表达鸡传染性支气管炎病毒SD/97/01株S1蛋白的重组杆状病毒的构建

采用BAC－TO－BAC杆状病毒表达载体体系构建了表达鸡传染性支管炎病毒（IBV）呼吸型毒株SD／97／01S1蛋白的重组杆病病毒，含SD／97／01株S1基因原重组质粒p MDSD9701S1用BamHI和SalI双酶切后，回收的片段并克琶杆病病毒转座载体pFASTBACHTa中多角体基因启动子的下游，筛选出重组转座质粒pFASTSD9701S1U并转化大肠杆菌DH10BAC后,获得重组穿梭质粒rBacmidSD9701S1，用重组穿俊质粒DNA转染昆虫Sf9细胞，获得了含SD／97／01S1基因的重组杆状病毒rAcSD9701S1，重组病毒感染Sf9细胞后，用SDS－PAGE、Westernblot和IFA对细胞表达产物进行检测和分析。结果表明：构建的重组杆状病毒能够在昆虫细胞中表达SD／97／01的S1蛋白，该蛋白具有天然蛋白的抗原性。     

核酶M1GS-T6对HCMV UL97基因RNA片段体外切割作用

目的:研究M1GS核酶对HCMV UL97mRNA的体外切割作用.方法:针对HCMV UL97 mRNA T6位点设计与之互补的引导序列(Guide Sequence,GS),将其共价结合至大肠杆菌核酶P催化亚基(M1 RNA)的3'末端,构建M1GS-T6核酶,并用其对UL97基因亚克隆片段转录产物进行体外靶向切割实验.结果:核酶M1GS-T6具备特异性切割靶分子UL97 mRNA的能力.结论:核酶M1GS-T6具备特异性切割活性,为进一步研究HCMV病毒基因功能和治疗提供了新的途径.     

CRISPR-Cas9系统定向编辑TCR基因的sgRNA筛选

为构建靶向T细胞抗原受体(T Cell Receptor,TCR)基因的CRISPR-Cas9基因组编辑系统,基于p X458质粒构建靶向TCR基因β链C区的CRISPR-Cas-sgRNA质粒,将其转染Hep G2细胞系,用流式细胞术检测转染效率;转染48 h后提取Hep G2细胞基因组DNA,扩增含有编辑位点的片段,测序分析该片段的峰图改变;对出现双峰的扩增片段做T-A克隆后测序分析,确定基因编辑发生的位置,并结合转染效率计算基因编辑效率.结果表明,成功构建含有3种sgRNA序列(N1、N2、S1)的p X458-sgRNA质粒,其转染效率分别为38.5%(N1)、39.7%(N2)和24.2%(S1);基因组PCR产物测序分析发现,S1组扩增片段在打靶位置出现杂峰;T-A克隆测序发现,20克隆有4个发生了基因编辑(20%),结合转染效率(24.2%)可知,编辑效率约为83%.可见,本文成功构建靶向TCR基因的CRISPR-CassgRNA质粒,并鉴定出基因编辑效率较高的一种sgRNA序列.     

蝽亚科部分昆虫mt DNA-16S rRNA序列多态性分析(半翅目:蝽科)

以16S rRNA基因作为分子标记,对蝽亚科6种昆虫及外群异蝽科昆虫进行特异性扩增和序列测定,对序列的碱基组成、转换颠换、遗传距离等进行分析,探讨了16S rRNA基因在该亚科的分子进化机制.并基于16S rRNA基因序列数据,采用邻接法(NJ)建立蝽亚科部分昆虫分子系统发育关系[1].获得的16S rRNA基因序列片段的长度在439~441 bp之间,且保守性序列较多.该片段中碱基T,C,A,G的平均含量分别为32.9%,17.9%,40.5%,8.8%,A+T平均含量为73.4%,明显高于G+C含量(26.7%),存在较强的A+T含量偏向性;密码子第三位点A+T含量更高,达77.1%.通过测定该基因片段的序列发现,不同种群存在丰富的DNA序列多态性.     

