小鼠胚胎一步冷冻法

本文描述了冷冻小鼠胚胎直接投入液氮的简单一步法。这项研究的主要目的是评价小鼠胚胎在下列不同浓度的甘油和蔗糖混合液中预脱水后冷冻胚胎解冻后的活力。同时研究了脱水前甘油的预处理及胚胎阶段的不同效果。当蔗糖浓度保持恒定(0.25M),甘油浓度变化范围为1.0～4.0M时,以甘油浓度2.0M冷冻胚胎解冻后活力最高(67％)。采用甘油预处理并不优于不预处理。当甘油浓度保持恒定(2.0M)。蔗糖浓度变化范围为0—1.0M时,发现在0.5M蔗糖中冷冻胚胎解冻后活力最佳(81％)。桑椹胚存活率优于囊胚(86％),VS72％)。与鲜胚移植54％的出生率相比较。胚胎冷冻最佳处理(2.0M甘油+0.5M蔗糖)解冻后移植出生率为41％。这项技术可实际应用于家畜胚胎的冷冻与解冻。     

冷冻保存小鼠胚胎简易方法的研究

小鼠胚胎在冷冻保护剂二甲亚砜(DMSO)存在下,冷冻到-196℃,解冻以后可以存活。在无胚胎冷冻机的条件下,我们用简易冷冻装置,将不同胚龄的鼠胚放入其中,经缓慢降温后保存于液氮内。冷冻胚胎快速解冻后,胚胎回收率达67—79%。选择解冻后正常胚胎进行体外培养,48—72小时后能进一步发育为其存活标准,冷冻后胚胎存活率为66.07%。此方法简便易行便于推广。     

绒山羊胚胎的体外培养,冷冻保存和移植的研究

采用体外培养和冷冻保存的方法将起排处理后的绒山羊２～８细胞期胚胎经体外在Ｍ１９９＋ＦＣＳ（对照组）、Ｍ１９９＋ＯＥＣ＋ＦＣＳ、Ｍ１９９＋ＯＥＣ＋ＥＮＧＳ和，Ｍ１９９＋ＯＥＣ＋ＮＳＳ的培养基中分别进行培养以后，选取发育为桑椹胚和早期囊胚期胚胎分别以１０％Ｇｌｙ、１０％ＥＧ为防冻剂和玻璃化方法进行冷冻保存，并将用常规和玻璃化法冷冻保存的胚胎解冻后进行移植．结果表明，体外培养胚胎的囊胚的发育率在四个培养处理组中分别为１２．５％、７０．６％、８１．８％和７３．９％，对照组与添加ＯＥＣ处理组之间具有极显著性差异（Ｐ＜０．０１），囊胚发育率在添加ＦＣＳ、ＥＮＧＳ和ＮＳＳ的实验组之间无明显差异．经冷冻保存的桑椹胚和早期囊胚的冷冻解冻胚的形态正常率在甘油、乙二醇和玻璃化三个冷冻处理组中分别为７５．０％、８６．７％和７５．０％，发育率分别为５８．３％、７８．８％和８０．０％．冷冻解冻胚的移植妊娠率在三个处理组中分别为５０％、７５％和５０％，产羔率分别为３０％、６８．８％和５０％．采用乙二醇冷冻绒山羊胚胎产生的效果优于甘油和玻璃化方法的冷冻效果。     

快速冷冻和解冻鼠胚的存活力

桑椹期鼠胚在1.0—2.5M 的二甲亚砜(DMSO)溶液中经三步程序快速冷冻到-196℃;试样在-4—-8℃诱异结晶,在-20℃的酒精浴槽保持10分钟,在—100℃液氮上垂悬10分钟,然后,立即放入液氮(—196℃)。在-20℃—-75℃之间降温速度为～17℃/分。快速解冻(360℃/分)在所有的 DMSO 浓度中培养48小时后发育到完整囊胚的比例高于慢速解冻(25℃/分)。在1.5—2.0M-DMSO 浓度中快速冷冻的胚胎获得最高的成活率(分别为36和53%)。经三步冷冻和快速解冻的胚胎用多种除去 DMSO 成分的方法进行试验。获得培养到完整囊胚的最好结果是在室温下在磷酸缓冲液(PBS) 2.0M-DMSO 0.5M 蔗糖溶液停留(2分钟),然后,在 PBS 0.5M 蔗糖溶液(2分钟)(82%)以及在30℃下分阶段稀释在 PBS 溶液中的胚胎(70%)。当胚胎快速冷冻并快速解冻后在培养液中培养到囊胚期的26个胚胎移植给2支受体得到11个仔鼠(42%)。     

