红冬孢酵母Δ~(12)-脂肪酸脱氢酶基因的克隆和表达

Δ~(12)-脂肪酸脱氢酶是多不饱和脂肪酸合成的关键酶.参考已知的Δ~(12)-脂肪酸脱氢酶基因序列设计特异性引物,通过PCR扩增从红冬孢酵母YM25235中获得了全长为1 341 bp的一个cDNA序列.序列分析表明,该序列具有一个编码446个氨基酸、相对分子质量为50.6 ku的完整开放阅读框,所编码的氨基酸序列与Δ~(12)-脂肪酸脱氢酶相似性最高但并不相同,而且也具有Δ~(12)-脂肪酸脱氢酶特异性的3个组氨酸保守区,表明该序列为一个新的编码Δ~(12)-脂肪酸脱氢酶的基因.为了验证功能,将该基因序列克隆到表达载体pYES3/CT中,构建重组质粒pY3RKD12,并转化到酿酒酵母的缺陷型菌株INVSCI中进行异源表达.通过脂肪酸气相色谱(GC)分析表明,在pY3RKD12转化的酵母细胞总脂肪酸中出现一个保留时间和亚油酸甲酯标准品相同的新峰,其含量占酵母总脂肪酸的3.76%,但在pYES3/CT转化的酵母细胞总脂肪酸中没有检测到.这些结果证明所克隆的序列是一个新的Δ~(12)-脂肪酸脱氢酶基因,其表达的蛋白质可催化油酸合成亚油酸.     

多不饱和脂肪酸与红冬孢酵母低温适应性的关系研究

以一株产油酵母——红冬孢酵母(Rhodosporidium kratochvilovae)YM25235作为出发菌株,分析其低温生长适应性与细胞膜流动性、膜脂脂肪酸含量的变化和多不饱和脂肪酸合成关键基因——Δ12-脂肪酸脱氢酶基因mRNA表达水平的关系.结果显示,YM25235在5～35 ℃温度条件下均能生长,最适生长温度为30 ℃.低温条件下细胞膜流动性明显降低,但是多不饱和脂肪酸质量分数由从30 ℃时的24.35%增加到15 ℃时的40.32%,而且15 ℃时Δ12-脂肪酸脱氢酶基因mRNA水平提高了3.4倍.结果说明低温条件下细胞膜流动性下降,导致多不饱和脂肪酸合成相关基因表达水平提高,使得细胞膜脂中多不饱和脂肪酸含量增加,促进了菌株低温生长适应性.     

高山被孢霉Δ~6-脂肪酸延长酶基因在巴斯德毕赤酵母中的表达

长链多不饱和脂肪酸花生四烯酸(ARA,C20:4n-6)是合成生物活性物质类二十碳烷酸的初级底物神经组织的重要组成成分.Δ6-脂肪酸延长酶是花生四烯酸Δ6-合成途径的关键酶之一.根据已经报道的Δ6-脂酸延长酶基因序列设计引物,分别从产花生四烯酸的丝状真菌高山被孢霉ATCC16266菌株基因组和cDNA扩增得到该序列.经序列分析后,将来源于cDNA的序列连接到毕赤酵母表达载体pPIC3.5K上,得到重组质PIC3.5K-ELO.用电击转化法将重组载体pPIC3.5K-ELO转化到巴斯德毕赤酵母GS115中,在缺省培养基筛选得到毕赤酵母转化菌株pPIC3.5K-ELO.在适宜的培养条件下,添加外源底物γ-亚麻酸(GLA)和诱导物醇诱导基因表达.气相色谱分析表明该基因在毕赤酵母中得到了表达,底物GLA转化为二高γ-亚麻酸GLA),转化效率为28.91%.对Δ6-脂肪酸延长酶进行跨膜分析,表明该蛋白为具有7个跨膜域的膜结合蛋白.     

重组海葵毒素AP-b毕赤酵母表达体系的建立及其鉴定

按照毕氏酵母的偏爱密码子,设计并合成了海葵毒素AP-b的基因序列,将合成基因序列通过一系列操作导入毕氏酵母表达载体pPICZa中,以电穿孔方法转化毕氏酵母菌株X33,通过PCR法鉴定,筛选出能够表达重组海葵毒素的酵母菌株.结果表明,构建出海葵毒素AP-B毕赤酵母真核表达体系,并鉴定出4株含有海葵毒素基因的毕赤酵母工程菌.     

