松材线虫拮抗细菌的筛选和鉴定

为了筛选对松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)具有较高杀线活性的拮抗细菌,从马尾松林中分离获得了230株细菌,并从中筛选出8株对松材线虫具有较高杀线活性的细菌,其中JK-JS3菌株对松材线虫的杀线活性最高.将该细菌培养滤液分别稀释2倍、4倍、10倍处理松材线虫,72h后线虫的死亡率均达到100%;线虫死亡后虫体消解,消解率分别为100%、97.8%、96.4%.测定了该细菌培养滤液对香蕉穿孔线虫(Radopholus similis)和水稻干尖线虫(Aphelenchoides besseyi)等植物线虫的杀线活性,结果表明对不同种的线虫杀线活性有差异.该菌株培养滤液对松材线虫和小杆线虫(Rhabditis sp.)的杀线活性最高,其余杀线活性从高到低依次为拟松材线虫(Bursaphelenchus mucronatus)、腐生线虫(Panagrellus redivivus)、香蕉穿孔线虫和水稻干尖线虫.形态特征和革兰氏染色观察,该细菌为革兰氏阳性菌、产芽孢、具有周生鞭毛;经Biolog细菌鉴定仪进一步鉴定该细菌为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens).     

两株松材线虫拮抗细菌的筛选和鉴定

【目的】筛选对松材线虫具有较高杀线活性的拮抗细菌。【方法】以分离自南京、洛阳、上海的松树茎部的137株内生细菌为研究对象,采用培养滤液和菌悬液浸渍法对这些菌株进行杀线活性的测定,并对筛选的高效拮抗细菌进行菌种鉴定。【结果】通过培养滤液浸渍试验筛选出3株细菌对松材线虫有较高的杀线活性,使用3种菌滤液处理线虫48 h后,线虫死亡率均达到100%,其中菌株LYMC-3的培养滤液还可使线虫虫体出现消解。将3株菌的培养滤液分别稀释2倍、4倍和10倍后处理松材线虫,随稀释倍数的增加,培养滤液的杀线活性逐渐降低。处理线虫48 h后,菌株LYMC-3的10倍稀释滤液与其他两株菌滤液相比对线虫的致死率最高,为94.7%; 在菌悬液浸渍试验中筛选出菌株NJSZ-13对松材线虫有较高杀线活性,10⁵ cfu/mL 浓度的菌悬液处理线虫48 h后,线虫死亡率达81.5%。通过对LYMC-3和NJSZ-13菌株的形态特征、生理生化特征、Biolog鉴定和16S rDNA序列以及系统发育分析,确定菌株LYMC-3、NJSZ-13分别为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)和蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)。【结论】从松树体内筛选到两株对松材线虫有高效拮抗活性的菌株LYMC-3和NJSZ-13,对生物防治松材线虫病具有潜在的应用价值。     

细菌XSJS3对松材线虫杀线活性的测定

细菌XSJS3是一种新发现的对松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)具有较高杀线活性的细菌,试验比较了细菌XSJS3培养液、细菌培养液滤液及含菌体水溶液对松材线虫的杀线活性,结果发现细菌菌体本身对松材线虫无杀线活性,杀线活性物质存在于细菌的培养液滤液中。通过对该细菌培养液滤液对松材线虫致死过程的观察发现:松材线虫接触该细菌培养液滤液30min后就表现为行动迟缓;在5h后所有虫体均不活动,针刺无反应;24h后部分僵直虫体出现局部膨大,且膨大部位出现体液外渗而虫体最终被消解。对不同培养时间的细菌XSJS3滤液杀线活性的比较试验表明:该细菌分泌的杀线物质在10d内随培养时间的延长而含量增加,杀线活性逐渐提高,不同培养时间下滤液的杀线活性差异明显;但培养15d后,稀释10倍的滤液对松材线虫杀线活性比培养10d时同样滤液的杀线活性则略有下降,但差异不明显,因此获得该细菌分泌的杀线物质较理想的培养时间为10d。将细菌XSJS3培养液滤液进行不同温度的热处理后测定对松材线虫的杀线活性,结果表明引起松材线虫死亡和消解的物质是两个不同物质,存在于培养液滤液中的对松材线虫有杀线活性的物质是热稳定的,而引起松材线虫虫体消解的物质是热不稳定的。     

