人胰岛素基因重组杆状病毒在家蝇中表达的研究

目的利用杆状病毒表达系统进行人胰岛素基因在家蝇中表达的研究.方法用携带有人胰岛素基因的重组杆状病毒感染家蝇幼虫,用放射免疫技术、Tricine-SDS-PAGE和Western-blot技术对蝇蛆胰岛素表达水平进行检测.结果重组的杆状病毒感染家蝇幼虫后,蝇蛆中有人胰岛素的表达,表达量为37.401μIU/mL,占蝇蛆总蛋白的0.583%.结论利用杆状病毒表达系统可以在家蝇蝇蛆中表达人胰岛素.     

猕猴B病毒妒和gC合成基因重组杆状病毒质粒的构建

目的构建猕猴B病毒gB和gc合成基因的杆状病毒重组质粒（rBacmid）。方法根据本室已经合成的猕猴B病毒gB基因和gc基因,利用BamHI和XhoI特异性酶切,将其亚克隆于昆虫杆状病毒的pFastBacHTA转座载体。将该阳性转座载体转化到DHlobac感受态细胞,从中筛选出阳性重组细菌,并提取重组质粒。结果获得了重组质粒bacmid—gB和bacmid—gC。结论该研究为猕猴B病毒gB和gc蛋白在杆状病毒系统内的表达奠定了基础。     

突变型绿色荧光蛋白基因在昆虫细胞和幼虫中的表达

用细菌－杆状病毒穿梭系统将一套含有绿色荧光蛋白基因和完整多角体蛋白基因的表达盒转座到ＡｃＮＰＶ－Ｂａｃｍｉｄ的Ｔｎ７转座接受位点,从而构建出一种带有ｇｆｐ基因和完整多角体基因的重组杆状病毒,用这一重组病毒感染细胞能稳定地殂多角体。     

昆虫细胞中共表达人糖基转移酶对重组蛋白SEAP表达的影响

杆状病毒-昆虫细胞表达系统有表达量高及蛋白翻译后修饰较完善等特点,但与哺乳动物相比其缺乏几种关键的糖基转移酶.许多研究表明将哺乳动物的糖基转移酶基因转入昆虫细胞中,能使得昆虫细胞表达蛋白的修饰得到有效改善.本研究通过RT-PCR克隆了人Ⅱ型N-乙酰葡萄糖胺转移酶(β-1,2-N-acetylglucosaminyltransferaseⅡ)和Ⅰ型β-1,4-半乳糖基转移酶(β-1,4-galactosyltransferase)基因,并将它们分别插入重组杆状病毒上,获得了表达GnT2和β4GalT1的重组杆状病毒.以具有糖基化修饰位点的人分泌型碱性磷酸酶(Secreted Alkaline Phosphatase,SEAP)为对象,将表达糖基转移酶的重组杆状病毒和表达SEAP的重组杆状病毒共感染细胞,Western blot分析结果表明共感染时所表达的SEAP蛋白条带分子量明显大于其单独表达时的分子量.结果表明重组病毒共感染对杆状病毒-昆虫细胞表达的SEAP有修饰作用.     

利用Tn5转座子构建杆状病毒AcMNPV随机突变体的初步研究

以杆状病毒模式种AcMNPV为研究对象,应用基于Tn5转座子的随机转座的方法,构建杆状病毒突变体库将果蝇hsp70启动子后接绿色荧光蛋白基因后插入Tn5转座子,构建了可以在昆虫细胞中表达,易于跟踪的转座载体．利用体外转座系统将转座子随机插入AcMNPV基因组,并用转座反应液转染Sf21细胞,得到了表达绿色荧光蛋白的病毒突变体库进一步纯化了两株病毒B9F和Li6A,进行了转座子插入位点的分析,确定两株病毒中,转座子分别插入了94K基因和p10基因．该方法将为杆状病毒功能基因组研究提供重要的手段。     

