维生素B12分批与补料分批发酵的研究

首先对维生素B12产生菌Propionibacterium shermanii在7L发酵罐内分批发酵下的菌体生长及产维生素B12的特性进行了研究。分批发酵的结果表明，虽然提高葡萄糖的浓度可以提高产量，但是存在着菌体生长受抑制，耗糖缓慢，发酵周期长的缺陷。继而进行了间歇补料分批发酵工艺的研究，确定了初糖浓度及补糖策略。发酵最终菌体干重达16．96g／L，较分批发酵提高50％；维生素B12的产量达38．55mg／L，较分批发酵提高16％；有效缩短了发酵周期，较分批发酵缩短24h。     

L-缬氨酸补料分批发酵条件优化

研究了不同初糖浓度、葡萄糖及氮的补加方式、补加玉米浆和溶氧对L-缬氨酸发酵过程中产酸率、转化率、发酵周期等参数的影响。确定了L-缬氨酸补料分批发酵的最佳条件，在最佳补料分批发酵条件下，L-缬氨酸产量达52．71g／L，糖酸转化率迭26．8%。     

大肠杆菌生产重组人bFGF的发酵条件

对含有具有氨苄抗性、Ｌａｃ启动子和编码人碱性成纤维细胞生长因子（ｈ－ｂＦＧＦ）基因质粒的大肠杆菌的发酵条件进行了研究。为了获得ｈ－ｂＦＧＦ高效表达的最佳条件，进行了摇瓶试验。在ＩＰＴＧ诱导作用下，ｈ－ｂＦＧＦ可以分泌到胞浆中，采用连续流加葡萄糖的高密度分批发酵工艺，经１１ｈ发酵可以获得菌体光密度值（ＯＤ值）达３８，产量达２００ｍｇ／Ｌ和ｈ－ｂＦＧＦ。经纯化后得到的高纯度ｈ－ｂＦＧＦ其理化及生物学特     

L-亮氨酸补料分批发酵研究

对补料方式、补料速度等发酵过程的各种参数，以及产酸率、转化率、发酵周期等的影响和补料分批发酵条件进行了研究，确定了L-亮氨酸补料分批发酵的最优条件。在最优补料分批发酵条件下，10L罐L-亮氨酸产量达29．47g/L，糖酸转化率达21．47％，结果明显优于分批发酵。     

L-异亮氨酸补料分批发酵的研究

研究了不同初糖浓度、葡萄糖及氮的补加方式在L-异亮氨酸发酵过程中对其产酸率、转化率等参数的影响,确定了L-异亮氨酸补料分批发酵的最佳条件,在最佳补料分批发酵条件下,L-异亮氨酸产量达21．96g／L,糖酸转化率达15．34％．     

猪IFNα在毕赤酵母中分泌表达条件的优化及高密度发酵

从发酵时间、接种量、pH值、诱导剂量等方面对重组基因工程（毕赤酵母甲醇利用缓慢型）的摇瓶发酵条件进行了优化，进一步探索了酵母菌表达猪IFNα的发酵工艺，包括种细胞密度对初始发酵期的影响，补加甘油、甲醇速率条件的控制等．结果表明，摇瓶发酵时，诱导最佳时间为96h，甲醇最适浓度为8g/L，发酵pH范围为6.4～9．0．最适接种量2：1．在分批发酵、接种量为10%且种子细胞光密度（OD600）为5～6时，最有利于细胞的高密度培养，在补料发酵时，根据溶氧控制甘油流加速率与时机，细胞干重达到118．75g／L，在48h重组猪IFNα表达量达到1。304g／L．     

乙醇补料对法夫酵母发酵产虾青素的促进效果

将法夫酵母(Phaffia rhodozyma)JMU-MVP14菌株在7 L发酵罐中进行培养,考察在不同葡萄糖质量浓度条件下,补加乙醇对法夫酵母JMU-MVP14菌株的生长和虾青素合成的影响。结果表明:低糖质量浓度下(20 g/L),恒定乙醇浓度发酵明显提高虾青素产量和细胞产率,与分批发酵相比,虾青素产量和细胞产率分别提高了27%和40%,分别达到102.8 mg/L和5.9 mg/g;中糖质量浓度下(30 g/L),恒定乙醇浓度发酵,得到较高的虾青素产量为118.4 mg/L,与分批发酵相比提高了34%;高糖质量浓度下(60 g/L),发酵得到较高虾青素产量为280.6 mg/L,是低糖质量浓度培养下虾青素产量的3.5倍,恒定乙醇发酵与分批发酵相比,生物量和虾青素产量均有显著降低。     