具杀松材线虫活性的解淀粉芽孢杆菌 JKJS3的培养条件

解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)JKJS3菌株分离自马尾松林,对松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)具有较高的杀线活性。为进一步开发和应用该菌株,以松材线虫为测试靶标,对JKJS3菌株分泌杀线活性物质的适宜培养基和培养条件进行了研究。结果表明：不同碳源组分的培养基对JKJS3菌株分泌杀线活性物质无显著影响,而不同氮源对其有显著影响,其中以氮源为5 g/L牛肉膏和6 g/L蛋白胨组成的培养基所获培养滤液的杀线活性最高,为实验室条件下菌株分泌杀线活性物质的最适培养基;JKJS3菌株的最佳培养条件为初始pH=7、培养温度为37 ℃和无光照振荡培养;该菌株分泌杀线活性物质较理想的培养时间为10 d。     

松树寄生线虫的收集与保存

枯死松树体内寄生线虫种类较多,笔者共收集了线虫资源212个株系.按线虫种类分,包括松材线虫171个株系,拟松材线虫22个株系、霍夫曼尼伞滑刃线虫5个株系、薄荷滑刃线虫1个株系、大核滑刃线虫8个株系、长尾属线虫3个株系以及外滑刃科线虫2个株系,松材线虫收集率为80.7%.按线虫来源分,包括中国线虫198个株系、日本线虫10个株系、美国线虫2个株系、加拿大和韩国线虫各1个株系,中国线虫收集率为93.4%.将212个线虫株系用灰葡萄孢菌培养保存,其中173个株系松材线虫、5个株系拟松材线虫及其他线虫5个株系还采用了DNA-20℃和-80℃保存.这是我国首次大规模保存松树线虫资源.     

蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株对松材线虫产卵和繁殖的影响

【目的】 已有研究表明蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)NJSZ-13菌株对于马尾松具有促生作用,且菌悬液的促生效果最佳。为了进一步解析和评价该菌对松材线虫的生防机理,在虫液和卵液中加入NJSZ-13菌株,研究该菌株对松材线虫的杀线效果以及对其产卵、卵孵化和繁殖量的影响。【方法】 首先通过离心将蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株分成菌悬液、发酵液和发酵滤液,并调配成原液、5、10、100和1 000倍的稀释液,其中菌悬液和发酵液的原液浓度为3×10⁸ cfu/mL,以无菌水和NB培养基为对照。①用浸渍法测定NJSZ-13菌株在24 h和48 h对松材线虫的杀线效果。②挑取10对生长良好的雌雄4龄幼虫于1.5 mL离心管,用NJSZ-13菌株处理24 h后将虫卵从离心管冲洗到35 mm培养皿中,统计各处理的产卵量。③在35 mm小皿中加入1 mL无菌卵液(约含400个卵)和NJSZ-13菌株,统计12、24和36 h的孵化虫数。④将100 μL线虫液(含500条松材线虫)与100 μL NJSZ-13菌株混合接入60 mm培养皿的灰葡萄孢中,在25 ℃培养箱培养5 d,用贝尔曼法分离线虫并计数。【结果】 ①NJSZ-13菌株的发酵液和发酵滤液原液处理24 h后的杀线率即高达100%,而其菌悬液原液处理48 h后的杀线率仅为81.47%。②NJSZ-13菌株原液能极显著地抑制松材线虫产卵,随着稀释倍数的增大,这种抑制作用逐渐减小。③NJSZ-13菌株的10倍稀释液处理松材线虫卵,在12 h时极显著地抑制卵的孵化,在24 h时仍达到显著水平,在36 h时仅发酵液和发酵滤液有显著的抑制作用。100倍稀释液处理12 h时,发酵液和发酵滤液相对于对照有显著差异,其他处理时间点均无显著差异。④NJSZ-13菌株原液和5倍稀释液处理松材线虫,其繁殖力与对照组有显著差异(P<0.05)。10倍稀释液处理松材线虫时,菌悬液对线虫繁殖力无明显的影响,而发酵液和发酵滤液与对照有显著差异。【结论】 蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株的菌悬液、发酵液、发酵滤液均对松材线虫有杀线作用。其中,发酵液和发酵滤液的杀线效果更显著;NJSZ-13菌株能抑制松材线虫的产卵、卵孵化和繁殖,同样发酵液和发酵滤液的抑制效果较菌悬液明显。     