中华哲水蚤线粒体DNA COI基因序列分析

采用苯酚-氯仿-异戊醇(25：24：1)提取、异丙醇沉淀、酒精洗涤、TE缓冲液保存方法提取了采自胶州湾青岛海域的中华哲水蚤基因组DNA；以相应引物经PCR扩增得到线粒体DNA细胞色素氧化酶Ⅰ亚基基因(mtCOD)片段；PCR产物采用化学法进行质粒重组(载体pGEM—T Easy Vector)、热休克转化重组质粒至大肠杆菌感受态细胞(JM109)、氨苄LB培养基扩大培养；测序．结果表明。中华哲水蚤线粒体COI碱基大小为710bp(国际基因库索引号AY665663)。其碱基组成A、C、G、T含量分别为24．23％、19．15％、22．54％和34．08％；G C含量为41．69％。A T为58．31％．     

拉布拉多犬神经类型相关基因SNP的分析

目的检测拉布拉多犬基因组DNA中与神经类型密切相关的4个基因中的6个SNP位点,以期为拉布拉多犬神经类型的早期鉴定提供分子遗传学鉴定指标。方法依据中国导盲犬大连培训基地成熟的导盲犬神经类型行为学评估标准,选取典型的安静、活泼、胆小型(弱型)三种神经类型的犬各4只为研究对象,采取静脉血,提取血细胞的基因组DNA样本,采用PCR/测序方法和PCR-RFLP分析法对12个样本4个基因的6个SNP位点:COMT(G482A)、MOAB(T199C)、ABCB1(A985T、T3442C、377-378 ins C)、GNB1L(961-962 ins G)进行变异型检测,并统计分析SNP位点的变异型与神经类型的关联度。结果 COMT基因G482A SNP位点的G/A型在胆小型犬中所占比例显著高于其在活泼型和安静型中所占比例(P=0.014;P=0.014),A/A型在活泼型犬中所占比例显著高于安静型和胆小型中所占比例(P=0.025;P=0.025);MAOB基因T199C SNP位点的T/C型在安静型犬中所占比例显著高于其在活泼和胆小型犬中所占比例(P=0.025;P=0.025);ABCB1基因A985T SNP位点的T/A型在活泼型犬中所占比例显著低于其在安静和胆小犬中所占比例(P=0.014;P=0.014);ABCB1基因T3442C SNP位点的T/C型在胆小型犬中所占比例显著高于其在活泼和安静型犬中所占比例(P=0.025;P=0.025);ABCB1基因的377-378 ins C和GNB1L基因的961-962 ins G均没有发现显著性差异(P0.05)。结论 COMT基因G482A SNP位点的G/A型和A/A型,MAOB基因T199C SNP位点的T/C型,ABCB1基因A985T SNP位点的T/A和ABCB1基因T3442C SNP位点的T/C型与拉布拉多犬神经类型具有显著相关性,可做为拉布拉多犬神经类型早期鉴定的分子遗传诊断指标,但尚需大样本确认。     

Polymorphism of human cytomegalovirus （HCMV） UL144 gene in low passage clinical isolates

To explore the impact of gene polymorphism of human cytomegalovirus （HCMV） on virus virulence, the full-length UL144 gene and partial sequence of glycoprotein B （UL55） gene were sequenced and analyzed for 23 clinical strains of HCMV isolated from urine samples of pediatric patients with congenital or postnatal HCMV infection. Among the 23 isolates, 13 （57 %） were UL144 genotype 1A, 3（13 %） were UL144 genotypes 2 and 7（30 %） were UL144 genotype 3; geographic differences in geno- type distribution were found for both UL144 and gB gene. No UL144 genotypes 1B and 1C were found in this study while these two genotypes were common in HCMV strains isolated in the US. Our results also demonstrated that for all clinical strains of gB genotypes I, III and UL144 genotypes 1A, 2, and 3 found in this study, mother-to-fetus vertical transmission was possible.     