氧化葡萄糖酸杆菌驯化选育及其产二羟丙酮

通过梯度增加种子培养基中甘油浓度驯化氧化葡萄糖酸杆菌（Cluconobater oxydans）,有效地提高了该菌对甘油的耐受性,菌株产二羟丙酮水平比驯化前提高了29%,在此基础上,采用单因素试验,对其发酵工艺进行优化。考察甘油质量浓度、酵母膏质量浓度、CaCO₃质量浓度、接种量对发酵的影响,结果显示最佳工艺条件为:甘油质量浓度为60 g/L,酵母膏质量浓度为5 g/L,CaCO₃质量浓度为10 g/L,接种量4%,在此条件下,经72 h摇瓶发酵甘油转化率达96%,二羟丙酮产量可达57.4 g/L,7.5 L发酵罐分批发酵54 h时甘油转化率达97%,二羟丙酮产量可达58.2 g/L。     

L-缬氨酸补料分批发酵的研究

在批式发酵优化条件基础上，通过对流加补料方式、补料速度等发酵过程的各种参数，包括产酸率、转化率、发酵周期等的影响进行了研究，确定了L－缬氨酸补料分批发酵的优化条件。在最优补料分批发酵条件下，L－缬氨酸产量达52.45g/L，糖酸转化率达34.97%，结果明显优于分批培养。     

葡萄糖氧化酶发酵工艺的研究

本文通过摇瓶实验确定了自选青霉菌株Ｚ—Ｉ—Ｃ分批发酵生产葡萄糖氧化酶（ＧＯＤ）的适宜工艺条件，并在２．６立升台式发酵罐中进行了小试，监测了发酵过程中溶氧（ＤＯ）、ｐＨ、还原糖、菌体干重（ＤＣＷ）、氨基氮（ＮＨ２－Ｎ）和酶活等工艺参数的变化规律，为进一步提高ＧＯＤ的发酵产率提供了依据。     

基于关键酶表达的发酵调控与分子改造策略对E.coli产丁二酸的影响

考察E.coli JM001及其重组菌株E.coli JM002生物发酵生产丁二酸的性能。E.coli JM001在两阶段发酵产丁二酸过程中通过在有氧培养阶段添加乙酸钠,即可提高丁二酸的生产能力,厌氧阶段的丁二酸收率可达84%,但会有较多的副产物乙酸和丙酮酸积累。以E.coli JM001为出发菌株,敲除其磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)并导入来源于枯草芽孢杆菌的磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(PCK)基因,构建了重组菌株E.coli JM002,该重组菌株在两阶段发酵的有氧培养过程中不需添加乙酸钠,转厌氧后菌株也具有转化葡萄糖合成丁二酸的能力,丁二酸收率可达86%,副产物积累很少。     

重组人碱性成纤维细胞生长因子诱导Balb/c3T3细胞增殖的实验研究

目的研究不同浓度重组人碱性成纤维细胞因子对Balb/c 3T3细胞增殖活性的影响.方法重组质粒pGEX-bFGF转入到DH5α大肠杆菌体内,增菌培养表达bFGF,亲和层析纯化,制备8种不同药物浓度的bFGF,分别进行诱导Balb/c 3T3细胞增殖实验研究,MTT法检测各组细胞增殖活性.结果 bFGF诱导Balb/c 3T3细胞增殖存在浓度依赖性,最适浓度为4～16μg/L.结论 bFGF具有较好的诱导Balb/c 3T3细胞增殖的能力,为后续研究工作奠定实验基础.     

大肠杆菌中插入表达信号肽提高吡咯喹啉醌产量的研究

本文将载体pET-22b的信号肽基因pelb插入pET-28a-pqq的T7启动子和pqq基因之间,得到重组工程菌E.coli-BL21(pET-28a-pelb-pqq),发酵生产吡咯喹啉醌（PQQ）。结果表明PQQ最高产量可达40.73mg/L,比对照菌E.coli-BL21(pET-28a-pqq)提高了24.36%。此外,工程菌和对照菌前3h发酵的单位菌体产量及单位菌体产率均较高,且此后呈下降趋势。而E.coli-BL21(pET-28a-pelb-pqq)在21h后的PQQ产量及生物量均增加,推测PQQ产量与菌体生物量之间存在同促关系。     

人纤溶酶原Kringle5基因的克隆、表达及产物纯化和性质鉴定

根据人纤溶酶原的cDNA序列,利用PCR技术获得人纤溶酶原kringle5结构域的基因,并将其克隆至表达质粒pET25b( )中。重组载体pET25b（ ）/kringle5转化至大肠杆菌BL21（DE3）中,经IPTG诱导表达,在12kD处可见明显的表达条带,表达产物大部分以无活性的包涵体形式存在。包涵体经过体外变复性,SP-SepharoseFF离子交换柱一步纯化,15%SDS-PAGE鉴定考染一条带,纯度达95%以上。所得到的目标蛋白明显的抑制bFGF诱导的牛毛细血管内皮细胞增生。     

三种不同磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的克隆、表达及其对宿主菌生长的影响

应用PCR技术分别克隆了集胞藻6803、鲍曼不动杆菌和大肠杆菌的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）基因,构建重组大肠杆菌。SDS-PAGE凝胶电泳结果显示,来自集胞藻6803和大肠杆菌的PEPC实现了高效表达,而来自鲍曼不动杆菌的PEPC表达较弱,提示密码子偏好性的影响。前两菌提前进入对数生长期,来自鲍曼不动杆菌PEPC工程菌却延迟生长,但这3种重组菌发酵24h后的生物量与对照菌几乎相同。如果排除质粒复制造成的代谢负荷,过表达PEPC促进了宿主菌的生长,推测是因为重排了代谢流量。     