非极性表面活性剂对小鼠早期胚胎冷冻保护作用的初步研究

许多研究者报道了某些非极性表面活性剂在防止蛋白质低温冷冻变性方面有着明显的效果．本研究就某些非极性表面活性剂对胚胎的防冻作用作了初步探索．方法是分别将不同浓度的两种表面活性剂Ｐｏｌｙｓｔｅｎ２０（Ｐ２０）和ＳＹ－ｇｌｙｓｔｅｒＭＬ－７５０（ＭＬ７５０）添加于改进的磷酸缓冲液（ＰＢ１）和本研究采用的防冻液（ＦＳ：ＰＢ１＋３ｍｏｌ乙烯二醇＋０．２５ｍｏｌ乳糖）中，处理小鼠早期胚２０ｍｉｎ后培养并观察对胚胎发育的影响，以确定它们对胚胎的临界安全浓度（ＣＳＣ）．在ＰＢ１中，两种表面活性剂的ＣＳＣ值均为０．５％，而在ＦＳ中，则为０．０５％．然后将两种表面活性剂Ｐ２０和ＭＬ７５０分别以０．０５％和０．０３％两种浓度添加于ＦＳ中，以ＦＳ作为对照组．在室温下平衡处理小鼠桑椹胚和早期囊胚５ｍｉｎ后连同防冻液一起装入塑料冷冻细管中．在液氮蒸气（－１７０℃）中预冷冻１ｍｉｎ后即投入液氮内保存．在３８℃水浴中快速解冻并去除防冻剂后在Ｗｈｉｔｔｅｎ培养液中培养２４ｈ．分别观察和统计冷冻－解冻胚的形态正常率和发育率．结果表明：处理组与对照组在冷冻－解冻胚形态正常率方面无显著差异（Ｐ＞０．０５），而添加０．０３％Ｐ＿２Ｏ或ＭＬ７５０的两     

人输卵管上皮细胞共培养系统对小鼠胚胎体外发育的影响

常规体外培养的胚胎桑椹胚以上发育率低,胚胎质量不高及移植环境不适合可能是导致IVF-ET成功率低下的原因。目前,国外一些实验室尝试将多种哺乳动物乃至人的胚胎与输卵管组织或上皮细胞进行共培养,发现有促进胚胎体外发育及提高妊娠率的作用,本课题组将人输卵管上皮细胞与小鼠胚胎共培养,观察其对胚胎体外发育及胚胎质量的影响。结果显示：共培养的胚胎24h后大部分发育到4细胞期以上,发育快的已达桑椹胚。培养48h后共培养的胚胎大部分发育成桑椹胚,有些已开始形成囊胚腔。到72h,正常发育的共培养胚胎形成囊胚和孵出囊胚。3个观察…     

体外培养高产奶牛胚胎的研究

研究体外培养法培养效果及对体外受精胚胎发育的影响。体外受精胚胎分别在加输卵管上皮细胞单层和颗粒细胞单层（2×106个／ml）的体外培养体系的培养液中培养。结果发现,冷冻胚胎解冻后停留时间对胚胎培养效果影响极显著（P〈0．01）;冷冻胚胎解冻后胚胎等级对胚胎培养效果影响显著（P〈0．05）,解冻后A级胚胎存活率79％、囊胚孵化率56％,显著高于B级胚胎存活率60％和囊胚孵化率39％（P〈0．05）。体外培养体系囊胚形成主要集中在第8d,加体细胞的体外培养体系显著好于不加体细胞的简单体外培养法。     