SLC1A2基因SNP位点与拉布拉多和金毛猎犬活跃度的相关性研究

目的 检测SLC1A2基因SNP位点与拉布拉多和金毛猎犬活跃度的相关性,以期为导盲犬早期选育筛选有效的遗传学分子标记。方法 选取中国大连导盲犬培训基地的99只犬(拉布拉多犬80只,金毛猎犬19只),采用Passive test(PT)行为测试法对犬的活跃度进行评估。同时采集该99只犬的静脉血,提取血细胞中的基因组DNA样本,采用PCR/测序方法对该99只犬的SLC1A2基因T129C、T1549G 和T471C 3个SNP位点进行基因型鉴定,并统计分析犬的活跃度与SLC1A2 SNP位点的相关性。结果 SLC1A2 基因的3个SNP位点中,T129C和T1549G位点没有多态性,分别仅存在C/C型和G/G型。T471C位点存在3种基因型：T/T、T/C和C/C。这3种基因型与活跃度、性别以及品种间不存在显著相关性(P>0.05)。另外,品种与活跃度之间也没有显著相关性(P>0.05),但性别与活跃度间存在显著相关性(P=0.049)。结论 SLC1A2基因的T129C、T1549G 和T471C位点与导盲犬的活跃度不具有显著相关性,不能作为导盲犬的遗传学筛选的指标。由于性别与活跃度间存在显著相关性,因而在行为学测试中,对犬的活跃度评分标准应雌雄有别。     

“私人基因图”普及风暴悄然临近 “1000美元基因组”把你的基因图读给你

“1000美元基因组”把你的基因图读给你许多基因组解码技术利用DNA的碱基互补对规则。基因组语言的“字母表”只包含4个字母,即被称为碱基的基本单位一腺嘌呤[A],胞嘧啶[C],鸟嘌呤[G]和胸腺嘧啶[T]。它们彼此配对(A和T,C 和G),从而形成标准的DNA梯阶。活细胞使用这一规则复制和修复自身的DNA 分子;碱基配对规则也被人们来复制和感兴趣的DNA,直到如今,它仍是主流DNA 定序技术的基本原理。     

中国明对虾与5种虾类线粒体16S rRNA和COI基因片段的序列比较及其系统学初步研究

采用PCR扩增和序列测定等技术,对中国明对虾（Fennerpenaeus chinem如）线粒体DNA16S rRNA和细胞色素氧化酶I（COI）基因片段进行了初步研究,分别得到16S rRNA和COI 2个基因片段的碱基序列,其中16S rRNA基因片段的大小为515bp,碱基A＋T,G＋C的组成分别为66．47％和33．53％;COI基因片段的大小为472bp,碱基A＋T,G＋C的组成分别为62．50％和37．29％．在2种基因片段中,AT的组成明显高于GC的组成,这与果蝇、虾类、蟹类等无脊椎动物的16S rRNA和COI基因片段的研究结果相似．通过对中国明对虾16S rRNA和COI 2个基因片段遗传特征的研究,16S rRNA只有8处核苷酸的碱基在4个群体间表现出差异,COI基因片段中共检测出24个多态性核苷酸位点,其种内变异较低。另外,将本研究所得序列与GenBank中对虾科5个种的16S rRNA基因片段序列进行比较后,发现其聚类关系与传统分类相一致．     

Human cytomegalovirus UL97 open reading frame encodes a protein that phosphorylates the antiviral nucleoside analogue ganciclovir.

Human cytomegalovirus (HCMV, a betaherpes virus) is the cause of serious disease in immunologically compromised individuals, including those with acquired immunodeficiency syndrome. One of the compounds used in the chemotherapy of HCMV infections is the nucleoside analogue 9-(1,3-dihydroxy-2-propoxymethyl)-guanine (ganciclovir). The mechanism of action of this drug is dependent on the formation of the nucleoside triphosphate, which is a strong inhibitor of the viral DNA polymerase. Thymidine kinase, which is encoded by many of the herpesviruses, catalyses the initial phosphorylation of ganciclovir. But there is no evidence for the coding of this enzyme by HCMV, and DNA sequence analysis of the HCMV genome has shown that there is no open reading frame characteristic of a herpesvirus thymidine kinase. Here we present biochemical and immunological evidence that the HCMV UL97 open reading frame codes for a protein capable of phosphorylating ganciclovir. This protein seems to be responsible for the selectivity of ganciclovir and will be useful tool in the understanding and refinement of the antiviral activity of new selective anti-HCMV compounds.     