松材线虫实时PCR检测技术

根据松材线虫核糖体DNA内部转录区设计了一对特异引物F11/R11与探针TaqMan-11,构成松材线虫实时PCR检测方法.采用该检测方法对分离自枯死松树体内的松材线虫、拟松材线虫、大核滑刃线虫、霍夫曼尼伞滑刃线虫和长尾属线虫进行检测.结果显示,所有松材线虫株系都能够检测到荧光信号,而拟松材线虫、大核滑刃线虫、霍夫曼尼伞滑刃线虫、长尾属线虫以及对照均没有检测到荧光信号.表明探针TaqMan-11与引物组合对松材线虫具有很强的特异性.此外,利用检测方法,在10μL的反应体系中,最少可以检测到0.005 Pg的松材线虫DNA含量.实时PCR也可以成功地检测出单条松材线虫.     

福建省松枯死木检测鉴定方法与结果分析

采用常规检测法(贝尔曼漏斗法)研究了松枯死木中的线虫种类、相互存在关系和检出情况。初步将线虫分为4大类:松材线虫、拟松材线虫、伞滑刃属其它线虫和非伞滑刃属线虫。其在枯死木中的存在关系有14种类型。(1)松材线虫;(2)松材线虫、拟松材线虫和非伞滑刃属线虫;(3)松材线虫和伞滑刃属其它线虫;(4)松材线虫和非伞滑刃属线虫;(5)松材线虫、伞滑刃属其它线虫和非伞滑刃属线虫;(6)松材线虫、拟松材线虫、伞滑刃属其它线虫和非伞滑刃属线虫;(7)拟松材线虫;(8)拟松材线虫和伞滑刃属其它线虫;(9)拟松材线虫和非伞滑刃属线虫;(10)拟松材线虫、伞滑刃属其它线虫和非伞滑刃属线虫;(11)伞滑刃属其它线虫;(12)伞滑刃属其它线虫和非伞滑刃属线虫;(13)非伞滑刃属线虫;(14)无线虫。2008~2010年,松材线虫检出率分别为34.59%、28.21%和24.19%,呈逐年下降趋势;拟松材线虫检出率为14.04%、16.03%和0.8%。每年松材线虫检出率与季节的关系差异不明显,但常年基本上都有松材线虫,为枯死木的取样增加了难度。应用指示剂1号进行快速检测,结果表明,对于松材线虫病木,其准确率达100%。随着时间流失,松材线虫在枯死木中慢慢消失,影响常规检测和快速检测结果,所以尽量在松树枯死初期取样。     

施用松材线虫内生寄生真菌Esteya vermicola控制松萎蔫病

Esteya vermicola是首例发现的杀松材线虫的内生真菌。最近,韩国学者从土壤中分离出了E.vermicola的多个新菌株。新菌株具有特异的孢子细胞和孢子,只有其中新月形孢子能黏附在线虫虫体上诱导其感染。研究表明该真菌是由甲虫携带侵染松树的,可在4~5 d内杀死几乎所有测试的松材线虫。温室试验和2 a的林间试验发现接种的真菌在松树内生长并感染松材线虫。结果证明该菌能有助于松树抵抗松材线虫的侵染。目前正在进一步研究和评价其作为商业生物防治方法的前景。     

