基于表面重塑方法的抗体HAb18可变区人源化设计

在分析抗体空间结构特点和残基间相互作用基础上,利用计算机辅助的分子设计和表面残基替换法进行鼠源抗体人源化设计。在抗体同源模建的基础上,利用序列分析和结构分析确定鼠源抗体可变区中外露的非人样差异残基,参考分子内、间氢键相互作用,最终选定将要突变的残基位点。使用这种方法对一株抗人肝癌细胞的单克隆抗体HAb18进行了人源化改造设计,并将候选位点分为三类,以便于在实验中依次突变,寻找降低鼠源抗体免疫原性和保持其生物功能之间适宜的平衡点。结果表明表面重塑方法可以有效地减少抗体人源化设计中CDR空间构象的变化,维持抗体生物活性,为试验提供有力的理论依据。     

单克隆抗体与葡萄球菌肠毒素A结合物的制备及其抗肝癌作用

目的：制备超抗原（BAg)葡萄球菌肠毒素A（SEA）与抗人原发性肝细胞癌（简称肝癌）单克隆抗体（McAb)HAb18F(ab‘)2段的结合物,探讨其介导外周血单个核细胞（PBMC）的抗人肝癌作用。方法,制备McAb HAb18,并用木瓜蛋白酶消化法制备其F（ab‘)2段,再用化学连接剂N－琥珀酰亚氨基－3－（2－二硫吡啶）丙酸酯（SPDP）制备HAb18 F(ab‘)2-SEA结合物,结合物经经快速蛋白质液相层析系统用凝胶色谱柱纯化后,用SDSPAGE鉴定各种收集峰,免疫组化ABC法鉴定结合物的抗体活性,MTT法鉴定结合物活化PBMC的活性及其介导PBMC的杀伤肝癌细胞作用,结果,制备的HAb18F(ab‘)2-SEA结合物具有肝癌抗体活性和活化PBMC的功能,此结合物具有明显的介导PBMC杀伤肝癌细胞的作用,并与其[浓度呈正相关,结论,SPDP是一种很好的蛋白质交联剂,HAb18 F(ab‘)2-SEA结合物民向治疗肝癌具有一定的发展前景。     

HAb18G/CD147真核荧光蛋白的表达及鉴定

构建肝癌相关抗原HAb18G／CD147全长及缺失片段E51（第22—50位氨基酸缺失）的真核荧光蛋白表达载体，进一步研究该基因在肝细胞肝癌发生中的作用。通过PCR及Overlapping PCR的方法获得目的基因．与荧光载体pEGFP—N1双酶切、连接、转化E．coli JM109．构建含有肝癌相关抗原HAb18G／CD147全长及E51的真核荧光蛋白表达载体．并经限制性酶切及序列分析证明插入是否正确。用阳离子脂质体介导转染COS-7细胞，进行瞬时表达；荧光显微镜观察EGFP表达，通过流式细胞术检测蛋白的表达情况，明胶酶谱法鉴定其功能。成功地构建了真核荧光蛋白表达载体pEGFP—N1／HAb18G、pEGFP—N1/E51，并经限制性酶切及序列分析证明外源基因插入正确；流式细胞术鉴定该蛋白表达正确；功能实验证实缺失片段E51不具有诱导成纤维细胞分泌MMPs的功能．结果显示HAb18G／CD147基因第22—50位氨基酸与其刺激成纤细胞分泌MMP和功能有密切关系。实验结果为HAb18G蛋白分子的生物学功能研究奠定了基础。     

SARS-CoV刺突蛋白受体结合区的表达及高潜在中和性人源抗体的制备

为表达SARS-CoV刺突蛋白S(Spike)受体结合区(RBD)并从中筛选高潜在中和性人源抗体,我们用原核表达并纯化的SARS-CoVSRBD进行抗体库的筛选。从多个曾患SARS的健康人血中获得淋巴细胞,PCR扩增全部抗体基因,插入Pcomb3x载体中,构建抗SARS病毒人源噬菌体抗体库。利用噬菌体表面呈现技术,从中筛选结合SARS-CoVSRBD的人源抗体并用ELISA及Westernblot鉴定阳性克隆,竞争ELISA检测人源抗体阻断SARS-CoVSRBD与其受体ACE2的结合情况。结果为构建了库容量6.2×107的免疫Fab噬菌体抗体库,重组率为75%,从中筛选获得9株特异抗SARS-CoVSRBD的人源Fab抗体,ELISA及Westernblot检测均为阳性。其中有一株能阻断SARS-CoVSRBD与其受体ACE2的结合。本实验结果表明:人源抗SARS-CoVSRBD基因工程抗体的获得,一方面将对SARS疾病的特异性预防,治疗和诊断提供新的途径,同时也提示SARS-CoV亚单位疫苗可以用于SARS疾病的预防。