不同体外培养系统对牛体外受精胚胎冷冻解冻的孵化能力的影响

采用ＳＯＦ和ＴＣＭ１９９与输卵管上皮细胞共同培养系统对牛体外受精卵进行培养,观察了在这两种培养条件下得到的襄胚经冷冻－解冻后的孵化能力,在ＳＯＦ＋输卵管上皮细胞的培养条件下,囊胚的发育率为２１．３％,襄胚经冷冻－解冻后的孵化率为３７．５％;在ＴＣＭ１９９＋输卵管上皮细胞的培养条件下,囊胚的发育率为２６．０％,衰胚经冷冻－解冻后的孵化率为４７．７％,研究结果表明这两种体外培养系统的培养效果无明显差异     

山羊胚胎的体外发育及冷冻保存研究

采用体外培养的方法，对山羊２～８细胞胚进行培养以后将体外发育至囊胚的胚胎进行冷冻保存，以便探讨山羊早期胚的体外培养方法和冷冻方法对体外发育胚冷冻效果的影响。将胚胎分别放入Ｍ１９９、Ｍ１９９＋输卵管上皮细胞和Ｍ１９９＋输卵管上皮细胞＋ＥＧＦ的培养液中进行培养，选取发育至囊胚期的胚胎分别以甘油和乙二醇为冷冻保护剂进行冷冻保存。结果体外培养胚的囊胚发育率在三个处理组中分别为１２．５％、７０．６％和７６．９％。使用Ｍ１９９处理组与添加输卵管上皮细胞、添加输卵管上皮细胞和ＥＧＦ的处理组之间具有极显著性差异（Ｐ＜０．０１）。冷冻解冻胚的形态正常率和发育率在以甘油和乙二醇为防冻剂的处理组中分别为６８．７、５８．３％和７８．６％、７２．８％。两组之间无明显差异，结果表明，采用与输卵管上皮细胞共同培养的方法能够提高山羊胚胎体外培养的发育率，以甘油和乙二醇为冷冻防冻剂均适合于山羊体外发育胚的冷冻保存，两者相比乙二醇的效果略优于甘油。     

小鼠胚胎冷冻方法的研究

本试验共用小鼠胚胎7858枚,对冷冻-解冻小鼠胚胎过程中的一些环节进行了对比试验,结果表明,冷冻过程中诱发结晶温度最好为-7℃左右,致冷时间以15—20秒为宜。致冷时间过长或过短都会引起解冻后胚胎成活率的下降。将胚胎缓慢冷冻至—0——40℃再投入液氮可获得较理想成功率。而—25℃以前投入液氮的胚胎其解冻后体外发育能力明显不如—30℃以后投入者。将胚胎冷冻管投入液氮的方式,对解冻后胚胎的形态和体外发育能力均有显著影响。将胚胎冷冻管插入液氮深部的效果显著优于漂浮于液氮表面者。添加甘油的方法对解冻后胚胎的体外发育能力无显著影响,三步添加甘油和一步添加甘油的胚胎,在解冻后培养的发育率和膨胀率方面均无显著差异。脱除甘油的方法明显影响解冻后胚胎的体外发育能力,在1/3M蔗糖液中分步脱除甘油的方法。明显优于在0.5M蔗糖液中一步脱除法。缓慢冷却至—36℃投入液氮的胚胎,在30～35℃水浴中解冻后体外培养成活率最高,而在0℃,10℃和20℃解冻的胚胎成活率明显降低。     

屠宰母牛卵巢卵母细胞的体外受精与早期发生

将采自屠宰母牛卵巢的未成熟卵子在含有促性腺激素和牛血清的TCM199或Ham'sF10内培养成熟后,再用以钙离子载体Ionophore A23187诱导获能的牛新鲜或冷冻精子进行授精处理,6～7小时后移入发育用培养液,即含有牛血清及丙酮酸钠的M199或Ham's F10内继续培养。在授精48小时及60～96小时后分别统计了培养卵子的受精率及受精卵的卵裂率。在部分实验中把发育为4～8细胞期的胚移入经假孕处理过的母兔输印管内培养4～5天或者在原发育培养液内继续培养5～8天之后观察了桑椹胚、囊胚的出现率。结果是培养卵子的受精率及受精卵的卵裂率分别达92.0～97.8％和62.5～67.6％,移入兔输卵管内和在体外条件下继续培养的卵子中分别有3.7～30.8％和4.3～31.0％(发育为外形正常的桑椹胚～囊胚期胚胎(包括扩张囊■及■化囊胚)。     