福建省松枯死木检测鉴定方法与结果分析

采用常规检测法（贝尔曼漏斗法）研究了松枯死木中的线虫种类、相互存在关系和检出情况。初步将线虫分为4大类：松材线虫、拟松材线虫、伞滑刃属其它线虫和非伞滑刃属线虫。其在枯死木中的存在关系有14种类型。（1）松材线虫;（2）松材线虫、拟松材线虫和非伞滑刃属线虫;（3）松材线虫和伞滑刃属其它线虫;（4）松材线虫和非伞滑刃属线虫;（5）松材线虫、伞滑刃属其它线虫和非伞滑刃属线虫;（6）松材线虫、拟松材线虫、伞滑刃属其它线虫和非伞滑刃属线虫;（7）拟松材线虫;（8）拟松材线虫和伞滑刃属其它线虫;（9）拟松材线虫和非伞滑刃属线虫;（10）拟松材线虫、伞滑刃属其它线虫和非伞滑刃属线虫;（11）伞滑刃属其它线虫;（12）伞滑刃属其它线虫和非伞滑刃属线虫;（13）非伞滑刃属线虫;（14）无线虫。2008~2010年,松材线虫检出率分别为34.59%、28.21%和24.19%,呈逐年下降趋势;拟松材线虫检出率为14.04%、16.03%和0.8%。每年松材线虫检出率与季节的关系差异不明显,但常年基本上都有松材线虫,为枯死木的取样增加了难度。应用指示剂1号进行快速检测,结果表明,对于松材线虫病木,其准确率达100%。随着时间流失,松材线虫在枯死木中慢慢消失,影响常规检测和快速检测结果,所以尽量在松树枯死初期取样。     

解淀粉芽孢杆菌HZM9菌株发酵液的抑菌谱及稳定性测定

【目的】将前期分离到的1株具有高效植物促生作用和生物防治作用的解淀粉芽孢杆菌HZM9开发为可以进行田间应用的菌剂。【方法】首先以10种土传病害病原菌为指示菌,用生长速率法测定了HZM9菌株发酵液对各病菌的抑制作用; 又以榉树枯萎尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)为指示菌,测定了发酵液在不同条件下的稳定性。【结果】供试的10种土传病害病原菌经菌株HZM9发酵液处理后,菌丝生长均受到明显的抑制,特别是对尖孢镰刀菌和大豆菌核(Sclerotinia sclerotiorum)的抑菌率均达90%左右。菌株HZM9发酵液有很好的热稳定性,温度升至80 ℃后其抑菌作用变化十分微弱,抑菌率仍然保持在80%以上; 100 ℃处理30 min抑菌率会下降到66.55%,100 ℃处理120 min,抑菌率仍能达到58.78%; 在普通光照和紫外线照射后可以保持稳定的抑菌活性,在pH 5～9和蛋白酶的处理后抗菌活性也很稳定; 在4 ℃下可以持续储藏150 d。【结论】HZM9具有广谱抑菌活性和很好的稳定性,能够适用于土传病害的生物防治。     

松材线虫快速检测试剂盒研制

采用引物对K09F2/R对枯死松树内分离的松材线虫、拟松材线虫及其他线虫进行检测,结果表明,所有松材线虫株系均扩增出一条340 bp的清晰、明亮的条带.而拟松材线虫、其他线虫均无扩增产物.利用引物对K09F2/R构建了松材线虫检测试剂盒.采用该试剂盒可使整个检测过程不超过2.5 h;该试剂盒检测灵敏度为1/7 条线虫,达到了对幼虫成功鉴定的目的,且检测结果便于判读,检测费用较低.     

