心肌型脂肪酸结合蛋白特异性亲和配体的筛选

心肌型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)是一种低相对分子质量的蛋白质,其相对分子质量为14 000~15 000,在心肌中含量丰富.H-FABP在脂肪酸的运输、脂类的代谢、调节细胞增殖与分化等方面具有重要的作用,是检测急性心肌梗塞(AMI)的有效生物学标志物.以H-FABP为靶标,采用噬菌体表面展示随机十二肽库对H-FABP的特异性亲和配体进行了筛选,经四轮筛选得到一个ELISA检测阳性特征序列:W-P-H-Q-K-L-H-L-M-R-H-S,为临床检测急性心肌梗塞提供了一种新的方法.     

从七肽噬菌体展示库中筛选蛋白质配基

为了研究噬菌体展示技术的应用，以溶菌酶为靶分子从七肽噬菌体展示库中筛选蛋白质的高亲和力噬菌体配体，所筛选的亲和力最高的噬菌体的ELISA检测值A405nm可达0．634．通过比较亲和性噬菌体外源插入肽的DNA序列，认为基元HWWW是肽段与酶分子发生亲和的必需序列．此外，由于靶分子和高亲和性展示肽的等电点分别为11．2和6．74，因此在亲和环境中携带异种电荷，利于亲和吸附的发生，而此时低亲和性展示肽与靶分子携带同种电荷，阻碍了亲和吸附．同时，高亲和性肽段HWWPAS和与其有较高同源性的肽段HWTWWNL都有适中的疏水性，这有利于肽与靶分子表面的疏水位点相互作用从而产生亲和吸附．     

尿激酶短肽抑制剂的初步研究

以尿激酶为目标蛋白， 在噬菌体表面展示六肽库中对尿激酶的短肽类抑制剂进行了三轮特异性筛选. 提高噬菌体与尿激酶的比例及缩短作用时间从而提高筛选压力后， 与尿激酶亲和结合的噬菌体得到富集. 通过对第三轮筛选到的重组噬菌体的DNA序列分析， 获得一组相对保守的肽序列. 相应的合成短肽 NEPKAN 和VSPKVL 对尿激酶的抑制常数分别为32.5 μmol/L和88.6 μmol/L.     

骨髓间充质干细胞亲和肽的筛选

采用噬菌体肽库技术，用分离培养的大鼠骨髓间充质干细胞筛选噬菌体环七肽库，通过酶联免疫吸附实验挑选出亲和性强的克隆.测序分析相应的基因组成，推导多肽序列，获得骨髓间充质干细胞高亲和性多肽，并合成FITC标记的亲和肽（FITC-CSTNPKVLC），流式细胞仪检测结果显示，合成多肽对筛选细胞具有良好的亲和力．     

心肌检测标志物--肌红蛋白分离纯化及亲和配体的研究

肌红蛋白主要存在于心肌和骨骼肌中,具有携带氧并将其分配到生物体各个部位的作用.研究表明,心血管病人发病早期,心脏中的肌红蛋白会大量释放入血,使其成为检测急性心肌梗死的良好标志物.采用HR100凝胶过滤层析和DEAE-52离子交换层析技术,从猪心中对肌红蛋白进行了分离与纯化,后经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,得到了纯化的肌红蛋白,并利用Ph.D-7噬菌体展示肽库试剂盒对肌红蛋白特异性亲和配体进行了筛选,最终得到其特异性亲和配体序列,从而使其试剂盒的研制与应用成为可能.     

HPV-58型E7蛋白抗原模拟表位的筛选及分析

利用该实验室成熟的噬菌体随机十二肽库筛选平台,对HPV-58型E7蛋白单克隆抗体株4C4a、6C7a进行3轮亲和筛选,得到2组、各8个阳性噬菌体克隆.阳性噬菌体氨基酸序列用以模拟单抗(靶蛋白)特异性识别的HPV-58型E7蛋白的抗原表位.将测得的阳性噬菌体多肽序列及HPV-58型E7蛋白氨基酸序列进行生物信息学分析后,进行线性序列比对及构象性表位预测及分析.构象性表位的预测借力于EpiSearch Server和Pepitope Server,对构象性表位匹配及簇的寻找提供有力支持,也为早期诊断及研制多肽疫苗提供参考.     