深黄被孢霉△6-脂肪酸脱氢酶基因敲除及鉴定

以产油丝状真菌深黄被孢霉M6-22(Mortierella isabellina 6-22)为出发菌株,利用亚硝基胍诱变技术筛选到一株对潮霉素药物敏感的菌株Mortierella isabellina 6-22-4,同时构建了含有潮霉素抗性基因表达单元和深黄被孢霉△6-脂肪酸脱氢酶基因5'与3'端部分同源序列的重组质粒PD4MI6,用于对深黄被孢霉△6-脂肪酸脱氢酶基鼠的敲除.通过PEG/CaCl2介导的原生质体转化法,将质粒PD4MI6转化入深黄被孢霉M6-22-4菌株.转化子经潮毒素抗性选择平板筛选、分子检测获得了一个△6-脂肪酸脱氢酶基因缺失的突变株Mut6.气相色谱分析结果显示,该突变株γ-亚麻酸特征峰消失,相应地亚油酸产量显著增加.培养结果表明该突变株的菌落形态、颜色及生长状况与出发菌株M6-22或M6-22-4相比均有显著改变.     

无筛选标记基因高油酸花生高效载体的构建

提高油酸的相对含量,增加油酸 /亚油酸(O/ L)的比值,已成为目前油料作物品质改良的重要内容.ahFAD2B是编码花生微粒体ω 6-脂肪酸脱氢酶的主要基因,根据双链RNA介导的基因沉默原理,设计和构建了可以抑制花生种子油酸脱氢酶基因ahFAD2B表达的载体,从而提高了油酸的含量,改善了花生油脂肪酸的组成.进一步将该构建组装到一个双右侧边界(DRB)的共转化载体中,用该载体来转化花生,以期从转基因后代中筛选无抗生素标记基因的高油酸花生材料.     

酿酒酵母中少根根霉△6-脂肪酸脱氢酶对α-亚麻酸催化活性的研究

多不饱和脂肪酸(po lyunsaturated fatty ac ids,PU FA s)可分为n-6和n-3两个系列,而Δ6-脂肪酸脱氢酶是这些PU FA s合成途径中的限速酶.将少根根霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因转化酿酒酵母营养缺陷型菌株INV S-cl,在添加外源性底物α-亚麻酸,经半乳糖诱导后,通过气相色谱(GC)和气相色谱/质谱(GC-M S)联用分析细胞脂肪酸表明,少根根霉Δ6-脂肪酸脱氢酶催化α-亚麻酸转化成十八碳四烯酸,所生成十八碳四烯酸的含量占酵母细胞总脂肪酸的7.67%,而在空载体pYES2.0转化的酵母中没有检测到.同时,参照K ozak序列,我们把少根根霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因的转译起始密码子周边序列进行适当的改变,并转化INV Scl进行分析,结果显示修改后的序列同样能催化α-亚麻酸转化成十八碳四烯酸,而且表达量提高到细胞总脂肪酸的11.23%,表明在酿酒酵母中,改变转移起始密码子周边序列可提高少根根霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因催化α-亚麻酸转合成十八碳四烯酸的水平.     

嗜碱芽孢杆菌耐热耐碱内切木聚糖酶基因的密码子优化及在毕赤酵母中的表达

【目的】研究极端耐热耐碱的木聚糖酶,使其能够满足造纸行业中碱性高温的苛刻环境。【方法】将一种来源于嗜碱芽孢杆菌S7的耐热耐碱内切木聚糖酶基因(xyn10A)密码子进行优化,基因合成后克隆至pHBM905BDM载体上,并转化毕赤酵母GS115菌株。【结果】木聚糖酶基因(xyn10A)优化后与原始序列比对相似性为76.70%。基因合成后克隆到pHBM905BDM载体上,并成功转化毕赤酵母GS115菌株。通过交联木聚糖底物平板水解圈法初筛及摇瓶复筛得到一株产酶量较高的菌株,且其在摇瓶发酵第10天达到最高酶活力,为495U/mL。另外,糖基化分析表明该酶在毕赤酵母中表达时被糖基化修饰。【结论】密码子优化后的极端耐热耐碱木聚糖酶基因在毕赤酵母中成功表达。     