利用昆虫-杆状病毒表达系统制备HPV16E6蛋白

目的利用昆虫-杆状病毒表达系统高效表达HPV16E6蛋白。方法将HPV16E6基因克隆入供体质粒pFastBac-HTb,然后再重组入杆状病毒基因组;用带有目的基因的杆状病毒转染昆虫（Sf-9）细胞,27℃培养72 h,收集被转染细胞,SDS-PAGE,Western-blot分析鉴定表达蛋白。结果SDS-PAGE分析显示所表达蛋白分子量约为24KD,Western-blot结果表明表达产物为HPV16E6蛋白。结论利用昆虫杆状病毒表达系统获得HPV16E6蛋白的高效表达。     

利用昆虫-杆状病毒表达系统制备HPVl6E6蛋白

目的 利用昆虫一杆状病毒表达系统高效表达HPVl6E6蛋白.方法 将HPVl6E6基因克隆入供体质粒pFastBac-HTB),然后再重组入杆状病毒基因组;用带有目的 基因的杆状病毒转染昆虫(Sf-9)细胞,27℃培养72 h,收集被转染细胞,SDS-PAGE,westem-b10t分析鉴定表达蛋白.结果 SDS-PAGE分析显示所表达蛋白分子量约为24KD,western-blot结果表明表达产物为HPV16E6蛋白.结论 利用昆虫杆状病毒表达系统获得HPV16E6蛋白的高效表达.     

重组杆状病毒的研究 Ⅰ.含大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因的粉纹夜蛾核型多角体病毒

以昆虫杆状病毒(Baculovirus)为载体、昆虫虫体和昆虫细胞为受体的基因工程,是目前正在开拓的富有前途的新领域之一.杆状病毒载体系统的优点在于:对外源基因的容量大;病毒基因组能提供一个可插入外源基因而对病毒复制本身不受影响的非必需区(多角体基因),同时提供一个极强的启动子,使植入的外源基因能高效表达;能大规模低成本地饲养寄主昆虫,从而有可能大量获得具有重要经济价值的外源基因表达产     

neuritin基因杆状病毒表达载体的构建

为研究Neuritin蛋白的功能,将neuritinORF在杆状病毒-昆虫表达系统中表达,构建杆状病毒表达载体.以308D10为模板,利用PCR方法扩增neuritinORF,定向克隆法将其克隆至PFASTBAC-HTA转移载体中.然后利用同源重组原理将其转移至杆粒bacmid中.得到携带neuritin ORF的重组杆粒.本实验获得了重组目的基因真核表达载体并经PCR鉴定,插入片段方向、大小正确,DNA测序分析表明插入处接头和读框与预期序列相符,成功构建了Neuritin的杆状病毒表达载体.     

昆虫杆状病毒可调控表达系统的初步研究

构建了2株用不同启动子表达tet阻遏蛋白Tet-off,并同时带有tet响应元件及报道基因表达框的重组杆状病毒,研究了其受诱导物(强力霉素)调控表达报道基因的情况.W estern b lot和流式细胞仪分析表明,这两株病毒感染昆虫Sf9细胞后,在有诱导物存在时报道基因egfp表达水平明显高于无诱导物时的表达水平,表明Tet-off可调控表达系统可以用于在昆虫Sf9细胞调控相关基因的表达,这项研究为构建更加有效的可调控杆状病毒表达系统提供了基础.     

犬瘟热病毒N蛋白抗原表位基因的合成和杆状病毒表达载体的构建

目的串联合成犬瘟热病毒N蛋白抗原表位基因,并构建其杆状病毒表达载体。方法利用生物信息学软件,预测N蛋白的抗原表位,串联合成这些抗原表位。利用定向克隆的方法,将该基因片段连接到杆状病毒表达载体pFastBac-Hta。结果获得了包含犬瘟热病毒N蛋白抗原表位的基因,并成功构建pFastBac-N合成表达载体。结论该实验为犬瘟热病毒N蛋白抗原表位基因在杆状病毒内的表达奠定了基础。     

