葡萄球菌新型肠毒素rSEP的原核表达与纯化研究

通过对扩增的金黄色葡萄球菌sep基因序列进行载体构建和双酶切鉴定,将酶切验证的pET-30a-SEP重组质粒分别转入不同的大肠杆菌表达宿主中,选择出最佳表达宿主菌,并进一步优化表达条件,实现重组融合蛋白(rSEP)的可溶性表达;采用Ni~(2+)亲和层析最终获得纯化的rSEP蛋白.研究结果为后续制备单抗、诊断试剂及肠毒素SEP蛋白的致病机制研究奠定基础.     

大肠杆菌-枯草杆菌穿梭质粒载体pSUGV4的构建

作者用DNA重组技术,构建了大肠杆菌-枯草杆菌穿梭质粒载体pSUGV4,它是以大肠杆菌(Es-cherichiacoli)质粒载体pUC18为骨架,与来自穿梭质粒表达载体pREP9含有革兰氏阳性菌复制起点(on     

hIAPP与麦芽糖结合蛋白的融合表达、纯化和鉴定

基于人胰岛淀粉样多肽(h IAPP)的氨基酸序列,按照大肠杆菌(E.coli)密码子偏好性合成基因,并克隆到pMAL-c2x载体中,与MBP蛋白mal E基因融合表达,获得重组表达质粒pMAL-hIAPP.将质粒pMAL-hIAPP转化到表达宿主E. coli BL21(DE3)中,利用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导融合蛋白MBP-hIAPP表达.SDS-PAGE电泳显示融合蛋白MBP-hIAPP的相对分子质量约为4.9×104.利用重组型烟草蚀纹病毒的半胱氨酸蛋白酶(rTEV)酶切MBP-hIAPP,并采用凝胶过滤层析的方法分离出高纯度的hIAPP,利用MALDI-TOF质谱进行了验证.     

表皮葡萄球菌调控蛋白SarA的表达与特性研究

表皮葡萄球菌是一种条件致病菌,它形成生物膜（biofilm）之后会产生耐药性并降低宿主的免疫力．由icaRADBC操纵子控制合成的胞间多糖黏附素（PIA）是生物膜的主要组成成分．在金黄色葡萄球菌已发现icaADBC的表达受到sarA基因表达的SarA蛋白的调控．SarA是一种DNA结合蛋白,可以激活妇操纵子中结构基因的表达．为了研究表皮葡萄球菌中sarA基因是否有类似作用,将能形成生物膜的表皮葡萄球菌RP62A的sarA基因克隆到pET-28a（＋）上,在大肠杆菌BL21中实现了表达并进行了纯化,还对其结构进行了模拟;同时,利用穿梭质粒pHPS9将sarA基因通过电转化导入sarA基因缺失的表皮葡萄球菌S．epidermidis（△sarA）中．RT-PCR实验证明SarA对icaA基因转录有促进作用．药物敏感实验证实sarA的表达对表皮葡萄球菌的抗药性有重要影响．     

利用RIG质粒在大肠杆菌中有效表达转录因子类蛋白

 大肠杆菌是常用的基因工程蛋白表达系统宿主菌,而密码子偏倚性常常成为某些异种蛋白质在大肠杆菌中成功表达的障碍.利用含有编码多种稀有tRNA的重组质粒RIG,一个含有大量稀有密码子的人类线粒体转录终止因子样蛋白成功地在大肠杆菌中得到表达.证明使用RIG质粒是克服大肠杆菌密码子偏倚性的有效手段.     

三种新的穿梭质粒pCC10、pCCT7和pST16的构建和性质研究

利用大肠杆菌质粒pUC18、pTG206和金黄色葡萄球菌质粒pC194在体外构建3个嵌合质粒pCC10、pCCT7和pST16.3个新质粒均是大肠杆菌和枯草杆菌的穿梭质粒。它们在大肠杆菌中呈Ap~rCm~r型,在枯草杆菌中则为Cm~rAp~5型。其中pCCT7和pST16含有xylE基因,可作为启动子探测质粒。所有的新质粒都具有来自pUC18的多酶克隆位点,适合于在大肠杆菌和枯草杆菌中重组外源DNA以及比较它们的表达情况。     

大肠杆菌—枯草杆菌穿梭质料载体pSUGV4的构建

作者用DNA重组技术,构建了大肠杆菌-枯草杆菌空梭质粒载体pSUGV4,它是以大肠杆菌（Es-cherichia coli）质粒载体pUC18为骨架,与来自空梭质粒表达载体pREP9含有革兰氏阳性菌复制起点（ori^ )和卡那霉素抗性（kan^r)基因片段重组而成,上述穿梭质粒载体可用于在大肠杆菌（E.coli）和枯草杆菌（Bacillus subtilis）中进行基因克隆工作。     

透明颤菌血红蛋白基因在苏云金杆菌中的表达

采用大肠杆菌与枯草杆菌的穿梭质粒pMK4作为载体,构建了含有果聚糖酶基因(sacB)启动子和vgb基因的重组质粒pMK-SV.通过原生质体和电转化,将pMK-SV转入苏云金杆菌中,经影印筛选得到转化子Bt4.对Bt4诱导表达,与原菌株相比Bt4的生长量增加了20.2%.     

