番茄真核翻译起始因子4E基因RNA干涉及其抗病毒特性研究

植物真核翻译起始因子4E（eIF4E）在蛋白质翻译过程中发挥重要作用．最近研究表明eIF4E在参与植物病毒互作,影响病毒在寄主中复制和侵染过程．文中通过RNA干涉调控番茄eIF4E表达,鉴定eIF4E在植物病毒互作中的作用．根据数据库假设性一致序列（TC171564,TC170275）分别克隆了番茄“中蔬五号”SleIF4E基因及其异构体基因SleIF（iso）4E．构建了SleIF4ERNAi抑制表达载体pSL4D,通过农杆菌介导的方法导入番茄品种“中蔬五号”基因组．PCR检测和Southern blot结果表明,目标基因已整合到番茄基因组中．通过半定量RT-PCR对转基因番茄进行eIF4E表达分析,表明pSL4D转化番茄中eIF4E得到不同程度抑制．转基因植株分别接种PVY和CMV两种病毒,病毒ELISA测定和病毒RNA积累量分析表明,pSL4D转化植株相对于对照组均获得不同程度的病毒抗性,番茄eIF4E参与PVY的复制或侵染寄主过程．就不同病毒而言,RNAi对PVY抗性的调控效果比CMV调控效果好,抑制PIF4E表达可提高植物对PVY的抗性．     

小鼠Sirt3基因过表达慢病毒载体的构建及其表达鉴定

构建小鼠Sirt3基因过表达慢病毒载体,检测人神经母细胞瘤细胞(SK-N-SH细胞)感染Sirt3基因过表达慢病毒后Sirt3 mRNA和蛋白的表达,为在细胞和动物水平研究Sirt3的作用提供新的途径和工具。利用Genebank检索的小鼠Sirt3基因序列,人工合成法合成小鼠Sirt3基因的c DNA片段,将其克隆至慢病毒载体p CDH-CMV-MCS-EF1-cop GFP中,构建慢病毒表达质粒。进行酶切及测序验证后,将慢病毒表达质粒连同辅助包装原件载体质粒共同转染入293T细胞,收集上清,测定病毒滴度。用Sirt3基因过表达慢病毒感染SK-N-SH细胞,即为Sirt3过表达组(Sirt3);用空载体慢病毒感染的SK-N-SH细胞为空载体组(GFP);未感染病毒的SK-N-SH细胞为对照组(CON)。收集细胞后,用Real-time PCR法检测各组细胞Sirt3 mRNA的水平;用Western blotting法检测各组细胞Sirt3蛋白的表达。Sirt3基因过表达慢病毒载体构建成功,病毒滴度为1.0×10~9TU/m L。Sirt3组SK-N-SH细胞的Sirt3 mRNA和Sirt3蛋白水平均显著高于GFP组和CON组(P0.01)。成功构建的Sirt3基因过表达慢病毒载体具备高效感染力,能在SK-N-SH细胞高效过表达Sirt3,本研究结果为今后进一步在神经细胞和模型动物中研究Sirt3的作用提供了新的途径和工具。     

IL-2与猪瘟病毒E_2基因真核双表达载体的构建及其免疫增强作用的研究

应用DNA重组技术构建了猪瘟病毒E2 基因与IL 2基因的双表达真核表达载体 ,观察其表达水平 ,并对其免疫增强效果进行了观察。结果是构建了猪瘟病毒E2 基因与白细胞介素 2的真核表达质粒pIRSTIL 2。将质粒转染BHK 2 1细胞 ,可在体外表达E2 和有生物活性IL 2。pIRSTIL 2质粒能诱导产生CSFV的特异性免疫反应。pIRSTIL 2所诱导的免疫应答反应比使用单表达质粒pIRST强。实验表明 :IL 2与猪瘟病毒E2 基因构建的双表达基因疫苗能有效提高基因疫苗的免疫效果     

犬瘟热病毒N蛋白抗原表位基因的合成和杆状病毒表达载体的构建

目的串联合成犬瘟热病毒N蛋白抗原表位基因,并构建其杆状病毒表达载体。方法利用生物信息学软件,预测N蛋白的抗原表位,串联合成这些抗原表位。利用定向克隆的方法,将该基因片段连接到杆状病毒表达载体pFastBac-Hta。结果获得了包含犬瘟热病毒N蛋白抗原表位的基因,并成功构建pFastBac-N合成表达载体。结论该实验为犬瘟热病毒N蛋白抗原表位基因在杆状病毒内的表达奠定了基础。     

