融合胸腺素α1的猪干扰素α在毕赤酵母中的表达及效价测定

猪干扰素α(IFN-α)是在特定条件下由细胞产生的一种具有广谱、高效抗病毒活性的可溶性糖蛋白,胸腺素α1(Tα1)是一种具有免疫调节的活性肽.本研究中将Tα1基因与去掉信号肽序列的猪IFN-αN端融合,构建酵母表达载体PHBM-Tα1-IFNα,同时构建单独表达IFNα的重组质粒PHBM-IFNα,重组质粒电转化至毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株,甲醛诱导表达.利用SDS-PAGE法检测融合蛋白的表达,并用细胞病变抑制法测定干扰素的效价.实验结果表明,酵母表达上清中IFNα的效价为2.916×10~6U/m L;Tα1-IFNα的效价为2.860×10~7U/m L,该结果证实胸腺素α1可提高融合表达蛋白猪干扰素的活性,因此,通过酵母表达体系获得高活性胸腺素-猪干扰素融合蛋白,可为高效、低成本获得抗病毒药物提供一种新的模式.     

免疫组化方法研究胸腺素α1在小鼠肉瘤S180细胞中的表达

探讨了胸腺素α1在小鼠S180肉瘤中的表达及其临床意义．以小鼠肉瘤S180组织和正常小鼠组织为材料，福马林固定和石蜡包埋．运用兔抗胸腺素α1多克隆抗体，按常规免疫组织化学方法检测接种在小鼠皮下的小鼠肉瘤组织以及正常小鼠皮下肌肉组织细胞中胸腺素α1的表达状况．研究结果发现胸腺素α1定位表达在小鼠肉瘤组织细胞的胞浆和细胞核中。免疫组化呈现强阳性．而正常组织细胞内基本无显色，呈阴性．试验结果表明：胸腺素α1在恶性肿瘤细胞小鼠肉瘤组织细胞中高表达．而正常小鼠组织则低表达或不表达．细胞内胸腺素α1蛋白的高表达与肿瘤具有明显相关性，该研究成果可能使胸腺素α1作为一个新的和有价值的肿瘤标记物在临床诊断中得到应用，也为进一步探索胸腺素α1与肿瘤之间相互关系的分子机理研究奠定基础，并通过抑制胸腺素α1这条途径达到控制肿瘤生长的效果．     

大肠杆菌中融合表达汉滩病毒S,M基因片段的研究

为在大肠杆菌中融合表达汉滩病毒囊膜糖蛋白G1与NP含主要抗原位点的片段 .将汉滩病毒 76 118株S基因编码区 5′端约 0 .7kb的片段与M基因编码G1的片段连接 ,克隆入 pGEX 4T2 ,构建嵌合基因原核表达载体 pGEX 4T2 S 0 .7G1,在大肠杆菌XL1 Blue中诱导GST S0 .7G1融合蛋白的表达 .表达产物用ELISA和Westernblot进行鉴定 .限制性内切酶酶切鉴定证明 ,成功构建了嵌合原核表达载体 pGEX 4T2 S0 .7G1.经IPTG诱导后 ,ELISA活性测定结果表明 ,该融合蛋白可与抗汉坦病毒NPmAb特异性结合 .Westernblot结果显示 ,诱导出相对分子质量 (Mr)大于 1× 10 5的S0 .7G1与GST的融合蛋白 ,并有一系列大小不等的可与抗汉坦病毒NPmAb特异性结合的蛋白带 .获得具有特异性结合活性的融合蛋白GST S0 .7G1,为汉滩病毒基因工程疫苗的研制奠定了基础     

汉滩病毒M,S基因不同拼接方式原核表达效果比较研究

为了比较汉滩病毒囊膜糖蛋白G1与核蛋白(NP)主要抗原位点片段不同拼接方式的原核表达效果，将汉滩病毒76—118株M基因编码G1的片段与S基因编码区5’端约O．7kb的片段连接，克隆入pGEX一4T2，构建嵌合基因原核表达栽体pGEX-4T2-G1S0．7，pGEX-4T2-S0．7G1，在大肠杆菌XLl一Blue中诱导表达GST—G1S0．7或GST—S0．7G1融合蛋白。经IPTG诱导后，ELISA活性测定结果表明，两种融合蛋白均可与抗汉坦病毒NP的mAb特异性结合，融合蛋白GST—G1S0．7还可与抗汉滩病毒糖蛋白的mAb特异性结合。Western blot结果显示，诱导出G1S0．7或S0．7G1与GST的融合蛋白，其中G1S0．7嵌合基因的表达产物降解较少。研究证明：两种拼接方式的嵌合基因均可在大肠杆菌中表达出有生物学活性的融合蛋白，但表达效果不同，为汉滩病毒基因工程疫苗的研究奠定了基础。     