NDV核心抗原重组杆状病毒转移载体的构建

F和HN蛋白是新城疫病毒(NDV)中两种具有抗原性的表面糖蛋白．对NDV中国强毒株F48E8的F和HN基因进行了全长核苷酸序列分析．F基因的长度为1662bp，编码553个氨基酸，糖基化位点与已知的其他株系的位点相同；HN基因全长1904bp，编码571个氨基酸，其中第5个糖基化位点(第500～502个氨基酸)由NPT突变成NPV．为了便于在杆状病毒中表达，将F和HN基因的核心抗原区通过PCR扩增，并成功地克隆进杆状病毒转移栽体中，为利用杆状病毒表达系统生产抗新城疫病毒的基因工程疫苗打下基础．     

拟南芥、水稻和杨树ACTIN家族全基因组分析

鉴定了覆盖拟南芥、水稻和杨树3种模式植物全基因组的20个拟南芥、18个水稻、22个杨树ACTIN蛋白基因,对其染色体定位、基因结构、基因复制等进行了综合分析.并在系统进化分析基础上,将ACTIN基因家族分为12个亚家族,有助于揭示植物ACTIN基因家族的进化历史,为后续ACTIN基因家族的功能提供线索,对研究植物ACTIN基因家族功能和进化上的多样性提供理论基础.     

杆状病毒及其应用

介绍了杆状病毒的基本概念,阐述了杆状病毒表达载体系统,回顾了杆状病毒生物杀虫剂的研究成果,展望了杆状病毒生物杀虫剂的应用前景。     

重组杆状病毒AcMNPV—BmK IT—vcath的构建及毒力分析

利用Bac-to-Bac载体系统,构建了含有东亚钳蝎Buthusmartensii Karsch昆虫特异性神经毒素基因(BmK IT)和杆状病毒组织蛋白酶基因(vcath)的重组杆状病毒AcMNPV-BmK IT-vcath,使这两个基因分别位于plO基因启动子(Pp10)和多角体基因启动子(Pph)的控制下高效表达.抗棉铃虫毒力分析表明,该重组病毒的LC50值为28 829.5 pfu/mL,比野生型病毒的LC50值(33114.5 pfu/mL)降低13%;重组病毒的LT50值为3.5d,而野生型的LT50值为4.1d,提高了14.6%,表明该重组病毒的活性比野生型病毒有明显的提高.     

斜带石斑鱼肝脂酶和脂蛋白脂酶基因克隆与序列分析

为从分子水平研究海水鱼类肝脂酶(hepatic lipase,HL)和脂蛋白脂酶(liportein lipase,LPL)基因在脂质代谢过程中的作用及其分子系统进化地位,采用RT-PCR及RACE法从斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)肝脏克隆得到HL、LPL基因cDNA全序列.克隆获得斜带石斑鱼肝脏HL基因cDNA全长2 261 bp,其中5′非翻译区(5′-UTR)为186 bp,3′-UTR为590 bp,开放阅读框(ORF)为1 485 bp,编码494个氨基酸;LPL基因cDNA全长2 191 bp,其中5′-UTR为 144 bp,3′-UTR为 499 bp,ORF为1 548 bp,编码515个氨基酸.序列同源性分析表明,斜带石斑鱼HL、LPL基因与哺乳动物同源性均低于真骨鱼类罗非鱼、斑鳢和真鲷等,这与其亲缘远近关系相一致,表明HL、LPL在进化过程中都相对保守.构建系统发生树显示,斜带石斑鱼HL、LPL基因氨基酸序列与大口黑鲈、真鲷等共同占据进化树上独立的分枝,与较为原始的硬骨鱼类中华鲟在进化树上距离较远.本实验对斜带石斑鱼HL、LPL基因同源性、系统进化地位的研究,为进一步研究海水鱼类脂代谢调控机制,预防鱼类脂代谢疾病奠定了基础.     

