基于双功能荧光标签8-氨基1,3,6-萘三磺酸的N-连接糖基化富集方法

发展了基于双功能荧光标签8-氨基1,3,6-萘三磺酸(ANTS)选择性糖基化蛋白质标记和二氧化钛(TiO2)亲和富集的N-连接糖基化富集新方法.模式蛋白质细胞色素c、肌红蛋白、核糖核酸酶b、抗生素和α-1-抗胰蛋白酶经ANTS标记后,所有糖基化蛋白质均发出亮绿色荧光,而非糖基化蛋白质则不能观测到荧光;进一步采用TiO2对酶切产生的N-连接糖基化肽段进行富集,同时实现了中性糖肽和唾液酸糖肽的选择性富集.通过进一步分析人血清N-连接糖基化蛋白质,共鉴定到39个唯一的N-连接糖蛋白,包括了53个唯一的N-连接糖基化位点;此外,该方法与采用TiO2法直接富集以及肼化学法富集鉴定到的交叠糖基化位点数均小于40%,说明这一新方法与传统方法在糖基化肽段富集方面具有一定的互补性,有望用于复杂蛋白质样品的N-连接糖基化高效富集.     

重组毕赤酵母植酸酶N-糖基化位点质谱鉴定

为系统评估重组毕赤酵母植酸酶的N-糖基化充分性,建立了一种通过联用高效液相色谱-串级质谱来分析植酸酶氨基酸序列及N-糖基化位点的技术.分别发酵了3株基因组已整合不同植酸酶基因的毕赤酵母.发酵液上清经离子交换与凝胶过滤后获得纯化的植酸酶.使用PNGase F或Endo H脱糖基化酶处理植酸酶后,用胰蛋白酶消化脱糖基化产物.通过纳升级高效液相色谱分离胰蛋白酶切产生的肽段混合物.并在联用的串级质谱上进行肽段测序与N-糖基化位点鉴定.结果显示3种植酸酶蛋白的可检测序列覆盖率均在69%以上,且与文献报道不同,均存在糖基化位点修饰不充分的现象.本实验结果证明了高效液相色谱-串级质谱联用法检测植酸酶N-糖基化位点的有效性,并为植酸酶的糖基化研究提供了新的基础.     

N-糖酰胺酶F(PNGase F)在大肠杆菌中的表达纯化及其脱糖基化作用鉴定

N-糖酰胺酶F(PNGase F)是由革兰氏阴性菌——脑膜炎脓杆菌分泌的一种分子量为34.8 kDa的去糖基化酶.本研究通过PCR技术扩增出945 bp的N-糖酰胺酶F基因,经酶切、连接,构建了大肠杆菌表达载体pET28a-PNGase F.将pET28a-PNGase F转入大肠杆菌BL21中,16℃诱导表达及Ni柱纯化后,SDS-PAGE鉴定,获得超过95%纯度的可溶性表达的N-糖酰胺酶F.对Na+依赖的中性氨基酸转运蛋白1(SNAT1)和2(SNAT2)进行脱糖基化作用检测,结果证明:纯化的N-糖酰胺酶F对SNAT1和SNAT2具有高效的脱糖基化作用.     

同位素标记结合中性丢失扫描鉴定白蛋白早期糖基化修饰肽段

采用 [13C6] 同位素标记的葡萄糖作为标签,在体外建立非酶糖基化反应模型,并采用MALDI-TOF对模型中的糖基化人血清白蛋白(HSA)进行验证. 以高分辨率的液质联用四级杆飞行时间质谱(HPLC/Q-TOF MS)为分析平台,经过一级质谱(LC/MS)筛选糖基化肽段. 采用target MS/MS模式对筛选出的34条肽段进行分析. 运用蛋白质组学数据分析工具pFind软件对肽段的中性丢失扫描及二级质谱(LC/MS/MS)数据进行分析,最终获得16条早期糖基化修饰肽段的序列及修饰位点信息.      

GP73糖基化修饰水平可为肝癌诊断提供进一步依据

 蛋白质糖基化主要包括N-连接糖基化、O-连接糖基化,是最常见的翻译后修饰之一。N-连接糖基化分为高甘露糖型、杂合型、复杂型3 种类型。N-糖链通过GlcNAc 与蛋白质上的天冬酰胺（Asn）连接,特征序列为Asn-X-Ser/Thr（X≠Pro）,N-糖链结构的共有结构是由2 个GlcNAc和3 个Man 所构成的五糖核心。     

一种FRET多肽的酶-化学法合成

选择FITC和罗丹明类荧光分子Alexa Fluor~514作为荧光对,通过酶-化学方法合成了一种潜在的FRET多肽.首先,在OGT催化下,将N-叠氮乙酰葡糖胺(GlcNAz)通过O-糖苷键连接到FITC标记的底物八肽(YAVVPVSK)的丝氨酸羟基上;然后,将炔基标记的Alexa Fluor~514通过点击化学反应连接到GlcNAz上,得到目标化合物,并通过质谱进行了表征.     

