绵羊乳腺特异表达人肝细胞再生增强因子载体的构建及表达

用PCR技术分别从人和绵羊基因组DNA中扩增人肝细胞再生增强因子(Human augmenter of liver regeneration,hALR)基因和绵羊β-乳球蛋白(sheep beta-lactoglobulin,BLG)基因启动区序列,从pEGFP-C1质粒中扩增增强绿色荧光蛋白(Enhanced Green fluorescence protein,EGFP)基因及其表达调控元件．由质粒p7zf( )构建成ALR基因乳腺特异表达、EGFP基因非组织特异性表达载体．同时体外培养绵羊胎儿成纤维细胞(sheep fetal fibroblast cells,SFFCs),脂质体介导载体DNA转染SFFCs,激光共聚焦显微镜观察和PCR检测转基因细胞,结果表明,增强绿色荧光蛋白基因在SFFCs中表达,转基因细胞中可扩增出BLG、ALR、EGFP基因条带．     

人肝细胞再生增强因子双顺反子表达载体的构建及表达

PCR扩增人肝细胞再生增强因子(Human augmenter of liver regeneration,ALR)基因,将其插入质粒pIRES2-EGFP多克隆位点中,构建成新霉素(Neo)、增强绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescence protein,EGFP)双标记基因且EGFP和ALR基因为双顺反子的真核表达载体pAIE.另外体外培养绵羊胎儿成纤维细胞(Sheep fetal fibroblast cells,sFFCs),脂质体lipofectAMINETM介导pAIE转染sFFCs,经过筛选后形成单克隆细胞,RT-PCR和免疫组化方法进一步检测ALR基因的表达.进一步将转基因细胞饥饿培养,体外成熟培养绵羊卵母细胞146个,进行体细胞核移植,经融合、激活后,在培养液中进行发育培养,对发育到8细胞胚胎在激光共聚焦显微镜下观察;同时利用免疫组化检测ALR基因在胚胎中的表达.结果表明:由IRES连接的EGFP和ALR基因在sFFCs内同时存在并表达;得到45个8细胞体细胞克隆胚胎,其中14个发育形成囊胚,EGFP和ALR基因在体细胞克隆胚胎中同时存在并表达.因此由IRES连接标记基因和目的基因,以标记基因指示目的基因的表达,可减少检测目的基因的繁琐手段,可得到高纯度表达ALR基因的转基因细胞和胚胎,为生产药用蛋白治疗肝脏疾病奠定实验基础.     

根癌农杆菌介导的绿色荧光蛋白基因在水稻植株中的表达

将改良的绿色荧光蛋白（EGFP）基因插入到植物表达载体中,构建了ubi启动子驱动下的植物表达载体p13UEGFP．通过根癌农杆菌介导转化水稻的胚性愈伤组织,经潮霉素筛选,获得抗性愈伤组织和再生植株．对T2代植株进行PCR分析、激光共聚焦显微镜检测和RT—PCR分析,结果表明,绿色荧光蛋白基因已经在转基因植株中稳定表达．     

七鳃鳗PHB2的真核表达与亚细胞定位

以东北七鳃鳗心肌总RNA 反转录得到的cDNA为模板,PCR扩增 PHB2基因全长CDS区,并将其定向克隆至真核表达载体 pEGFP‐N1上,构建真核重组载体pEGFP‐N1‐Lm‐PHB2．提取重组质粒,去除内毒素,利用脂质体介导的方法转染CHL、HeLa和MCF‐7细胞,通过Western Blot检测转染后 Lm‐PHB2是否表达,Confocal观察EGFP融合蛋白在细胞中的表达及亚细胞定位．结果表明：PCR扩增片段与预期结果相符,双酶切和测序证明真核表达载体构建成功;Western Blot检测到Lm‐PHB2蛋白条带,Confocal观察到绿色荧光蛋白GFP ,证明真核重组载体成功表达;Lm‐PHB2蛋白主要定位在CHL细胞的细胞核,少量存在于基质和线粒体中,而在 HeLa和MCF‐7细胞中,Lm‐PHB2蛋白集中定位在细胞核中．本研究为七鳃鳗Lm‐PHB2的功能研究奠定了重要基础．     