胸腺素α原基因的克隆及在大肠杆菌中的融合表达

胸腺素α原(ProTα)作为一种免疫增强剂,对各种免疫缺陷疾病、病毒感染以及肿瘤都具有一定的作用.此外ProTα可以作为核蛋白参与细胞增殖,在肿瘤的预测、诊断及治疗中有一定应用.根据人胸腺素α原已发表的核苷酸序列,设计了一对特异性引物(P1/P2),应用RT-PCR法从中国人外周血中克隆到ProTα基因,将扩增产物连接到pMD18-T载体中并转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性重组质粒进行序列测定;同时用EcoRI和BamHI双酶切PCR产物,将该基因片断插入经同样双酶切的质粒pGEX 6P-1中,转化大肠杆菌BL21中进行表达.结果表明,克隆到的ProTα基因与参考的氨基酸同源性为99.70%;原核表达产物经过SDS-PAGE电泳分析,融合蛋白分子量为37 ku,主要以可溶形式存在.     

P15INK4b对人黑色素瘤细胞周期及G1期相关调控基因的影响

人黑色素瘤细胞A375是P15INK4b缺失细胞系,通过细胞转染技术将外源P15INK4bcDNA转染A375细胞,经PCR和Western blot检测,证明构建了P15INK4b稳定表达细胞模型MLIK6.流式细胞光度术结果显示,与对照组MLC2相比,MLIK6细胞G1期升高11%,S期下降14%.利用TdR-N2O同步法所得同步的MLIK6和MLC2的M期细胞比例分别达到89.1%和76.8%,而G1期的比例分别为74.3%和76.4%.3H-TdR掺入的结果显示,MLIK6从G1期进入S期的时间比MLC2延长2 h,并且掺入强度明显减弱.进一步探讨P15INK4b对G1/S相关调控基因的影响,发现G1期的MLIK6细胞在诱导P27表达升高的同时,cyclinD1,CdK4,cyclinE和c-myc的蛋白水平均降低,其中cyclinD1的抑制在晚G1期附近最显著,而对cyclinE的抑制则在G1/S转换处表现突出,癌基因c-myc表达受到明显抑制并贯穿于G1→S全部时间进程中.说明P15INK4b是通过对G1期不同阶段细胞周期引擎分子cyclinD1,CdK4,cyclinE和癌基因c-myc的抑制及增加CKI P27延缓了G1/S进程.     

人类T型钙通道α1G和α1H亚单位基因在细胞增殖中的功能

已经发现T型钙通道的表达与细胞增殖关系密切,然而T型钙通道的表达是细胞增殖的原因还是结果有待进一步研究.利用过量表达人类T型钙通道α1G和α1H亚单位基因(CACNA1G和CACNA1H)的HEK-293细胞研究了这两种基因在细胞增殖中的直接作用.通过RT-PCR和标准全细胞膜片钳记录分别从mRNA转录水平和T型钙通道蛋白功能水平验证了α1G和α1H亚单位基因的过量表达;从生长曲线分析得到了细胞群体倍增时间,HEKα1G 细胞为(13.7±0.3)h,HEKα1H 细胞为(14.0±0.4)h,都短于对照HEK-293细胞的(22.1±1.1)h.流式细胞分析结果表明,在稳定转染细胞处于S期的细胞百分率比对照HEK-293细胞高,相反地处于G1期的百分率比对照HEK-293细胞低.结果表明,T型钙通道α1G和α1H亚单位基因的过量表达都能显著促进细胞增殖,这一作用可以被T型钙通道特异性阻断剂mibefradil抑制.Western杂交结果提示了T型钙通道的过量表达是通过提高与细胞周期有关的蛋白质(CDK2,cyclin A和cyclin E)的表达水平刺激了细胞周期的进程从而促进细胞增殖.     

行数为2的变换图的若干性质

著名的图论专家Brualdi于1980年提出了关于变换图 G ( R，S ) 直径的Brualdi猜想，但至 今仍悬而未决。本文定义行数为 2 的变换图 G ( R，S ) 为 G ( R * ，S * ) ，其顶点数为 ( ) n r ，边数为 r ( ) n - r 2 ( ) n r ，当 r ≤ n 2 时， G ( R * ，S * ) 是二部图，当且仅当 n = 2 ； G ( R * ，S * ) 是完全图，当且仅当 r = 1 。 根据变换图的性质，结合 G ( R * ，S * ) 的最大团结构，对变换图 G ( 1，4 ) 、 G ( 2，4 ) 、 G ( 2，5 ) 和 G ( 2，6 ) 进行 了作图。     