一种FRET多肽的酶-化学法合成

选择FITC和罗丹明类荧光分子Alexa Fluor~514作为荧光对,通过酶-化学方法合成了一种潜在的FRET多肽.首先,在OGT催化下,将N-叠氮乙酰葡糖胺(GlcNAz)通过O-糖苷键连接到FITC标记的底物八肽(YAVVPVSK)的丝氨酸羟基上;然后,将炔基标记的Alexa Fluor~514通过点击化学反应连接到GlcNAz上,得到目标化合物,并通过质谱进行了表征.     

两种用于液质联用分析的蛋白质酶解处理效果比较

【目的】分析和评估两种蛋白质溶液酶解方法,为蛋白质组学研究中的大规模质谱鉴定分析建立一种稳定的样品制备技术。【方法】分别使用TEAB法(实验组A)和TFE法(实验组B)对牛血清白蛋白(BSA)进行还原、烷基化和溶液酶解,再用LTQ-Orbitrap高分辨率质谱仪采集BSA酶切肽段信息,比较两种方法得到的数据信息,分析肽段数目、可变修饰位点和蛋白质覆盖率。【结果】实验组A(TEAB法)获得36个肽段、39个修饰位点,蛋白质平均覆盖率为59.31%;实验组B(TFE法)获得27个肽段、27个修饰位点,蛋白质平均覆盖率为47.83%,实验组A的数据指标与实验组B差异显著。【结论】采用TEAB法酶切体系能实现蛋白质高效率酶切,达到获得较高肽段覆盖率的目的,可为蛋白质组学后期的质谱分析鉴定奠定实验基础。     

PHA-L4的纯化及结构分析

通过阴离子交换层析对植物血球凝集素(PHA)提取物进行组分分离、纯化和活性检测,制得了高丝裂原活性的PHA-L4糖蛋白,并利用SDS-PAGE、质谱、N-端氨基酸序列、肽质量指纹谱等分析方法对其结构进行了鉴定.结果表明,PHA-L4是由4个PHA-L蛋白亚基组成的四聚体糖蛋白,相对分子质量为120000,每个亚基N-端第12位天冬酰胺残基被糖基化,糖基化呈现微不均一性.     

MALDI-TOF MS 测定多肽和蛋白质混合物的可行性研究

考察了基体辅助激光解吸电离飞行时间质谱 (matrixassistedlaserdesorption ionizationtime_of_flightmassspectrometry,MALDI_TOFMS)测定多肽和蛋白质混合物的可行性。实验结果表明 :MALDI_TOFMS能快速地同时提供多肽和蛋白质混合物中各组分的准确相对分子质量。对于相对分子质量较小的多肽混合物 ,采用反射模式 ,多肽组分分子离子峰M H 的各同位素峰清楚地区别开来 ,达到了基线分离水平。对于 5种相对分子质量在10 4 6 5 4～ 6 6 4 31 0 0范围内的多肽和蛋白质混合物 ,采用线性检测模式 ,MALDI_TOFMS同样能够检测到各组分的分子离子。     

高效液相色谱法分离大豆蛋白肽

本文采用Alcalase碱性内切蛋白酶为工具酶水解大豆蛋白,通过实验选择最佳水解条件。采用超滤以及凝胶过滤色谱法(Sephadex G 15)分离出分子量1000以下的小肽并收集,将收集到的不同功能性目标肽段在最佳色谱条件下进行分离。     

BRC2基元的合成及与靶肽p53(171-192)的相互作用

乳腺癌易感基因2(Breast Cancer Susceptibility Gene 2,BRCA2)是能抑制细胞发生恶变的关键基因.p53蛋白是参与细胞过程的主调控蛋白,p53蛋白要想行使其功能,则需要BRCA2及其产物对p53进行调控.选择BRCA2中的BRC2重复基元,用Fmoc固相合成法合成了BRC2及其3个片段.通过反相高效液相色谱(RPHPLC)和质谱对其进行表征,得到纯度大于90%的目标肽链.利用圆二色谱法初步探究了BRC2及其3个片段与靶肽p53(171-192)的相互作用.结果表明,BRC2的3个肽片段中,片段NEVGFRGFYSAHG在BRC2肽行使其功能中起着主要的作用.     