汉滩病毒囊膜糖蛋白g2基因重组腺病毒的构建与表达

获得汉滩病毒G2 基因 ,构建其重组腺病毒并在HEK2 93细胞中包装表达 ,为研究汉滩病毒基因疫苗提供了实验基础。设计引物采用PCR从含汉滩病毒 \|76 1 1 8株M基因的M5 6质粒扩增出糖蛋白G2 基因片段 ,并将其克隆入腺病毒载体Adeno XviralDNA ,筛选获得重组腺病毒DNA ,转染HEK2 93细胞 ,包装、扩增后得到汉滩病毒G2 基因重组腺病毒原种 ;并在感染细胞内初步表达 ,用ELISA检测表达产物。得到了含汉滩病毒G2 基因的重组腺病毒 ,其滴度约为 1 0 10 pfu/mL ,同时在感染的HEK2 93细胞中检测到汉滩病毒糖蛋白G2 的表达。含汉滩病毒糖蛋白G2 基因重组腺病毒的成功构建 ,为研究汉滩病毒基因疫苗提供了实验基础     

IL—2与猪瘟病毒E2基因真核双表达载体的构建及其免疫增强作用的研究

应用DNA重组技术构建了猪瘟病毒E2基因与IL－2基因的双表达真核表达载体,观察其表达水平,并对其免疫增强效果进行了观察,结果是构建了猪瘟病毒E2基因与白细胞介素－2的真核表达质粒pIRST IL-2。将质粒转染BHK－21细胞,可在体外表达E2和有生物活性IL－2,pIRST IL-2质粒能诱导产生CSFV的特性免疫反应,pIRST IL-2所诱导的免疫应答反应比使用单表达质粒pIRST强,实验表明,IL－2与猪瘟病毒E2基因构建的双表达基因疫苗能有效提高基因疫苗的免疫效果。     

信息集束

本市中学生参加2004世界工程师大会11月2～6日在上海举办的世界工程师大会是由世界工程组织联合会确定的首届大会,也是在我国召开的规格最高、规模最大的工程技术界的国际盛会,被誉为“工程界的奥林匹克”。本市2名中学生参加了世界工程师大会。本届大会特别设置“未来工程界联     

慢病毒介导的外源基因在人牙髓干细胞中的表达

牙髓干细胞（dental pulp stem cells,hDPSC）是牙源性的间充质干细胞,具有多向分化潜能.已有的研究表明,一些蛋白因子能够诱导牙髓干细胞的牙向分化,但尚无通过过量表达某些关键基因来诱导牙髓干细胞牙向分化的报道.利用绿色荧光蛋白作为报告基因,探究慢病毒介导的外源基因在牙髓干细胞中的表达,分离并鉴定人的恒牙牙髓干细胞,用携带绿色荧光蛋白标记的慢病毒原液感染DPSC,感染病毒后的DPSC进行传代以验证外源基因的稳定表达,并将感染慢病毒后的DPSC与羟基磷灰石/磷酸三钙（hydroxyapatite/tricalcium phosphate,HA/TCP）混合移植到小鼠肾囊膜下培养8周.结果表明：用绿色荧光蛋白标记的慢病毒能够整合到牙髓干细胞的基因组中并获得稳定的表达,感染慢病毒前后的牙髓干细胞增殖率没有发生改变,感染病毒的hDPSC与HA/TCP混合移植到肾囊膜下仍能够产生牙本质牙髓样结构,因此利用慢病毒载体介导的绿色荧光蛋白并不影响牙髓干细胞的生物学特性,说明在进一步利用慢病毒载体研究过量表达基因在牙髓干细胞牙向分化的作用中,绿色荧光蛋白可以作为标记蛋白.     

鸡染色质绝缘子HS4的不同区域对杆状病毒表达egfp基因的影响

染色质绝缘子是一种具有保护目的基因免受周围基因调控影响,保证基因稳定表达的DNA元件.前期的研究表明,当鸡染色质绝缘子HS4被置于目的基因表达框下游时,可以显著提高杆状病毒介导的基因的表达水平.为了进一步认识HS4作用的机制,构建了携带HS4绝缘子不同区域的6种重组病毒,比较了它们对报告基因egfp表达的影响.结果发现,相比对照病毒,插入HS4全长片段的重组病毒vBG-HS4-1200,以及同时插入250bp核心区域和400bp连接片段的重组病毒vBG-HS4-650在感染Sf9细胞后报告基因egfp的表达水平明显提高.这个结果与前人在哺乳细胞表达系统中所得出的结果基本相符,从而进一步证实HS4在裂解型病毒中同样可以通过表观遗传学修饰调控基因的表达.     