人PSF真核表达载体构建及其在CHO细胞中的表达

目的是构建人PSF基因真核表达载体pEGFP-N1-PSF,并在检测其在CHO细胞株中的表达情况。应用DNA重组技术和PCR方法从人宫颈癌Hela细胞中扩增PSF基因,插入pEGFP-N1真核表达载体,构建重组质粒pEGFP-N1-PSF并测序鉴定。将pEGFP-N1-PSF瞬时转染CHO细胞,通过Western blot和RT-PCR方法检测PSF的表达,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达。结果 CHO细胞转染pEGFP-N1-PSF真核表达载体后,RT-PCR和Western blot实验发现,在RNA和蛋白水平有PSF的表达,在荧光显微镜下可以观察到融合蛋白EGFP/PSF的表达。成功构建pEGFP-N1-PSF真核表达载体,证实其在CHO细胞中可以表达。     

Construction of Eukaryotic Expression Vector of Human PSF and Identification of its Expression in CHO Cell Line

目的是构建人PSF基因真核表达载体pEGFP-N1-PSF,并在检测其在CHO细胞株中的表达情况.应用DNA重组技术和PCR方法从人宫颈癌Hela细胞中扩增PSF基因,插入pEGFPNL真核表达载体,构建重组质粒pEGFP-N1-PSF并测序鉴定.将pEGFP-N1-PSF瞬时转染CHO细胞,通过Western blot和RT-PCR方法检测PSF的表达,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达.结果CHO细胞转染pEGFP-N1-PSF真核表达载体后,RT-PCR和Western blot实验发现,在RNA和蛋白水平有PSF的表达,在荧光显微镜下可以观察到融合蛋白EGFP/PSF的表达.成功构建pEGFP-N1-PSF真核表达载体,证实其在CHO细胞中可以表达.     

绵羊乳腺特异表达hALR基因载体的构建

以绵羊β-乳球蛋白(β-lactoglobulin，BLG)基因5’端0．8kb片段，作为目的基因人肝再生增强因子(Human augmenter of liver regeneration，hALR)乳腺特异表达启动子，人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus，CMV)启动子为绿色荧光蛋白基因(Enhanced Green fluorescence protein，EGFP)的启动子，构建了ALR基因乳腺特异表达而EGFP基因非组织特异性真核表达载体．这将为利用乳腺生物反应器生产人肝再生增强因子转基因动物及转基因早期胚胎鉴定奠定基础。     

增强型绿色荧光蛋白基因真核表达载体的构建

构建增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因的真核表达载体pCDNA3．1( )-EGFP,转染至培养的Hela细胞中成功表达,并发出绿色荧光,证明EGFP一种良好的报告基因和筛选标记．     

原核显微注射产生转基因绵羊胚胎

体外采集绵羊卵丘卵母细胞复合体,成熟培养24 h,经过体外受精培养17 h,比较高速离心对胚胎发育的影响;高速离心可以使黑色脂滴甩到一边从而使受精卵原核清晰可见.然后将绵羊乳腺特异表达人肝细胞再生增强因子和真核细胞表达增强绿色荧光蛋白(Enhanced Green fluorescence protein,EGFP)的载体DNA显微注射于绵羊受精卵雄原核中,并将异构胚在SOF液中发育培养.结果表明:高速离心组囊胚率低于对照组,但是没有显著性差异(P》0.05);显微注射外源基因2天后在激光共聚焦显微镜下可见荧光胚胎;PCR检测5个荧光胚胎均可见特异性条带.在原核显微注射生产转基因胚胎中,绿色荧光蛋白可作为标记基因进行早期胚胎筛选,为提高转基因动物移植效率奠定实验基础.     

HAb18G/CD147真核荧光蛋白的表达及鉴定

构建肝癌相关抗原HAb18G／CD147全长及缺失片段E51（第22—50位氨基酸缺失）的真核荧光蛋白表达载体,进一步研究该基因在肝细胞肝癌发生中的作用。通过PCR及Overlapping PCR的方法获得目的基因．与荧光载体pEGFP—N1双酶切、连接、转化E．coli JM109．构建含有肝癌相关抗原HAb18G／CD147全长及E51的真核荧光蛋白表达载体．并经限制性酶切及序列分析证明插入是否正确。用阳离子脂质体介导转染COS-7细胞,进行瞬时表达;荧光显微镜观察EGFP表达,通过流式细胞术检测蛋白的表达情况,明胶酶谱法鉴定其功能。成功地构建了真核荧光蛋白表达载体pEGFP—N1／HAb18G、pEGFP—N1/E51,并经限制性酶切及序列分析证明外源基因插入正确;流式细胞术鉴定该蛋白表达正确;功能实验证实缺失片段E51不具有诱导成纤维细胞分泌MMPs的功能．结果显示HAb18G／CD147基因第22—50位氨基酸与其刺激成纤细胞分泌MMP和功能有密切关系。实验结果为HAb18G蛋白分子的生物学功能研究奠定了基础。     