有限稀释法筛选重组AcNPV病毒

有限稀释法筛选重组ＡｃＮＰＶ病毒钟劲胡美浩１）（北京大学生命科学学院,北京,１００８７１）关键词重组病毒;梯度稀释;筛选;测活中图分类号Ｑ３３２０引言昆虫杆状病毒表达系统是一高效表达外源基因的表达系统。用于基因工程表达外源基因的ＡｃＮＰＶ（ａｕｔｏｇ...     

广西5种常见星虫动物的线粒体基因组特征和系统进化分析

为探明广西北部湾星虫动物的线粒体基因组遗传变异和基因序列特征,采用高通量测序测定广西北部湾5种常见星虫动物的线粒体基因组,并对其基因序列特征、遗传变异、系统进化进行分析。结果显示,星虫动物线粒体基因组具有典型的无脊椎动物线粒体基因组的特征,基因排列高度保守,特别是其13个蛋白质编码基因（PCGs）。此外,星虫动物线粒体基因组的基因均编码在H链上,并存在3个高度保守的基因排列区块,与环节动物和螠虫动物线粒体基因组特征较为相似。cox1、cox2和cob等3个基因进化速率最慢、遗传变异水平最低,适合作为星虫动物种属系统进化研究以及不同种间生物条形码构建的分子标记。nad6、nad4、nad5和nad2等4个基因的遗传变异水平较高（大于60%）,变异位点数量较多,适合作为星虫动物种群遗传多样性研究的分子标记。星虫动物线粒体13个蛋白质编码基因的Ka/Ks比值均低于1（0.058 2-0.726 6）,其中cox1、cox3和cob等3个基因的Ka/Ks比值最低（小于0.1）,表明在星虫动物线粒体遗传进化过程中,这3个蛋白质编码基因承受强烈的自然选择压力和功能束缚。基于线粒体基因组蛋白质编码基因系统进化树的研究结果表明,星虫动物可分为方格星虫纲和革囊星虫纲两个进化分支,星虫动物与环节动物的进化地位、亲缘关系较近,而与软体动物的亲缘关系较远。本研究结果不仅为广西北部湾特色星虫动物渔业资源多样性调查和保护提供分子遗传数据,也为星虫动物系统进化研究提供了科学参考。     

基于2种核蛋白编码基因序列研究16种对虾系统发育关系

为了研究对虾科(Penaeidae)对虾的系统发育关系,基于2种细胞核蛋白编码基因钾钠腺苷三磷酸α亚基(NaK)基因和磷酸烯醇丙酮酸激酶(PEPCK)基因,使用邻接(neighbor-jointing,NJ)法构建了9属16种对虾的系统发育树.研究结果有力地支持了1983年Burkenroad提出的三群体分类系统,除新对虾属处于进化树最先起源的位置外,系统发育树形成3个进化枝,其一为对虾属、明对虾属、滨对虾属、囊对虾属和沟对虾属,其二为仿对虾属和鹰爪虾属,其三为赤虾属,分别对应为Penaeini、Trachypenaeini和Parapenaeini 3个群体.基于核基因的系统发育树很好地解决了线粒体基因构建的系统发育树中对虾属和明对虾属进化关系不明确的问题,赤虾属的进化关系也很好地符合了形态学分类结果,因此可以作为对虾系统进化研究的重要补充手段与其他的研究方法联合应用.     

主要组织相容性复合体(MHC)的起源与进化概述

主要组织相容性复合体(MHC)是免疫球蛋白超基因家族中的一个大类,MHC分子作为个体标志抗原早已为大家所熟悉,因而在脊椎动物进化中扮演着不可替代的角色.到目前为止,我们已经完成了包括从真兽亚纲(胎盘动物)到非哺乳动物的部分物种,包括鸟类、硬骨鱼及软骨鱼(如鲨鱼)的MHC的基因结构图,但是由于在非哺乳动物和哺乳动物中MHC的基因结构和复杂度不一样,所以很难对非哺乳动物向哺乳动物进化的这一时间段进行有效的进化史或系统演化史研究.研究人员推测,原始MHC分子的进化最初是与发育调控需求相关的,就其进化机制及进化意义做一综述.