钠离子依赖的中性氨基酸转运蛋白2(SNAT2)多克隆抗体的制备

钠离子依赖的中性氨基酸转运蛋白2(SNAT2)属于SLC38家族,参与小的中性氨基酸跨膜转运,在哺乳动物组织中广泛表达.SNAT2的功能紊乱可以导致许多神经性疾病,如阿尔茨海默症、帕金森症等.采用PCR方法扩增得到SNAT2氨基端75个氨基酸的编码序列,构建重组质粒pET28a-SNAT2-75aa,并将其转入大肠杆菌BL21(DE3)中,通过IPTG诱导表达重组蛋白.利用组氨酸标签蛋白经镍柱亲和纯化后得到了纯度在95%以上的SNAT2氨基端蛋白SNAT2-75aa,将其作为免疫原免疫新西兰大白兔,从而获得SNAT2多克隆抗体.采用巯丙基琼脂糖凝胶6B(Thiopropyl sepharose)固定抗原亲和纯化法进一步对该抗体进行纯化,纯化后的抗体效价至少提高10倍.蛋白免疫印迹确定该抗体对SNAT2具有高度的特异性,表明SNAT2多克隆抗体制备的成功,为进一步研究SNAT2蛋白的结构和功能奠定了生化基础.     

新型抗菌肽基因设计、合成及在酵母中的表达(Ⅱ)——抗菌肽 AD 基因在酵母中的表达

将抗菌肽ＡＤ基因定向克隆到大肠杆菌－酵母穿梭质粒ｐＣＬＷＡ２的ＢａｍＨＩ和ＳａｌＩ位点上,构建成含抗菌肽ＡＤ基因的重组质粒ｐＣＡＤ,转化酵母宿主菌ＡＢ１０３,转化子在缺乏亮氨酸的ＳＤ选择培养中３０℃培养４８ｈ,培养液经简单纯化后,活性蛋白ＰＡＧＥ和琼脂孔穴扩散法测定抑菌活性表明,抗菌肽ＡＤ基因在酵母中获得表达．     

枯草杆菌—大肠杆菌多功能穿梭载体的构建

本文简要地报道了由枯草杆菌运载体pUB_(110)和大肠杆菌运载体pGEM_3构建的一个多功能穿梭载体pBE_2.该载体能在枯草杆菌和大肠杆菌中复制和表达,并具有一个强启动子和一个多酶切位点区可供广泛利用,是一个比较理想的运载体.     

地衣芽孢杆菌A13重组表达黑曲霉植酸酶phyA基因的研究

将黑曲霉Z6植酸酶phyA基因置于芽孢杆菌强启动子F1下,与大肠-芽孢杆菌穿梭表达载体pHY300PLK连接,重组质粒pHY300-F1-phyA电击转化地衣芽孢杆菌A13。筛选阳性克隆,获得重组菌株A13-F1-phyA,PCR扩增及酶切验证表明植酸酶基因已转入地衣芽孢杆菌。SDS-PAGE分析和表达产物的酶活性研究证明,重组菌株中植酸酶得到了有效分泌和表达。     

Construction of Yeast Vectors with Resistance to Geneticin

IntroductionYeast Saccharomyces cerevisiae (S.cerevisiae) hasbeen widely used in molecular biology as well asinthe industrial production.Its genetic backgroundhas been well studied and a series of cloning andexpression vectors have been constructed for DNAtransformation into yeast[1 ] .The selection markersof these conventional vectors are usually H IS3 ,TRP1 ,LEU2 ,and URA3 [1 ,2 ] . These selectionmarkers are responsible for the biosynthesis ofsome amino acids and consequently the hos…     

波氏假丝酵母启动子的克隆及新霉素基因的表达

报道了波氏假丝酵母（Candida boidinii)启动子的克隆,将克隆的启动子与Neo^ 基因重组构建了含Neo^r基因的表达载体YepNP181,转化波氏假丝酵母,实现了Neo^r基因在波氏假丝酵母中的表达,使波氏假丝酵母转化子能在含G418的抗性培养基上生长从而建立了Neo^r基因－G418选择系统,为外源基因在波氏假丝酵母中表达创造了条件。     