小鼠不同杂交组合胚胎玻璃化冷冻的研究

通过小鼠胚胎的毒性试验 ,确定对胚胎无毒性或毒性小的冷冻保护剂的种类、适宜浓度 ,以便达到提高冷冻解冻后的胚胎存活率的目的。用小鼠不同杂交组合胚胎进行玻璃化冷冻和解冻后 ,经体外培养观察胚胎的存活率和囊胚孵化率 ,确定了最佳的杂交组合     

平衡方法及平衡和解冻温度对牛体外受精胚胎玻璃化冷冻保存效果的研究

以体外成熟、体外受精并体外发育的牛囊胚为实验材料进行玻璃化冷冻保存，分别探讨了防冻剂的平衡方法以及平衡和解冻温度对胚胎冷冻效果的影响．实验结果显示，在室温下（１８℃）以二步法或三步法添加防冻剂的冷冻效果，明显优于在４℃下，以二步法添加防冻剂的效果，其冷冻—解冻胚的发育率分别为６２．８％（５９／９４）、５３．１％（５２／９８）和１４．６％（１２／８２）（Ｐ＜０．０１）；另外，室温下以二步法玻璃化冷冻的胚胎，在２０℃水浴中解冻的发育率明显高于３７℃解冻的效果，６２．７％（３７／６２）、２６．２％（１６／６１）（Ｐ＜０．０１）．结果表明：体外成熟、体外受精的牛胚胎可以进行玻璃化冷冻保存，并能得到较高的培养存活率，在室温下，以二步法添加防冻剂，并于２０℃下解冻的玻璃化冷冻保存方法是一种快速、简便而有效的方法．     

静电场对小鼠体外受精胚胎质量的影响

利用静电场处理体外受精（ＩＶＦ）小鼠原核期胚胎，并在体外进行发育培养，在此过程中通过观察ＩＶＦ胚胎的发育速度及冷冻－解冻后囊胚孵化率，探讨了静电场对小鼠ＩＶＦ胚胎质量的影响，实验结果显示，授精处理后８４ｈ，处理组的囊邳经（４６．５％）显高于对照组（２５．５％），并且到１０８ｈ时，处理组的囊胚孵化率（９４．４％） 于对照组（６０．０％），表明静电场处理与对照组无差异，然后囊胚孵化率却高于组１８．４     

绵羊体外成熟,体外受精卵的体外发育及移植后的产羔

体外成熟、体外受精后的绵羊卵在体外长期培养或在2～4细胞期和桑堪～囊胚期移植给受体母羊,观察了培养卵的发育和移植后的受胎率。方法是将采自屠宰场的绵羊卵巢在1～12小时内带回实验室,抽取卵母细胞。从中选取卵丘细胞层完整的卵子,在二氧化碳培养箱内,用含有10％NSS(或FCS)、hCG和E_2,并以Hepes缓冲的M199培养24～26小时。再用以IonophoreA23187诱导获能处理过的新鲜公羊精于进行体外受精.7～10小时后移入发育培养基,即含有10％FCS(或NSS)和丙酮酸钠的Hepes缓冲的M199内继续培养,受精后将部分发育为2～4细胞胚和桑堪～囊胚期胚手术移植给受体母羊。另一部分卵子则在受精后48～72小时的不同时间内统计其卵裂卵的出现率,并继续培养7～12天详细观察卵裂卵的发育情况。在受精后48～72小时卵裂卵的出现率,FCS和NSS组分别为39.6％145/366)和52.4％(182/347),前者显著低于后者;将61枚2～4细胞期胚和桑椹～囊胚期胚分别移植给20只受体母羊,有10只受胎。共产羔11只,受胎率为50％;在发育培养液内继续培养的482枚卵裂卵中有312枚(64.7％)发育为桑椹～囊胚期胚(其中包括部分孵化囊胚)。     