异柠檬酸裂解酶肽类抑制剂的优化筛选

利用噬菌体肽库筛选与计算机模拟分子对接技术, 优化异柠檬酸裂解酶肽类抑制剂的筛选. 先通过噬菌体肽库筛选出与异柠檬酸裂解酶（ICL）具有高亲和力的结合肽, 再利用Discovery Studio 2.1模拟多肽与ICL蛋白晶体（1F8I）的分子对接, 最后用Fmoc固相合成法合成多肽, 并对其生物活性进行检测. 实验结果表明, 通过噬菌体肽库筛选得到了29条七肽序列, 其中12条可与ICL蛋白晶体成功对接. 体外生物活性检测结果显示, 得到的12条七肽均对ICL的活性有明显抑制作用（抑制率均超过50%）.     

利用噬菌体展示筛选结合水稻条叶枯病毒S蛋白的短肽

利用噬菌体展示技术在随机7肽库中筛选到结合水稻条叶枯病毒（rice stripe virus ,RSV）病害特异蛋白（stripe disease-specific protein,S蛋白）的6个短肽,并进行了序列测定,ELISA结果表明,6个短肽和S蛋白具有一定的亲和能力,筛选到的短肽对今后S蛋白功能分析、转基因抗RSV和水稻条叶枯病的诊断提供了条件。     

应用毛细管电泳表征噬菌体与丹酚酸B的相互作用

基于Hummel-Dreyer毛细管电泳方法研究经噬菌体展示库生物淘洗亲和筛选出的噬菌体和丹酚酸B之间的结合作用,结合系数由PRISM软件中Scatchard方程曲线拟合计算得出.实验结果表明,筛选出的该噬菌体克隆的表面蛋白和丹酚酸B具有特异性的结合作用,也说明利用毛细管电泳测定噬菌体和丹酚酸B的结合系数是可行的.     

ICAM-1特异结合肽的淘选与性质研究

利用噬菌体展示载体pCANTAB5G8构建了随机十五肽库,根据转化率计算库容量为1.36×108.用PCR-SSCP检验了库的异质性.以固相包被亲和淘选的方法,经过4轮淘选和ELISA分析,得到了5个可与重组人细胞间粘附分子1(ICAM-1)特异结合的噬菌体克隆,对所展示的十五肽进行了序列分析.其中活性较高的噬菌体展示十五肽与ICAM-1的亲和常数约为7.87 ×107.     

粉尘螨Der f4基因的克隆和蛋白分子特征分析

从深圳地区采集粉尘螨纯培养,提取总RNA,根据香港中文大学合成的尘螨基因序列并设计的引物,RT-PCR扩增出Der f4基因,克隆到pUC57载体后测序和进行生物信息学分析.将该目的基因克隆到pET-28a表达载体上得到重组质粒pET-28a-Der f4.用生物软件分析尘螨变应原Der f4序列. RT-PCR获得目的基因Der f4 cDNA全长为1593 bp.推测编码蛋白由526个氨基酸组成,生物信息学分析表明,Der f4具有多种磷酸化位点,含有信号肽,为疏水性蛋白,包含淀粉酶抑制剂功能结构域.获得Der f4基因全长,其编码的细胞外疏水性蛋白可能具有淀粉酶抑制剂活性.     

sFcγRⅡb蛋白结合肽的筛选与鉴定

FcγRⅡb是免疫球蛋白G受体( FcγR)中唯一的抑制型受体,在免疫反应的负性调节方面发挥重要作用.为了筛选sFcγRⅡb的蛋白结合肽,以重组sFcγRⅡb蛋白为靶分子,采用噬菌体肽库展示技术对sFcγRⅡb结合肽进行筛选.利用ELISA鉴定每轮洗脱噬菌体与sFcγRⅡb蛋白亲和力,经过4轮筛选,挑取40个噬菌体克隆进行序列测定,获得28种不同的12肽序列.经ELISA法鉴定噬菌体与sFcγRⅡb蛋白结合活性,得到sFcγRⅡb蛋白高特异性、高亲和力结合肽FHKMPWYMSMYY,为进一步研究FcγRⅡb的作用机制和探索结合肽的功能提供实验基础.     

狗小肠新生物活性肽的分离纯化及结构测定

研究了一种新的胃肠肽的分离纯化及其部分氨基酸序列测定．沸水处理后的狗小肠经醋酸提取、海藻酸吸附、盐酸洗脱、氯化钠盐析和乙醇沉淀，再经Sephadex G-25（fine）层析和两次RP-HPLC分离，从中纯化出一个热稳定多肽．用Tris-Tricine-SDS-PAGE鉴定其相对分子质量约为4 kD．该肽经胰酶水解，产物片断经RP-HPLC分离后，取其中之一主峰经CapLC-ESI-MS-MS（Q-TOF2）质谱仪测定氨基酸顺序为：T-E-Y-T-A-L-N-V-L-A-T-T-E-E-N-G．蛋白质数据库（Gen Bank和SWISS-PROT）查寻证明：此肽为首次发现的新多肽，正在进一步研究其生物学功能．     