旗传递4-(v,k,6)设计与Sz(q)群

设S=(P,B)是一个非平凡的4-(q~2+1,k,6)设计,其中q=2~(2n+1)且为整数。如果G≤Aut(S)在S上区传递且Soc(G)同构于李型单群Sz(q)群,则G在S不是旗传递的。     

关于Erdoes—Ginzburg—Ziv定理的一个注记

设G为n阶加法Abel群，S＝{αi}i=1^2n-1是G中元序列，对α∈G用r(S,α）表示α写成S中n项之和的方法数。1961年Erdoes，Ginzburg与Ziv证明了n为素数时r(S,0)≥1。1996年高维东指出n是素数p时r(S,0)≡1(mod p)。证明了下述结果：假定有特征为素数p的域使G为其加法子群，则r(S,0)≡1(mod p)，且对α∈G/{0}有r(S,α）≡0(mod p)。这推广了高维东的工作。     

可解完全线性群的阶

证明了可解群阶的定理:令V≠0是有限拟本原G 模,|V|=qn,素数q>0,G为完全线性群GL(V)的一可解完全可约子群,则a)|G|≤|V|α/λ,b)若2 |G|,且q≠2,则|G|≤|V|3/2/241/3。除非qn=23、26、28、29、32、34或54,或者G≌(Γ(22)wrZ2)F、Γ(24)F或(S3wrZ2)F,F是25阶超特殊群。常数4α=6(3)1/2,即1.68<α<1.69,且常数λ=31/2。     

汉滩病毒S基因0.7kb片段与M基因G2片段不同拼接方式嵌合基因原核表达产物的初步比较

比较汉滩病毒S、M基因部分片段的嵌合基因不同拼接方式表达产物的活性。构建了嵌合基因原核表达载体pGEX-4T-1-S0.7G2,并与已构建的pGEX-4T-1-G2S0.7的诱导表达产物进行了比较。结果表明,融合蛋白同时保持亲本蛋白的结合活性,且前者表达产物的结合活性始终比后者低。研究表明,嵌合基因的不同拼接方式对融合蛋白的活性可能有一定的影响。     

图Kr,s-E（rK2）的（模,整）和数

令N(Z)表示正整数(整数)集,N(Z)的非空有限子集S的和图G (S)是图(S,E),其中uv∈E当且仅当u v∈S;一个图G称为(整)和图,若它同构于某个SN(Z)的和图,(整)和数σ(G)(ζ(G))是使得G∪nK1是(整)和图的非负整数n的最小值。模和图是取SZm\{0}且所有算术运算均取模m(≥│S│ 1)的和图。一个图G的模和数ρ(G)是使得G∪ρK1是模和图的孤立点数ρ的最小值。对图Kr,s-E(rK2)(s>r≥4且s≥6)。研究了它的(模,整)和数,文中确定了图K4,5-E(4K2)的(模,整)和数。     

三角化图的团划分数

在本文,我们证明了下述结果:(1)如果G=(V,E)是72个顶点的三角化图,则K(G)=α(G)≤cc(G)≤cp(G),cc(G)≤n-1,其中图G顶点独立数为α(G),它可在O(|V|+|E|)时间内求出;(2)如果G=(V,E)是n个顶点的特殊三角化图,V=S∪K,具有度序列为n-1≥d_1≥d_2≥…≥d_n,若对于S中任意顶点对x_i,x_j有|Adj(x_i)∩Adj(x_i)|≤1,则α(G)≤cp(G)≤α(G)+δ,其中,m=w(G)是图G的最大团的顶点个数。     

利用植物生物反应器表达胸腺素α1的研究

胸腺素α1是胸腺肽中活性最高的组分,可以提高人体免疫力,通过组织提取或人工合成存在安全隐患和价格昂贵等问题.拟用植物生物反应器,转基因模式植物烟草表达胸腺素仅α1.通过已构建的植物双元载体p35S-2300-twin T-DNAs::Ta4::noster用农杆菌介导法转化烟草,在卡那霉素筛选压为50 mg/L时获得抗性烟草165株,经PCB和Southern blot分析证实,获得了17株独立转基因苗,阳性率10.30%,外源基因拷贝数为1-7个.还对利用含"twin T-DNA"植物双元表达载体转化烟草T0代的Tα4和nptII分别整合现象以及植物生物反应器生产胸腺素的前景进行了讨论.     

