3、pET28a-algV4和pET28a-algV5,实现了5个基因的异源表达,并经海藻酸裂解酶定量和定性的活性分析,确定5个基因的编码产物都具有海藻酸裂解酶活性,其中重组的algV1、algV2和algV3为胞外酶,algV4和algV5为胞内酶。     

溶藻弧菌对水产动物致病性及其防治的研究进展

溶藻弧菌是一种常见的海洋伺机性病原体,是引起人类、水生动物细菌性疾病的重要病原之一。与其它病原微生物一样,弧菌的致病性与其产生的多种毒力因子息息相关,毒力基因是产生各种毒力因子的物质基础。本文对溶藻弧菌的病原学、致病机理及其防治等方面的最新研究成果进行了综述。     

拮抗菌对病原性溶藻弧菌粘附大黄鱼鳃粘液的影响

用3H-TdR同位素标记方法研究了分离自患病大黄鱼的溶藻弧菌和健康大黄鱼的7株拮抗菌对大黄鱼鳃粘液的粘附动力学以及拮抗菌对溶藻弧菌粘附的影响,试验结果表明:溶藻弧菌和7株拮抗菌对大黄鱼鳃粘液的粘附都属于饱和粘附;溶藻弧菌对大黄鱼鳃粘液的最大粘附量为4.1×105cells/well,7株拮抗菌的最大粘附量和亲和指数都高于溶藻弧菌;各菌株的分离常数都高于自身的最大粘附量,总体上呈现最大粘附量高的菌株其分离常数也大的趋势.7株拮抗菌在置换条件下都能显著降低溶藻弧菌对鳃粘液的粘附量,在竞争条件下有5株能够显著降低溶藻弧菌的粘附量,在排斥条件下仅有3株能够显著降低溶藻弧菌的粘附.结果表明:病原性溶藻弧菌对大黄鱼鳃粘液有较强的粘附作用;7株拮抗菌能够抑制溶藻弧菌的粘附,其中置换作用效果最好,排斥作用效果最差;拮抗菌和病原菌的粘附动力学特征可在一定程度上反映它们的相互作用效果,但是仅仅根据各菌株自身的粘附动力学特性无法推断其对病原菌粘附的抑制能力.     

霍乱弧菌及副溶血弧菌复合PCR检测方法的建立

根据已发表的副溶血弧菌和霍乱弧菌的基因组序列,设计合成了三对引物,用于同时检测这两种弧菌。扩增片段长度分别为285 bp、450 bp、643 bp。经实验验证建立的PCR检测方法特异性较好,三对引物间无互相干扰;同时对建立的PCR检测体系进行了敏感性测定,结果最低检测下限为2.1×103cfu/mL。     

鳗弧菌和副溶血弧菌对短蛸感染的病理学研究

为了今后养殖病害的防治,了解病原微生物在养殖过程中对头足类动物产生的影响,选择在海水养殖中发病频率较高的弧菌,包括鳗弧菌(Vibrio anguillarum)和副溶血弧菌(Vibrio Parahemolyticus),研究它们对短蛸的毒力水平。通过将稀释菌液直接注射短蛸腕部的方式,观察感染后短蛸的致死率、半致死时间,以及各菌对短蛸肝脏、鳃、鳃心、白体等器官结构的影响。结果显示:鳗弧菌和副溶血弧菌均对短蛸有较强的致病性,分别在60、48 h时达到半致死,且发病的短蛸活性减退,虚弱无力,腹部肿大,解剖可见部分内脏肿胀明显,如肝脏;通过对病变组织和健康组织的石蜡切片和HE染色,以及超显微结构的观察,发现患病短蛸的肝脏、鳃、鳃心和白体均出现不同程度组织、细胞结构上的破坏。以上结果表明这两种弧菌对短蛸均具有明显的致病性,副溶血弧菌更强一些,合适条件下将会成为短蛸规模化养殖的重要威胁之一。     

2种弧菌鞭毛蛋白的分离纯化与鉴定

尝试分离提取2种弧菌的鞭毛蛋白,采用垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳对所提蛋白进行分离纯化,Western免疫印迹检测,电镜鉴定。结果显示：实验已经成功分离提纯了哈维氏弧菌的鞭毛蛋白,获得了溶藻弧菌鞭毛蛋白的初提液。提纯的哈维氏弧菌鞭毛蛋白经SDS-PAGE显示3条清晰蛋白带（相对分子量分别为39.7,41.9和42.7KDa）,透射电镜观察表明该蛋白呈经典的丝状,可以认为哈维氏弧菌的鞭毛丝是由相对分子量分别为39.7,41.9和42.7KDa的3种鞭毛蛋白亚基构成。溶藻弧菌鞭毛蛋白的初提液经SDS-PAGE后显示5-9条蛋白带,其中36.8KDa的蛋白带有强的免疫原性。     

Preparation and Identification of Monoclonal Antibodies Against Vibrio anguillarum

Monoclonal antibodies (Mabs) against V. anguillarum strain M3 are prepared, and their isotypes are also characterized. Among them, C1C5 is the only Mab which does not cross-react with other eleven non-V, anguillarum strains. The proteinase K digestion test shows that the epitopes recognized by C1C5, C6C3 and C6C32 Mabs contained protein. The periodate oxidation test showed that the epitopes recognized by Mabs except C1 C5 are glycosylated. In addition, results of additivity test indicate that the epitopes recognized by C6C3 and C6C32 Mabs are similar, and quite different from those recognized by MabC1C5.