瘦素对小鼠体外胚胎发育率及胚胎移植后着床率的影响

观察瘦素对体外受精后胚胎发育和胚胎移植后着床率的影响。采用小鼠卵母细胞体外受精后胚胎培养及胚胎移植的方法研究仅受精时添加的瘦素对受精后体外胚胎发育的影响及胚胎移植后着床率的影响。结果表明：1）仅受精时添加不同浓度的瘦素对受精卵发育至四细胞胚、桑椹胚及囊胚的比率均无显著影响（P〉0.05）。2）添加的瘦素剂量为10ng/mL及50ng/mL时胚胎着床率较高,当添加的瘦素剂量为100ng/mL-500ng/mL胚胎着床率未提高,两组差别有统计学意义（P〈0.05）。一定水平的瘦素可以显著提高小鼠的体外胚胎移植后的着床率,高水平瘦素反而对着床不利。受精后至着床前各期胚胎的发育率与受精当时瘦素浓度无关。     

Smad2基因敲除小鼠冷冻胚胎库的建立

目的 建立Smad2基因敲除小鼠胚胎库。方法 利用OPS法对Smad2基因敲除小鼠胚胎进行玻璃化冷冻保存,并比较不同杂交组合小鼠的超数排卵数、解冻胚胎的复苏率及发育率。结果 两组不同杂交组合（Smad2^＋/－♂×Smad2^＋/－♀和Smad2^＋／－×Smad2^＋／－♀）小鼠平均超排卵数分别为14．13枚和24．60枚;复苏率分别为90．16％和91．67％;囊胚发育率分别为73．08％和77．05％。这些结果表明Smad2基因敲除杂合子母鼠的超排数量明显低于野生型母鼠的超排数量,而二者胚胎解冻后的复苏率和囊胚发育率没有显著差异。因此我们主要通过对野生型小鼠超数排卵,然后与Smad2基因敲除杂合子雄鼠交配的方法获取胚胎,进行玻璃化冷冻保存,现已冻存胚胎1256枚。结论 成功建立了Smad2基因敲除小鼠胚胎库。     

Lats基因敲除小鼠胚胎玻璃化冷冻的研究

用冷冻麦管、细胞冷冻管分别采用一步法和二步法对Lats基因敲除小鼠胚胎进行玻璃化冷冻 ,胚胎解冻后 ,囊胚发育率分别为 90 %、90 1%、89 2 %和 91 4 % ;移植后着床率分别为 :5 0 0 %、4 7 1%、4 3 4 %和 4 6 5 % ,差异不显著 ;并且与对照组相比差异也不显著。因此 ,玻璃化冷冻可以作为Lats鼠保种方法之一     

小鼠胚胎快速冷冻方法的研究

3770枚小鼠胚胎随机分为以下12个试验组:三个不同浓度甘油(2.1、2.8和3.5M)分别与四个浓度蔗糖(0.25、O.5、0.75和1.00)配合成12种不同高渗快速冷冻液。通过对比筛选试验,对昆明小鼠的紧缩致密期早囊胚快速冻存试验.确定3.5M甘油和0.25M蔗糖混合成的快速冷冻液为最佳组合,用其处理的胚胎,经快速冷冻、解冻后。胚胎体外培养发育率最高,达84.3％,其中膨胀期和孵化期胚胎为78.3％,明显高于其它11种组合(P<0.01)。     

影响玻璃化法冷冻保存胚胎的一些因素

探讨了用玻璃化法冷冻保存小鼠桑椹胚的一些影响因素。冷冻胚胎的保护剂采用性质较温和的甘油和1,2-丙二醇组成的玻璃化液,以37℃,体积分数5％CO2条件下能发育到囊胚期为保持正常生命力的指标。结果表明,玻璃化液中的甘油和丙二醇的浓度是冷冻保存胚胎的关键因素,而甘油和丙二醇比例对保存效果也有影响。在所用的不同组合的玻璃化液中,含2．5mol／L甘油和3．5mol／L1,2-丙二醇效果最好。0．25mL的冷冻管比0．5mL的效果更好。