Npas4基因过表达慢病毒的构建及其在SK-N-SH细胞的表达

研究旨在构建Npas4基因过表达慢病毒,为进一步深入探索Npas4基因的功能奠定基础。用人工合成大鼠Npas4基因c DNA片段,将其插入p CDH-CMV-MCS-EF1-cop GFP构建慢病毒表达质粒p CDH-Npas4。酶切、测序验证质粒后,将p CDHNpas4和辅助质粒共转染包装细胞293T,浓缩上清得病毒颗粒并测定病毒滴度。取病毒颗粒感染SK-N-SH细胞48 h,收集细胞采用Western blotting法检测Npas4蛋白的表达。p CDH-Npas4携载正确Npas4基因,将其包装293T细胞后能产生病毒。病毒滴度为1.05×109TU/m L。相比于转染GFP病毒对照组(GFP)和未转染对照组(control),Npas4重组慢病毒组(Npas4)的细胞Npas4蛋白表达显著增高。成功构建Npas4基因过表达的重组慢病毒载体p CDH-Npas4,并获得高效的重组慢病毒,能将外源Npas4基因导入SK-N-SH细胞,为进一步研究Npas4基因的相关功能奠定了基础。     

乙型肝炎病毒聚合酶基因在重组腺病毒系统中的表达

乙型肝炎病毒是一种重要的人类病原,乙肝病毒聚合酶在病毒的复制中具有关键作用．拼接了HBV56的聚合酶全长基因,利用重组腺病毒系统,在HEK293细胞中表达乙肝病毒聚合酶．通过一种半定量PCR方法,检测到所表达的蛋白具有逆转录酶活性．这一研究对深入认识该酶结构与功能的关系,研制抑制病毒复制的药物,有一定的意义．     

斜纹夜蛾核多角体病毒感染甜菜夜蛾细胞的研究

 研究发现斜纹夜蛾核多角体病毒（Spodoptera litura nucleopolyhedrovirus,SpltNPV）不能成功感染同属甜菜夜蛾（S. exigua,Se）昆虫,为深入研究SpltNPV在离体Se301细胞中的感染进程以及病毒感染失败的原因,对感染后Se301细胞进行DNA复制、病毒基因转录以及病毒蛋白表达等检测。结果显示被感染的Se301细胞中病毒完成了DNA的复制和病毒早、晚期基因转录,但检测不到极晚期基因多角体基因（polyhedrin）的表达,病毒的蛋白表达受阻从而影响了病毒完成复制周期。 研究发现病毒蛋白表达受阻是SpltNPV在Se301细胞中无法形成子代病毒,完成整个病毒复制的主要原因,这为深入研究其感染失败机理奠定了坚实基础。     

含PGK启动子慢病毒表达质粒的构建与鉴定

为了构建一个含有人源PGK1(human phosphoglycerate kinase 1)启动子的慢病毒表达载体 pL-PGK-GFP.采用PCR从人组织中扩增PGK1基因的启动子部分,再用酶切-连接的方法将扩增的启动子区片段亚克隆入慢病毒表达质粒pL-EGFP中,再用测序、酶切和瞬时表达的方法进行鉴定.结果是下游的eGFP基因在PGK1启动子驱动下,在293FT细胞中表达绿色荧光蛋白报告基因,这表明成功构建了慢病毒表达质粒pL-PGK-GFP.扩增的537bp PGK1启动子片段具有一定的启动效率,能在HIV来源的慢病毒载体中驱动下游目的基因的表达.     

《浙江省公路科技情报网》建立

在华主席抓纲治国战略决策的指引下,在中共中央关于召开全国科学大会通知的强劲东风鼓舞下,遵照毛主席“组织起来”“互通情报”的教导,省交通局于十月十六日至二十日在金华召开了浙江省公路科技情报网成立大会。参加大会的有全省公路交通系统,上海同济大学和南京工学院应邀参加会议。大会传达学习了华主席、邓副主席关于科技工作的重要指示,代表们受到了极大的鼓     

基于青藤碱的抗风湿性关节炎分子构建的研究进展

利用PCR技术扩增出BmDNV-1结构蛋白vp4基因,并将该基因与原核表达载体pMALc2X进行连接,转化大肠杆菌DH10B.获得重组质粒经IPTG诱导表达得到大小为96 000的融合蛋白,融合蛋白经Amylose柱纯化,使用其免疫新西兰大白兔,制备出多克隆抗体.从而为进一步研究该病毒结构蛋白基因的转录和翻译机制提供可靠的工具.     