邻单胞菌邻苯二酚1,2-双加氧酶基因(tfdC)在拟南芥中表达的初步研究

将从一株邻单胞菌中克隆到的一个新的邻苯二酚1，2－双加氧酶基因（tfd C)的起始密码子由GTG突变成ATG，并克隆到农杆菌双元载体pPZPY122中，利用农杆菌介导转化模式植物拟南芥，获得了转化植株，经过PCR，PCR－Southern和Southern dot blot方法检测证实，ftd C基因已经整合到拟南芥基因组中，邻苯二酚1，2－双加氧酶酶活性检测表明，转基因植株具有一定的酶活性，而未转化的植株则不具有酶活性。     

Transgene directionally integrated into C-genome of Brassica napus

Transgenic Brassica napus has been widely planted in Canada, the United States, and some other countries. In China, although the policy for genetically modified foods has not yet opened, genetically modified rape- seed oil as raw material for biodiesel of…     

EGFP-IgG4融合基因真核表达载体的构建及其表达

构建增强型绿色荧光蛋白（Enhanced Green Fluorescent Protein, EGFP）和IgG4基因的融合蛋白真核表达载体pMM-EGFP-IgG4/WG，转染至中华仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)中成功表达，并发出绿色荧光，证明pMM-EGFP-IgG4/WG是一种良好的生产分泌型外源融合蛋白的阳性对照.     

反义ACC合成酶基因导入番茄的研究

 采用农杆菌介导法将携带有反义ACC合成酶基因和NPT II的表达载体pKAC导入番茄栽培品种美国大红五星102、美国大红108、美国大红王、大红II号等中.经过卡那霉素筛选后,获得了一批抗性苗,其中有3株PCR检测为阳性.实验证明,不同激素配比对番茄子叶不定芽的诱导有一定影响,适宜的农杆菌侵染时间和浓度是番茄基因转化成功与否的关键,延迟选择有利于番茄基因转化细胞的生长.     

Generation of transgenic wheat resistant to wheat yellow mosaic virus and identification of gene silence induced by virus infection

The plasmid containing the promoter Act1, the coat protein (cp) gene of wheat yellow mosaic virus (WYMV) and the selectable bar gene, was delivered via particle bombardment, directly into immature embryos of a wheat cultivars. PCR and PCR-RFLP were employed to screen the existence of the cp gene in T0 and T1 generations. Seeds from the positive T1 plants were sowed in fields heavily contaminated with WYMV to detect their resistance. In field trial of virus infection, one of the transgenic wheat lines, P8-T2, exhibited highly disease-resistance. Western blot and RT-PCR analysis showed that the expression level of cp gene in the resistant transgenic line was reduced greatly compared to those susceptible to WYMV infection. This provided evidence to presume that the resistance obtained by the transgenic wheat line was stimulated by the mechanism of the virus induced gene silencing.     

Vill转基因小鼠的制备

摘要:目的　通过制备Vill转基因小鼠研究该基因的功能。 方法与结果　首先由RT-PRC方法获得全长约2605bp的Vill基因;经T载体克隆测序验证后,以克隆载体pMD19-T-Vill为模板,设计引物并引入酶切位点,将PRC扩增产物与pEF6/V5-His-LacZ同时进行酶切、连接,构建表达载体pEF6/V5His-Vill;经真核表达验证后,酶切获得含Vill基因的显微注射DNA构件;显微注射390枚受精卵后,在出生存活的77只仔鼠中获得转基因阳性GO代小鼠19只,其中16只能够稳定遗传并建系,转基因阳性小鼠外观未有明显改变。 结论　Vill转基因小鼠为该基因的功能研究准备了实验材料。     

5S及16S rDNA序列PCR扩增用于环境军团菌检测

军团菌病（Ｌｅｇｉｏｎｎａｉｒｅｓ’ｄｉｓｅａｓｅ）是一种严重的空气传播疾病,在世界各地都常有报道,是由军团菌（Ｌｅｇｉｏｎｅｌａ）引起,该菌迄今已鉴定出了４４个种,其中１８种具致病性,最常见的导致严重病症的种有嗜肺军团菌（Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ...     

农杆菌介导GNA基因对水稻的遗传转化

在ｐＣＡＭＢＩＡ３３００质粒中插入带有ＲＳｓ－１启动子的ＧＮＡ基因,并利用农杆菌介导的遗传转化将其导入水稻的微不定芽受体,得到了再生植株。ＰＣＲ,Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ的检测结果初步证明ＧＮＡ基因已经整合到水稻的基因组中并得到表达。