鹿血抗氧化活性肽分子量测定及其氨基酸组成分析

分离提纯了鹿血酶解产物中的抗氧化活性肽,并用高效液相色谱(HPLC)体积排阻法(SEC)测定分子量,分析其氨基酸组成.经SephadexG-25和DEAE-52柱层析纯化,得到了带有较弱负电荷的抗氧化活性肽.HPLC分析结果表明,该抗氧化活性肽为低分子量肽类物质,且是以相对分子量为876,463,146Da为主的小肽混合物.氨基酸组成分析表明,该肽所含17种氨基酸中以亮氨酸、赖氨酸和丙氨酸的质量分数较高,分别为17.2%、12.3%和12.1%,人体必需氨基酸(缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、赖氨酸)的含量为52.7%.     

穿膜肽TAT-PTD的固相合成及其与DNA相互作用的研究

通过N-芴甲氧羰基(N-fluorenylmethoxycarbonyl,Fmoc)作为α-氨基的保护基,以逐个延伸的固相合成法合成TAT-PTD多肽,运用高效液相色谱和质谱鉴定合成多肽的纯度和相对分子质量。通过紫外吸收光谱和琼脂糖凝胶电泳阻滞实验研究合成的TAT-PTD多肽与质粒DNA相互作用,实验表明TAT-PTD多肽与质粒DNA可以通过静电作用相互吸引、靠近并结合,于是为下一步小单孢菌基因工程的细胞转导提供了依据。     

两种胰蛋白酶酶解羊肌肉总蛋白样品的质谱分析

摘要: 目的比较国产和进口两种胰蛋白酶对蛋白质的酶解效果,为后续蛋白质组学稳定研究提供依据。方法用超声破碎法提取羊肌肉组织总蛋白,经两种胰蛋白酶酶解后液相色谱串联质谱检测酶解肽段,将结果上传蛋白质序列数据库,利用质谱分析鉴定方法分析比较两种胰蛋白酶的酶解效果,并借助生物信息学工具对所得数据进行分析。结果两种胰蛋白酶酶解同种蛋白质样品产生的肽段长度86%以上均为6-18 个氨基酸,适用于质谱检测。酶解后肽段产生的质量国产胰蛋白酶优于进口胰蛋白酶,国产胰蛋白酶比进口胰酶酶解可多鉴定到19% 的蛋白质和34%的肽段。结论进口、国产的胰蛋白酶在酶解蛋白质方面均可用于质谱检测前蛋白质的酶解消化。但国产胰蛋白酶价格明显低于进口胰酶,更具应用优势。本研究为评价胰蛋白酶酶解效果提供了一种有效、全面的研究方法。     

文蛤蛋白水解制备抗氧化活性肽的研究

以文蛤蛋白为原料,通过蛋白酶水解制备抗氧化活性肽.利用体外清除DPPH活性评价酶解产物的抗氧化活性,采用超滤、葡聚糖凝胶柱层析和HPLC对相应的活性肽进行分离纯化,通过HPLC-MS进行结构鉴定.结果表明:木瓜蛋白酶水解产物的DPPH清除活性明显高于碱性蛋白酶、风味蛋白酶、中性蛋白酶和复合蛋白酶,产物质量浓度为1 mg·mL-1时,DPPH清除率为55.74%;以DPPH清除率为筛选指标,对木瓜蛋白酶酶解产物进行逐级分离,得到4个具有抗氧化活性的目的肽段,氨基酸序列分别为LNFNLEKSR(1120.3 u)、SWLRPR(814.4 u)、RIGNIISQY(1063.3 u)和LNFNLEK(877.2 u).     

Characterization of impurities in the bulk drug lisinopril by liquid chromatography/ion trap spectrometry

Two trace impurities in the bulk drug lisinopril were detected by means of high-performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry （HPLC/MS） with a simple and sensitive method suitable for HPLC/MSn analysis. The fragmentation behavior of lisinopfil and the impurities was investigated, and two unknown impurities were elucidated as 2-（6-amino- l-（l-carboxyethylamino）- l-oxohexan-2-ylamino）-4-phenylbutanoic acid and 6-amino-2-（l-carboxy-3-phenylpropylamino）-hexanoic acid on the basis of the multi-stage mass spectrometry and exact mass evidence, The proposed structures of the two unknown impurities were further confirmed by nuclear magnetic resonance （NMR） experiments after preparative isolation.     

利用十二肽库筛选心肌型脂肪酸结合蛋白特异性的亲和配体

采用噬菌体表面展示十二肽库对心肌型脂肪酸结合蛋白（H FABP）特异性亲和配体进行筛选, 经3轮筛选及序列比对后得到一个酶联免疫测定分析 (ELISA)检测阳性特征序列： W P N H H M L H K R W P. 对此序列进行肽合成, 并标记上荧光标记物芘, 经高效液相纯化、 冻干及质谱确定其分子量后制成荧光肽探针检测急性心肌梗塞病人血样, 结果均呈阳性. 结果表明, 所获得的肽探针具有较好的临床应用效果.心肌型脂肪酸结合蛋白; 噬菌体表面展示十二肽库; 亲和配体; 酶联免疫测定分析