人类新基因的研究

余龙教授课题组应用基于“蛋白质的四种方式进化”的假设而设计的“四级同源筛选法” ,分离和克隆到人类新基因 2 5 3条 ,已全部在ＧｅｎＢａｎｋ登录 ,其中 90条有潜在开发应用价值的基因 ,已申报了中国发明专利 ,从中选出 6条有直接开发应用价值的基因 ,申报了国际ＰＣＴ发明专利 .所克隆基因中 ,有 5 1个基因的组织表达谱 ,基因组结构 ,染色体定位等特征得到阐明 .相关论文已分别在Ｇｅｎｏｍｉｃｓ,ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＪｏｕｒｎａｌ,Ｇｅｎｅ等国际刊物上发表人类新基因的研究$遗传工程国家重点实验室…     

利用昆虫病毒系统生产表达胰岛素的腺相关病毒

腺相关病毒(Adeno-associated virus-2,AAV-2)用于构建基因治疗病毒载体,在基因治疗领域受到了普遍重视和关注,而rAAV在应用过程中一个很重要的限制因素就是缺乏简单有效的大规模制备方法.运用昆虫细胞表达系统来提高AAV-2的产量,分别采用绿色荧光蛋白(GFP)和胰岛素(Insulin)基因替代AAV-2的结构基因后,与其他重组病毒共转染293t细胞,3 d后即可检测到高效表达的GFP和Insulin.结果表明,该方法能够比较理想地提高AAV的产量,为临床使用奠定了基础.     

靶向survivin基因的shRNA慢病毒载体的构建及其对膀胱癌EJ细胞凋亡的影响

目的:构建survivin基因特异性shRNA慢病毒干扰载体,转染膀胱癌EJ细胞,研究survivin基因在膀胱癌细胞株中的表达抑制情况,观察survivin shRNA慢病毒载体对EJ细胞凋亡的影响.方法:以survivin基因为靶标设计shRNA干扰序列,克隆至p SIH1-H1-cop GFP慢病毒载体.干扰载体鉴定正确后转染膀胱癌细胞株EJ细胞,荧光显微镜下观察GFP表达情况,实时荧光定量PCR检测survivin基因mRNA含量变化,Western blotting法检测survivin蛋白表达,Annexin V-FITC/PI双染法检测EJ细胞凋亡情况.结果:PCR扩增鉴定、DNA测序证实survivin慢病毒干扰载体构建成功;EJ细胞经干扰载体处理后,EJ细胞survivin基因mRNA水平下调了73.33%,蛋白表达受到显著抑制,EJ细胞凋亡率达到24.39%.结论:成功构建了靶向survivin基因的shRNA重组慢病毒干扰载体,可以显著降低转染细胞survivin基因的表达水平,并有效提高膀胱癌细胞凋亡率.     

丙型肝炎病毒NS3基因真核质粒的构建及其在人肝细胞中的诱导表达

目的：进行丙型肝炎病毒非结构蛋白3基因真核表达载体的构建,并分析其在体外培养的人肝细胞中的表达。方法：从含有丙肝病毒全长基因的重组质粒pBRTM／HCV1-3011表达载体中PCR扩增出HCVNS3基因片段,将其与表达载体pcDNA3．1（-）重组,得到重组的真核表达载体pcDNA3．1（-）／NS3。然后采用阳离子多聚体将其转染人肝细胞QSG7701,以免疫组织化学SP法及Western Blotting检测HCVNS3蛋白的表达。结果：所得到的NS3片段正确,序列正确,所构建的真核质粒成功转染QSG7701细胞并表达蛋白,表达的NS3蛋白相对分子质量为70000。结论：成功构建了丙型肝炎病毒非结构蛋白3基因的真核表达载体pcDNA3．1（-）／NS3,并且该载体在体外培养的人肝细胞中能有效表达特异性HCVNS3蛋白。     

国际新闻

长期压力会引发基因变化，巴西从海藻中分离出抗艾滋病病毒物质,研究揭示端粒酶关键部位三维结构,学习热情与大脑“线条体”相关,日发现可导致疲劳的蛋白质.