利迪链霉菌A02细菌人工染色体基因组文库的构建

 利迪链霉菌A02是从京郊森林土壤中分离筛选出的植物真菌病害高效生防菌,其活性产物为安全高效广谱的抗真菌剂纳他霉素。为了克隆纳他霉素生物合成基因簇和调控其表达相关的功能基因,通过基因改良的方式进行A02的定向分子改造,提高纳他霉素的效价和产量,提取了利迪链霉菌A02的基因组DNA,用Hind III和Bam HI部分酶解后,回收了97~194kb和48.5~97kb大小的高分子量DNA,与质粒载体Copycontrol pCC1BAC连接,分别构建了含有800个和1500个克隆的两个BAC文库。从文库中随机挑选20个克隆,酶切检测平均插入片段分别为133kb和65kb,空载率小于1%,假定利迪链霉菌的基因组有8×10⁶kb,计算文库基因组覆盖率分别为12.28倍和11.25倍。因此,从文库筛选到目的片段的概率达99.99%以上。     

用PCR法检测人巨细胞病毒DNA

用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）法检测患者尿液中人巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）ＤＮＡ．结果表明，自行设计合成的引物位于ＨＣＭＶ基因组早期蛋白基因区，经ＰＣＲ仪扩增一段长４３０ｂｐ的特异序列片段，对正常人基因组ＤＮＡ或其它疱疹病毒ＤＮＡ无交叉反应．此法可检测出少至１０－１６ｇ（０．１ｆｇ）的病毒ＤＮＡ．通过对３５份尿液标本的检测，比较ＰＣＲ法和组织培养法的检测结果完全一致     

以抗生素抗性为选择标记的毛壳菌种间原生质体融合

以抗生素抗性为选择标记进行角毛壳菌和球毛壳菌种间原生质体融合。角毛壳菌CH21-I-402菌株对潮霉素有抗性、对G418敏感,球毛壳菌CH08对潮霉素和G418敏感。根癌农杆菌介导的新霉素磷酸转移酶基因转化球毛壳菌,得到成功转化新霉素磷酸转移酶基因的球毛壳菌菌株,转化子对G418抗性提高3~4倍,对潮霉素仍然比较敏感。以耐潮霉素、不耐G418的角毛壳菌和不耐潮霉素、耐G418的球毛壳菌为出发菌株,以PEG6000为助融剂进行原生质体融合,用G418和潮霉素抗性进行筛选,获得再生菌株。经AFLP分析表明:再生菌株PF1、PF26为融合菌株,融合菌株菌落形态均与亲本存在明显差异。     

产气荚膜梭菌的β2毒素基因克隆及其核苷酸序列分析

利用PCR技术，从C型产气荚膜梭茵中国标准株C59-44基因组DNA中扩增出了约0．7kb的基因，并将其克隆到pGEM-T栽体上，经酶切鉴定及核苷酸序列分析表明，该基因片段的核苷酸序列与国外报道的β2毒素基因序列一致．     

Expression of human cytomegalovirus DNA polymerase in insect cells using baculovirus expression system: Purification and biochemical characterizations

Human Cytomegalovirus (HCMV) DNA polymerase gene was overexpressed in insect cells using the baculovirus transfer system. A6. 2 kb HCMV Rsr II-EcoRI DNA fragment with intact HCMV pol gene coding sequence was engineered into NheI site of vector pBlueBac under the control of polyhedrin promoter of Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV). Recombinant AcNPV carried HCMV pol gene was generated by cotransfection of Spodoptera frugiperta cell (SF21) with AcNPV DNA and baculovirus transfer vector with HCMV pol gene. Infection of SF21 cell with recombinant virus lead to the expression of 140 kD peptide of HCMV specific DNA polymerase at the level approximately 2 mg per 10⁸ cells. The polypeptide was purified from the infected SF21 cells by a series of column chromatography to homogeneity. The purified enzyme had a molecular weight of 140 kD and reacted with antiserum specific for HCMV DNA polymerase. It exhibited both 3′–5′ and 5′–3′ exonuclease activities. This enzyme is also sensitive to phosphono acetate. Ye Linbai: born in Feb. 1948. Professor. Current research interest is in Vitology and Molecular Biology Supported by Public Health Service Grants CA21773, CA15036 and AI12717 from the National Institutes of Health     

具有自主复制功能的水稻高度重复序列ARS2的结构和功能分析

对一个水稻珍汕９７Ａ不育系核ＤＮＡ来源的具有自主复制功能的高度重复顺序片段ＡＲＳ２（全长４７２０ｂｐ）进行了亚克隆构建和测序,获得了它的全顺序。