粉尘螨Der f14基因克隆与分子特征的分析

从纯培养的粉尘螨中,根据本课题组前期合成的尘螨基因序列,将扩增的Der f14分别克隆到pUC57载体中,经扩增后用SmaI双酶切将目的片段连接到 pET-28a表达载体上得到重组质粒pET28a- Der f14.在线软件ExPaSy,NCBI网站对测序结果进行分析.分析结果表明:获得的目的基因Der f14 cDNA全长为5 013 bp.编码蛋白由1 666个氨基酸组成.粉尘螨Der f14与屋尘螨序列比对同源性达95;,信号肽序列存在1～18个氨基酸,二级结构是由a螺旋(35.83;)﹑延伸链(17.17;)﹑无规则区(47;)组成.目的蛋白是一种卵黄蛋白原.     

糯谷猪解耦联蛋白3和心脏型脂肪酸结合蛋白在骨骼肌中的表达和定位

 为了探索解耦联蛋白3（uncoupling protein 3,UCP3）和心脏型脂肪酸结合蛋白（heart fatty acid binding protein,H FABP）对骨骼肌细胞中脂肪代谢的调节作用,采用RT PCR和免疫组织化学方法,研究了地方猪品种糯谷猪骨骼肌细胞中UCP3和H FABP基因的表达和细胞内定位,并与外二元杂交猪相比较,结果表明,糯骨猪的肌细胞及其细胞间隙较大,血清游离脂肪酸和肌内脂肪含量较高; 但UCP3和H FABP基因表达量和蛋白分布密度均较杂交猪低。说明糯谷猪肌细胞中UCP3和H FABP的表达量较少,肌细胞中ATP的生成效率较高,对脂肪酸供能的依赖性较低,脂肪得以贮存。提示UCP3和H FABP主要以蛋白量的变化参与猪骨骼肌细胞的脂肪代谢调节,从而影响地方猪种的肉质等性状。     

Cloning, prokaryotic expression,purification and sequence analysis of 20S proteasome subunit gene from T.harzianum

The gene encoding the 20S proteasome subunit（PR29） was cloned from cDNA library of Trichoderma harzianum and expressed in Escherichia coli BL21 （D3） using a pET-28a expression system. The molecular weight of the protein was found to be approximately 29 kDa, as estimated by SDS-PAGE on gels. The target protein was insoluble when induced at 22℃ with 0.4 mmol/L IPTG, while dissoluble if induced at 37℃ with 0.8mmoL/L IPTG. The expressed product was purified through Ni-magnetic beads His Bind. The purity of the fusion protein reached above 80%. The entire eDNA sequence consisted of 1094 bp with 173 and 135 bp in 5＇ and 3＇ untranslated regions respectively. The gene encoding 261 amino acids has no signal peptide sequence. These results could provide a basis for validating the func-tions of PR29. It also provided a preliminary indication for further study of the mechanism and function of proteasome, and more information of proteasome mechanism in T.harzianum could be obtained.     

甲/戊型肝炎病毒重组抗原基因的克隆及表达

 将甲肝病毒vp1编码基因(aa 24~171)和戊型肝炎病毒ORF2基因(aa 431~615)通过一段编码柔性甘氨酸链(Gly4 Ser Gly4)的基因片断连接,获得编码HAV/HEV融合蛋白基因(AEAg342).将该融合基因插入质粒pBV220,构建表达质粒pBV220-AEAg342.将pBV220-AEAg342转化入大肠杆菌BL21中进行表达,表达量约占菌体总量的20%,经离子交换层析纯化,目的蛋白纯度达90%以上.Western blot证实该蛋白能与甲肝及戊肝患者阳性血清发生特异性反映,为进一步开发双价疫苗和联合诊断试剂奠定了一定基础.     

人ZP3B-细胞表位嵌合肽DNA的设计和合成

目的：设计和合成适合在昆虫细胞中表达的一个人ＺＰ３ Ｂ细胞表位的ＤＮＡ序列。方法：根据国外的研究基础，设计由人ＺＰ３的Ｂ细胞表位肽段和外源Ｔｈ细胞表位肽段串联而成的４５肽嵌合肽序列，并根据昆虫细胞对密码子的偏爱性设计出该嵌合肽的ＤＮＡ序列。然后人工合成该嵌合肽的ＤＮＡ链，并克隆到ＰＵＣ１８载体上。结果：通过酶切分析和测序证明，合成的ＤＮＡ与所设计的嵌合肽ＤＮＡ序列一致。结论：按设计合成了人ＺＰ３的