人源抗HBsAg单链抗体与干扰素嵌合基因的构建及表达

采用重叠PCR技术，将人源性抗HBsAg单链抗体基因与干扰素γ基因用柔性肽段碱基连接成单一基因。序列测定结果表明，克隆的基因与理论上的一致，并将此基因成功构建到酵母表达载体pPICZa上，进而转化到巴斯德毕赤酵母(Pichia Pastoris)X33中。筛选出的菌落经甲醇诱导培养，对上清液进行SDS—PAGE和WESTERN BLOT分析，在42000处可见蛋白表达带，这为进一步纯化目的蛋白和提高目的蛋白表达水平奠定了基础。     

重组海葵毒素AP-b毕赤酵母表达体系的建立及其鉴定

按照毕氏酵母的偏爱密码子,设计并合成了海葵毒素AP-b的基因序列,将合成基因序列通过一系列操作导入毕氏酵母表达载体pPICZa中,以电穿孔方法转化毕氏酵母菌株X33,通过PCR法鉴定,筛选出能够表达重组海葵毒素的酵母菌株.结果表明,构建出海葵毒素AP-B毕赤酵母真核表达体系,并鉴定出4株含有海葵毒素基因的毕赤酵母工程菌.     

重组植物AHA2蛋白的真核表达及纯化

AHA2蛋白位于植物细胞质膜上,该蛋白在原核蛋白表达体系中无法重组表达.已经报道的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)表达体系操作复杂,成本高昂.本文将拟南芥aha2基因(全长2984bp)插入真核表达载体pPICZαA中,线性化质粒pPICZαA-aha2,电转化毕赤酵母X33细胞,通过同源重组获得工程菌.以0.5%甲醇诱导表达72h后,收获细胞.冷冻研磨细胞,离心并收集上清进行亲和层析和分子筛纯化.SDS-PAGE分析结果显示,目的蛋白为97kD的条带.本研究成功的在毕赤酵母X33细胞中实现了拟南芥AHA2蛋白的表达和纯化.     

重组人卵ZP3肽段在毕赤酵母中的表达

目的:用毕赤酵母(Pichia pastoris)表达人透明带hZP3片段,研究其抗生育作用.方法:设计特定引物从hZP3全长序列中PCR扩增794～1282nt基因片段,将扩增片段克隆到酵母表达载体pPICZα上, 构建成重组质粒pPICZα-hZP3CT,线性化后的重组质粒导入毕赤酵母中,筛选出高拷贝菌株,甲醇诱导目的蛋白表达.用SDS-PAGE 和Western blotting 分析表达产物.结果:成功构建酵母表达载体,并在酵母菌株X-33中诱导表达重组蛋白.重组蛋白可以与鼠抗重组人卵透明带hZP3融合肽段的抗血清发生特异结合,表明目的基因成功表达.结论:重组hZP3蛋白已在酵母中成功表达,目的蛋白能与相应的抗体结合.     

Neuritin毕赤酵母分泌表达系统的构建

为构建Neuritin毕赤酵母分泌表达系统,进一步得到高纯度的具有天然活性的Neuritin蛋白提供实验基础。采用人工合成去除信号肽的neuritin基因并在N端引入His标签序列,两端引入Eco RⅠ和NotⅠ酶切位点,克隆至p PIC9K分泌型表达载体。重组质粒经PCR与测序鉴定正确后电击转化至毕赤酵母GS115感受态细胞中,经MD平板与G418平板筛选阳性重组子,抽提毕赤酵母基因组PCR鉴定重组质粒的插入。结果显示,p PIC9K-neuritin重组质粒经测序鉴定完全正确,电转后成功插入毕赤酵母基因组中。由此可知,成功构建Neuritin的毕赤酵母分泌表达系统。     

乙肝表面抗原在分泌型毕赤酵母中的表达及纯化

目的对分泌型毕赤酵母中表达乙肝表面抗原并进行亲和层析纯化。方法从已确诊的乙肝患者阳性血清中提取乙肝病毒DNA,PCR扩增乙肝病毒表面抗原编码基因S,将其插入含有仅分泌信号肽序列和6个组氨酸纯化标签的毕赤酵母表达载体pPICZα,成功构建了重组表达载体pPICZα—HBVs。电转化酵母菌株GS115,得到重组乙肝表面抗原S的酵母表达菌株。结果诱导培养基BMMY中甲醇终浓度为1％,诱导表达48h重组蛋白表达量及抗原性达到最高。非变性条件下亲和层析纯化后,薄层扫描分析得到纯度超过95％,表达量约为2mg／L的重组蛋白。结论Western-blot和ELISA分析表明,所得产物为乙肝表面抗原S蛋白,其纯度和产量足以免疫小鼠制备单克隆抗体。     

人源EC-SOD在毕赤酵母中的构建与表达

利用基因工程技术构建表达载体并电转化至毕赤酵母中,成功实现人源EC-SOD在毕赤酵母X33中的表达.重组蛋白经盐酸羟胺法测得25 mL摇瓶发酵液上清酶活为508 U·mg~(-1),5 L发酵液上清酶活为909U·mg~(-1).发酵液上清用硫酸铵沉降后,使用DEAE弱阴离子交换树脂初步分离纯化出较纯的EC-SOD,测得比活为1 700 U·mg~(-1),并进行氯化硝基四氮唑蓝(NBT)活性定性染色.结果表明,毕赤酵母成功胞外表达具有一定活性的SOD蛋白.     

人白血病抑制因子基因在酵母中的融合表达

用PCR突变的方法使人白血病抑制因子基因的终止密码子缺失,并与质粒pPICZαA上的myc表位及6个组氨酸处于同一读码框,构建融合表达载体pPICZαA-hLIF^M。通过氯化锂化学转化法使表达载体整合到毕赤巴斯德酵母X－33的基因组DNA中,转化子经甘油增菌和甲醇诱导,实现了hLIF基因在毕赤酵母表达载体系统中的表达。SDS－PAGE检测和Western blot分析结果表明在相对分子质量为61000处有一条人白血病抑制因子特异蛋白带。凝胶薄层扫描分析结果显示表达的目的蛋白占培养液上清总蛋白的33．3％。且该表达产物具有抑制小鼠畸胎瘤细胞F9克隆形成的活性。     

表达人胰岛素前体的毕赤酵母菌株的构建

将人胰岛素前体 (HIP)基因插入到毕赤酵母Pichiapastoris的分泌表达质粒pPIC9K中,得到分泌表达质粒pPIC9K/HIP并用电转化法转化P.pastorisGS115。筛选出整合型His⁺Mut^s 菌株,进一步用G418筛选获得高拷贝转化子。经诱导培养后,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)证明HIP在毕赤酵母中能有效分泌表达。对毕赤酵母中外源基因的稳定性进行了研究,结果表明外源基因在毕赤酵母中很稳定.     

α-1,6-葡聚糖酶基因的克隆及在毕赤酵母中的表达

根据朱黄青霉(Penicillium minioluteumHI-4)α-1,6-葡聚糖酶的基因序列,人工合成α-1,6-葡聚糖酶基因并将其插入毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pPICZαA,PCR和双酶切验证结果均表明成功构建了重组质粒pPICZαA-Dex.重组质粒经SacⅠ线性化后整合到毕赤酵母X33基因组中进行表达.摇瓶发酵表明,重组毕赤酵母经甲醇诱导120 h产酶活力达到最高值29.2 U/mL,SDS-PAGE结果显示在67 ku附近有明显的条带,与α-1,6-葡聚糖酶理论分子质量相符合.