杀线虫活性菌的筛选、分离与初步鉴定

从河南南阳宝天曼森林土壤样品中分离纯化细菌,以对线虫Caenorhabditis elegans的杀灭作用为筛选模型,从128株细菌中共筛选到3株杀线虫活性较高的细菌,编号分别为B、C、D。当作用于线虫24h后,它们对线虫的致死率分别为20％、25％、97％。然而发现当B和C共同作用于线虫时,致死率大为提高（约为90％）,说明二者在杀线虫方面有协同作用。通过培养观察菌落形态,革兰氏染色;提取各菌种基因组,扩增16SrDNA测序,系统发育分析,确定这三株菌的鉴定结果为：菌株B与Bacillus subtilis strain xfchu2的同源性较高,为96．46％,菌株C与Stenotrophomonas maltophilia strain QT24的同源性较高,为92．75％。菌株D与荧光假单胞菌属的同源性较高。     

不同真菌对松材线虫繁殖及致病力的影响

利用3年生黑松为接种材料,研究在9种不同真菌上取食的松材线虫的繁殖和致病力变化。结果表明,真菌对松材线虫的繁殖和致病力有显著影响。松材线虫在9种真菌上取食后,松材线虫繁殖力和致病力从大到小而依存的真菌依次为灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、拟盘多毛孢(Pestalotiopsis sp.)、盘多毛孢(Pestalotia sp.) 、拟茎点霉(Phomopsis sp.)、茎点霉(Phoma sp.)、头孢菌(Cephalosporium sp.)、交链孢(Alternaria sp.) 、炭疽菌(Colletotrichum sp.)、长喙壳(Ceratocystis sp.)。实验表明松材线虫的繁殖力与其致病力变化相一致。     

松材线虫低温冷冻保存研究

为满足大量松材线虫虫株长期保存的需要,对其低温冷冻保存技术进行了研究。试验比较了不同种类及浓度冷冻保护剂对松材线虫在低温冷冻保存时的保护效果,以及冷冻线虫繁殖力与致病力的变化。结果表明:使用15%甘油和4%DMSO作为冷冻保护剂,经-80℃保存1 d后,松材线虫存活率分别为(39.4±6.6)%和(37.5±21.8)%,且冻存10 d、1个月后均没有显著性下降。与未冷冻的线虫相比,冷冻线虫的繁殖力与致病力均未发生改变。     

蓝花楹内生拮抗细菌筛选及对茎腐病的防治研究

【目的】筛选蓝花楹茎腐病的内生拮抗细菌,并探讨其生物防治作用。【方法】采用稀释平板法从健康蓝花楹根茎分离内生菌株; 以蓝花楹茎腐病原菌(Fusarium chlamydosporum)作为供测菌,用5点对峙法进行拮抗作用初筛、平板扩散法复筛获得拮抗菌株,经形态学和16SrDNA序列比对,对其进行鉴定。采用温室盆栽和田间试验检测拮抗菌的生防效果。【结果】分离获得24株内生菌株,其中zhu66抑菌率达到97.8%,鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens),GenBank序列登录号为JF899258。盆栽试验结果表明,解淀粉芽孢杆菌能有效预防和治疗蓝花楹茎腐病。在一定浓度下,浓度越高防效越好,以10⁷cfu/mL浓度最佳。灭菌土防效优于自然土; 生防菌先于病原菌施入防效优于生防菌与病原菌同时接种,病原菌先于生防菌接种方式防效较低。菌株能显著促进蓝花楹地径、苗高与冠幅生长,浓度越高,促生效果越好。田间试验进一步验证,蓝花楹茎腐病不同发病程度的生防效果有显著差异,无病区预防作用十分显著,不发生茎腐; 重度发生区几乎没有效果,轻度发生区防效明显,防效达74.1%,中度发生区有一定效果,且随着时间延长,防效增加。【结论】解淀粉芽孢杆菌zhu66对蓝花楹茎腐病有良好的生防潜力。     

四合木甲醇提取物中杀线虫物质的分离与活性鉴定

通过活性追踪，对四合木的甲醇提取物活性成分进行了初步分离，使用快速制备色谱（combiflash companion）对甲醇提取物的氯仿萃取相进行了进一步分离，得到18个较大的馏分，同时以松材线虫（Bursa phelenchus xylophilus）为供试对象，对各馏分杀线虫活性作了初步测定，结果表明：氯仿萃取相F4馏分有较强的杀线虫活性，具有进一步研究的价值．