重组人卵ZP3肽段在毕赤酵母中的表达

目的:用毕赤酵母(Pichia pastoris)表达人透明带hZP3片段,研究其抗生育作用.方法:设计特定引物从hZP3全长序列中PCR扩增794～1282nt基因片段,将扩增片段克隆到酵母表达载体pPICZα上, 构建成重组质粒pPICZα-hZP3CT,线性化后的重组质粒导入毕赤酵母中,筛选出高拷贝菌株,甲醇诱导目的蛋白表达.用SDS-PAGE 和Western blotting 分析表达产物.结果:成功构建酵母表达载体,并在酵母菌株X-33中诱导表达重组蛋白.重组蛋白可以与鼠抗重组人卵透明带hZP3融合肽段的抗血清发生特异结合,表明目的基因成功表达.结论:重组hZP3蛋白已在酵母中成功表达,目的蛋白能与相应的抗体结合.     

肿瘤抑制因子p53蛋白在毕赤酵母中的克隆表达

TP53基因在调控细胞信号通路和抑制肿瘤细胞中发挥着重要作用.本研究利用毕赤酵母表达系统以获得大量重组p53蛋白,为此,本文将人TP53基因克隆至表达载体p PIC3.5K,电转化进入毕赤酵母GS115,通过组氨酸筛选和G418筛选,获得高拷贝稳定转化子.SDS-PAGE和Western Blot检测结果表明p53蛋白可以在毕赤酵母中表达.本研究所获酵母菌株为今后大规模生产重组p53蛋白奠定了基础.     

乙肝表面抗原在分泌型毕赤酵母中的表达及纯化

目的对分泌型毕赤酵母中表达乙肝表面抗原并进行亲和层析纯化。方法从已确诊的乙肝患者阳性血清中提取乙肝病毒DNA,PCR扩增乙肝病毒表面抗原编码基因S,将其插入含有仅分泌信号肽序列和6个组氨酸纯化标签的毕赤酵母表达载体pPICZα,成功构建了重组表达载体pPICZα—HBVs。电转化酵母菌株GS115,得到重组乙肝表面抗原S的酵母表达菌株。结果诱导培养基BMMY中甲醇终浓度为1％,诱导表达48h重组蛋白表达量及抗原性达到最高。非变性条件下亲和层析纯化后,薄层扫描分析得到纯度超过95％,表达量约为2mg／L的重组蛋白。结论Western-blot和ELISA分析表明,所得产物为乙肝表面抗原S蛋白,其纯度和产量足以免疫小鼠制备单克隆抗体。     

酿酒酵母GPDH1基因表达载体pPIC3.5K-ScGPD的构建及其在巴斯德毕赤酵母中的表达

将酿酒酵母3-磷酸甘油脱氢酶基因GPDH1的编码序列构建到表达载体pPIC3．5K中，利用电转化法将构建好的表达载体转入巴斯德毕赤酵母中，利用含有G418的YPD平板筛选到两个阳性转化子，通过分子生物学及外源蛋白表达实验证明，酿酒酵母3-磷酸甘油脱氢酶基因GPDH1已经整合到巴斯德毕赤酵母的基因组上，并且得到了预期的表达。     

红树植物叶片中脂肪酸组成及其资源价值

采用气相色谱和色质联用仪分析发现我国不同地区主要红树植物种类叶片与非红树植物在脂肪酸组成上相似，但饱和脂肪酸含量相对较多，不饱和脂肪酸含量较少；脂肪酸不饱和指数较低；不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸含量的比值较小．红树植物体内多不饱和脂肪酸种类多而且廿碳四烯酸和亚油酸含量较高，是潜在的脂肪酸资源．红树植物叶片凋落物中的多不饱和脂肪酸为红树林生态系统中的鱼虾蟹提供必需脂肪酸，对提高近海水产的产量有重要的意义     

产甘油酵母菌株的分离与鉴定

针对西部极端微生物资源开发,从川西北高寒草地野生花粉中分离耐高渗的酵母菌株,通过采用形态和生理生化试验对分离出的3株编号为SCU-1、SCU-2、SCU-3的酵母菌株进行鉴定,初步鉴定3个菌株为：粉状毕赤酵母(Pichia farinosa)、克鲁丝假丝酵母(Candida kru-sei)、酿酒酵母(Saccharomyces cereuisiae),通过对3株酵母菌株的产甘油鉴定结果显示,耐高渗粉状毕赤酵母可通过产生甘油适应外界渗透压变化。     