大肠杆菌内毒素对Vero细胞培养的作用研究

将精制大肠杆菌内毒素(E.COliEndotoxin)加入含血清细胞培养液(MEM)中,配制成浓度分别为50、100、200、500EU/mL的细胞培养液 用此培养液对Vero细胞进行培养,测定细胞生长曲线、细胞平均倍增时间、最大增殖浓度及台盼蓝拒染率等指标,研究大肠杆菌内毒素对非洲绿猴肾细胞(Vero)培养的影响 结果显示,内毒素含量为50EU/mL时,Vero细胞仍能正常生长 当内毒素含量逐渐升高,培养时间逐渐延长时,细胞的增殖速度及活率明显下降 这表明,内毒素对Vero细胞的生长及活性具有明显的抑制作用,且该作用具有一定的时间、剂量依赖性     

内皮细胞抑制素在毕节酵母中的表达与活性分析

采用PCR技术从人胎脑cDNA库中扩增了人内皮细胞抑制素基因。经DNA序列分析后将扩增的基因克隆至酵母载体pPICgK，获得的重组质粒pPIC9K-EDN转化毕节酵母GSll5，构建表达内皮细胞抑制素的酵母工程菌P.pastoris GSll5(pPIC9K-EDN)。SDS-PAGE分析结果显示：人内皮细胞抑制素在重组酵母GSll5(pPIC9K-EDN)中获得高效表达。用30L发酵罐构对建的工程菌进行高密度发酵，经甲醇诱导48h，生物量达到250OD，分泌量为150mg/L，发酵液经SP Streamline，SP Sepharose FF阳离子交换柱和SephamseHeparin Hi Trap柱纯化，产物纯度达到98％。纯化产物具有免疫活性并能抑制bFGF诱导的鸡胚绒毛尿囊膜血管生成。     

重组工程菌E.coli BL21(DE3)-pET29a-aiiA可溶性AiiA蛋白的发酵条件优化

通过对工程菌E.coli BL21(DE3)-pET29a-aiiA的摇瓶发酵培养条件进行优化,确定了AiiA蛋白可溶性表达的最佳发酵培养基为牛肉膏蛋白胨.目的蛋白可溶性表达的最佳诱导条件为:IPTG浓度0.6 mmol/L,诱导初始OD600为0.5,诱导时间为20 h,温度20℃,pH为7.0,微量元素Na2HPO420 mmol/L,250 mL三角瓶的装液量为70 mL.优化前可溶性AiiA蛋白的相对含量为2.23 mg/mL,占总目的蛋白的31.4%,优化后达到4.54 mg/mL,占总目的蛋白的60.3%,大大提高了目的蛋白的可溶性表达.     

大肠杆菌ATCase抗反馈抑制突变体的构建及其对胞苷积累的影响

为解决胞苷生物合成途径中天冬氨酸氨甲酰转移酶受胞苷三磷酸反馈抑制调节的问题,通过对其碱基序列和蛋白质结构分析,利用基因定点突变的方法构建了大肠杆菌的ATCase突变酶,得到三个突变体:M1(H20L)、M2(K60E)、M3(K94E),并在E.coli DH5α中对融合蛋白进行了表达.酶活测定表明,M1、M2、M3的ATCase酶相对活性都比野生型M0的高,分别为野生型M0的1.10、1.22和1.37倍,且比活力都有不同程度提高.与含野生型pyrBI基因的M0相比,含突变型基因的M1、M2和M3均对15,mmol/L的CTP具有强的抗反馈抑制作用,且M1、M2和M3的抗CTP反馈抑制作用分别是M0的5.4、6.0和8.5倍.最后将各突变质粒转入到E.coli Cyt10(Δcdd)中进行发酵培养,结果表明,与未含突变基因菌株相比,各含突变基因菌株的胞苷积累量均有不同程度的提高,说明ATCase定点突变使胞苷的合成积累途径得到了不同程度的强化.     

重组葡激酶的高效表达与纯化

通过发酵和纯化条件的研究,建立适合重组葡激酶工程菌的发酵和纯化工艺.对重组葡激酶工程菌发酵过程中的pH、饱和氧浓度、补料以及诱导时间进行考察,获得该工程菌的高效表达条件.在此条件下,重组葡激酶表达水平在50%以上,并以活性可溶性状态存在于细胞内;经渗滤,超滤浓缩、透析,DEAE-Sepharose FF层析和SP-Sepharose FF层析后,经SDS-PAGE和HPLC分析,纯度达到99%.在还原条件下进行SDS-PAGE分析,测得该酶相对分子质量为15.5kD,等电聚焦显示其等电点为8.4.