Toader型平均的调和、几何、形心和反调和平均界

通过研究Toader型平均T(A,G)与调和平均H(或几何平均G)和形心平均E(或反调和平均C)凸组合的序关系,发现了最佳参数α_1,α_2,α_3,α_4,β_1,β_2,β_3,β_4∈(0,1),使得双向不等式α_1E(a,b)+(1-α_1)G(a,b)T[A(a,b),G(a,b)]β_1E(a,b)+(1-β_1)G(a,b),α_2E(a,b)+(1-α_2)H(a,b)T[A(a,b),G(a,b)]β_2E(a,b)+(1-β_2)H(a,b),α_3C(a,b)+(1-α_3)G(a,b)T[A(a,b),G(a,b)]β_3C(a,b)+(1-β_3)G(a,b),α_4C(a,b)+(1-α_4)H(a,b)T[A(a,b),G(a,b)]β_4C(a,b)+(1-β_4)H(a,b)对所有a,b0且a≠b成立.作为应用,得到一个新的第二类完全椭圆积分的确界.     

抗胸腺素α1(Tα1)多克隆抗体的纯化及转基因藻中Tα1的检测

采用不同浓度的硫酸铵分级盐析纯化抗Tα1多克隆抗体,然后用不同量的牛血清白蛋白(BSA)与兔抗Tα1抗体进行中和,以去除血清中的抗BSA抗体,并利用纯化后的抗Tα1多克隆抗体检测转基因藻中Tα1.结果表明:采用25%(NH4)2SO4进行分离纯化,并将BSA加入到血清中进行中和,37℃处理30min,BSA的量与血清的比例以1μL血清 15μgBSA可达到中和血清中的抗BSA抗体的目的.获得的抗Tα1抗体效价与未进行分离前基本相同,并且阴性本底低.采用ELISA方法检测野生藻和转基因藻中的Tα1,转基因藻的Tα1OD450值比野生藻的高2.1倍以上,提示Tα1在转基因藻中成功表达.实验证明,此方法能有效纯化抗胸腺素α1多克隆抗体,获得特异性强的抗胸腺素Tα1抗体,并且效价不受影响.     

HproTα／hIL-2融合蛋白真核载体的构建及鉴定

利用基因重组技术构建了含信号肽的人源胸腺素α原和白介素2(proTα/IL-2)融合基因的真核表达载体pVAX-PI.用脂质体转染试剂转染COS-7细胞,转染后24、48、72、96 h采用ELISA法检测细胞培养上清中IL-2的表达情况,分别用CTLL-2依赖细胞株/MTT法和脾细胞增殖实验测定融合蛋白IL-2和proTα活性,采用ECL western blotting分析和鉴定目的蛋白的相对分子质量大小.结果表明,转染上清在31 kDa处有特异性阳性反应条带,质粒在转染COS-7细胞后不同时间均可进行分泌表达,且于转染后48 h目的蛋白的表达量达峰值.细胞转染上清中的IL-2活性可达58 IU/mL,proTa具有促进小鼠脾脏细胞增殖的作用,可作为基因治疗药物的开发之用.     

绵羊特异新基因OaN2片段的克隆及融合表达

为制备绵羊MHC区段1个新基因(OaN2)的特异性抗体及其表达模式和功能研究奠定基础,克隆OaN2的1个特殊片段(OaN2F,Genbank登录号:GQ244478)并做融合表达。以反转录得到的中国美利奴细毛羊的第一链cDNA为模板进行PCR扩增,并利用扩增产物构建重组质粒,转化感受态大肠杆菌DH5α后诱导表达得到OaN2F和GST(谷胱甘肽S转移酶)的融合蛋白GST-OaN2F,将其纯化后鉴定。结果表明,成功克隆到了OaN2F(111bp)片段,并得到了纯化的30kD的GST-OaN2F融合蛋白。     

全自动快速电泳分析系统检测100例健康人血清蛋白组分参考值

用Helena全自动电泳分析系统 (REP)对 10 0份健康人血清标本进行电泳分析 ,经电泳可将血清蛋白分为白蛋白 (Alb)、α1球蛋白、α2 球蛋白、β球蛋白、γ球蛋白 5个组分 ,将各组数据用医学评价系统进行统计学处理 ,计量资料以 x±s表示 ,结果表明 :电泳法所得各组分百分比值及A/G值的参考范围分别为 :Alb(5 9.0 8± 7.4 4 ) % ,α1球蛋白 (3.14± 1.0 8) % ,α2 球蛋白 (8.4 9± 4 .0 6 ) % ,β球蛋白 (9.79± 3.9) % ,γ球蛋白 (19.5 1± 6 .98) % ,A/G值 1.4 7± 0 .4 2 ;化学法所得A/G值的参考范围为 2 .0 2± 0 .6 8.对各组测定值进行统计学处理 ,α1球蛋白、α2 球蛋白、β球蛋白和A/G值的参考范围均属正态分布 ,而Alb、γ球蛋白的参考范围不属正态分布 ;各样本电泳法A/G值与化学法A/G值经t检验呈非相关显著正相关 ,r=0 .76 83(P <0 .0 0 0 1)