毕赤酵母新型反向筛选标记基因的鉴定

利用转座子突变技术构建毕赤酵母菌株突变库,并分离出能够在含雷帕霉素（10 ng/mL）培养基中生长的突变株mut375.通过热不对称交错PCR（TAIL-PCR）获取转座子侧翼序列,对转座子的插入位点进行定位.转座子插入PAS_Chr2-2₀375基因,破坏了其开放阅读框的完整性,将该基因命名为kFPR1.本研究利用同源重组敲除kFPR1基因使毕赤酵母产生了雷帕霉素抗性,回补该基因功能的菌株则不能在含雷帕霉素的培养基上生长.基于kFPR1基因的特性,建立了一种适用于毕赤酵母的无标记基因操作方法.以kFPR1作为反向筛选标记成功构建了表达EGFP的重组菌株并且回收了ZeoR筛选标记,为毕赤酵母的遗传操作提供了新的筛选工具.     

大黄鱼生长激素在毕赤酵母中的优化表达

尝试利用毕赤酵母的表达系统制备大黄鱼生长激素(Pseudoscraena crocea,growth hormone,pcGH).根据酵母偏好密码子设计优化的基因序列,通过化学方法合成pcGH基因,构建表达载体pPICZ A - GH,利用化学转化技术,将该基因整合到巴斯德毕赤酵母X -33菌株染色体上并得以成功表达,...     

播娘蒿叶绿体型△12脱饱和酶的功能研究

本文应用RT-PCR和RACE方法扩增出了的播娘蒿叶绿体型△12脱饱和酶（Ds-FAD2CHL）全长cDNA,其完整编码框为1344 bp,编码447个氨基酸;该基因ORF在酵母Saccharamyces cerevisiae中的表达阐明其功能为将18:1^△9脱饱和生成亚油酸(18:2^△9,12);进一步切除叶绿体信号肽后的脱饱和酶在酵母中把18:1^△9脱饱和生成18:2^△9,12的效率提高了3.72%;通过GC/MS分析转基因酵母的磷脂及酰基辅酶A库发现,该脱饱和酶的作用底物为磷脂,而不是以酰基辅酶A形式结合的脂肪酸.     

植物GSTZ基因在毕赤酵母中的高效分泌表达

谷胱甘肽S-转移酶zeta类(GSTZ)是一种重要的多功能酶,与细胞生化代谢、环境净化等密切相关.将拟南芥、甘蓝型油菜"陕2B"和"垦C1"的GSTZ基因重组到表达载体pPIC9,电转化到毕赤酵母株GS115中,得到了分泌表达GSTZ酶的毕赤酵母工程菌株.甲醇诱导表达显示,最佳诱导时间在48～60 h,DCA-DC比活力为83.21～115.31 U/mg,GSTZ分泌量为25.71～42.90 U/mL.研究结果表明,植物GSTZ基因在毕赤酵母中的表达是高效的,为大规模发酵生产GSTZ奠定了基础.     

猪胃蛋白酶原A在毕赤酵母中的高效表达及其分离纯化

尝试利用毕赤酵母(pichia pastoris)表达体系大量生产制备猪胃蛋白酶,用化学的方法合成猪胃蛋白酶原A基因,并构建表达载体pGAPZα-pepsinogen;利用化学转化技术,将该基因整合到巴斯德毕赤酵母x-33菌株的染色体上.经过发酵,三角摇瓶培养条件下获得的猪胃蛋白酶原A总酶活达5 250U/L.发酵液上清经过DEAE离子交换色谱和Sephacryl S-200分子筛色谱分离,活化酶原后测定其比活达到52 800 U/g.     

一种与胆固醇7,8位脱氢相关蛋白的表达研究

家蚕(Bombyx mori)的Nvd-Bm蛋白是一种与胆固醇7,8–脱氢酶相关的蛋白.根据NCBI中报道的家蚕中的胆固醇7,8–脱氢酶基因序列(Gen Bank登录号:AB232986.1),采用密码子优化及基因克隆技术,扩增获得胆固醇7,8–脱氢酶目标基因nvd-Bm,并构建了重组穿梭载体p PIC9K-nvd-Bm,通过电转化,成功构建了含有p PIC9K-nvd-Bm的毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115异源真核表达工程菌株.经SDS-PAGE蛋白电泳分析表明,含有p PIC9K-nvd-Bm的毕赤酵母GS115表达菌株能够成功表达目标蛋白,为胆固醇的7,8–脱氢产物即7–脱氢胆固醇的生物转化奠定了基础.