人肿瘤坏死因子穿梭表达载体的构建

应用ＤＮＡ重组技术,将人肿瘤坏死因子（ｒｈＴＮＦ）ｃＤＮＡ插到质粒ＰＲＬ４３９的ＰｐｓｂＡ启动子下游,得到中间载体ＰＲＬ＿ＴＮＦ;再把ＰＲＬ＿ＴＮＦ上含ＰｐｓｂＡ和（ｒｈＴＮＦ）ｃＤＮＡ的片段连到穿梭载体ＰＤＣ＿８上,构建成穿梭表达载体ＰＤＣ＿ＴＮＦ．转化大肠杆菌ＴＧ１后,进行发酵培养．ＳＤＳ＿ＰＡＧＥ分析和免疫印迹检测结果显示ｒｈＴＮＦ获稳定表达,分子量为１７ｋｕ．本研究结果为ｒｈＴＮＦ在蓝藻中的表达提供了技术基础．     

拟南芥HSP70基因启动子表达载体的构建及在烟草BY2细胞中的应用

探讨了拟南芥的HSP70基因在液体悬浮培养的烟草BY2细胞中的表达及应用.用PCR扩增的方法从拟南芥col生态型基因组中扩增获得HSP70基因启动子序列,将其连入p1300表达载体且以GFP为报告基因,将该表达载体采用农杆菌转基因转入液体悬浮培养的烟草BY2细胞中,观察转基因细胞中报告基因GFP的表达情况.结果显示:HSP70:GFP转基因液体悬浮培养的烟草BY2细胞中有GFP的表达.该表达载体可在液体悬浮培养的BY2细胞中正常表达,且可在较短时间内获得大量实验材料,对拟南芥的HSP70基因启动子的进一步研究提供理论依据和丰富的实验材料,且可明显缩短实验周期.     

人血管生成素基因的克隆及表达

利用RI-PCR方法从培养的人黑色素瘤细胞系A375中扩增得到了人血管生成素cDNA片段,测序正确后克隆入表达载体pET-28a( )中并转化于E.coli BL21宿主菌中.经IPTG诱导,表达了N端融合6个组氨酸标签(6His-tag)的血管生成素融合蛋白.利用6His-tag与过渡态金属离子Ni2 高亲和力结合的性质,经镍柱纯化,获得了高纯度的血管生成素融合蛋白,为进一步研究其生物活性及应用奠定了基础.     

结核分枝杆菌H37Ra FadD3基因克隆与表达研究

为探索FadD3在结核分枝杆菌胆固醇分解代谢中的作用,从结核分枝杆菌H37Ra的全基因组中克隆了FadD3基因,并在大肠杆菌BL21中表达.根据NCBI公布的结核分枝杆菌全基因组序列设计一对引物,PCR扩增FadD3基因.PCR扩增产物与克隆载体pGEM3Zf(+)进行拼接,得到重组基因FadD3-pGEM3Zf(+),再转化到大肠杆菌DH5ɑ得到克隆.PCR检测阳性克隆,再与表达载体pYUB28b拼接,得到重组质粒FadD3-pYUB28b.阳性重组质粒亚克隆到大肠杆菌BL21宿主菌进行自体诱导表达.经过表型筛选及鉴定分析,已成功构建了重组表达质粒FadD3-pYUB28b.SDS-PAGE和Western blotting证实,重组基因FadD3-pYUB28b在大肠杆菌BL21中有表达产物.实验结果表明,以pYUB28b为表达载体,FadD3重组基因在大肠杆菌表达体系于温度分别为18,28 ℃有包涵体形式的表达蛋白,在37 ℃无表达产物.     

乙型肝炎病毒HBX基因的克隆、表达和蛋白的纯化

克隆乙肝病毒X基因,并在大肠杆菌中进行表达和纯化。用PCR方法从结乙肝病毒基因组扩增出HBX基因片段,克隆至pMD18-T载体中。序列测定正确后,将其亚克隆到表达载体pProExHTa并在大肠杆菌BL21中表达。表达蛋白经SDS-PAG及Western-blot分析后,亲和层析法纯化蛋白。结果成功克隆了HBX基因,并对其在E.coli中进行了表达。SDS-PAGE及Western blot分析表明表达产物正确。通过IMAC纯化系统获得17 kD纯化蛋白,与文献报道相符。结果成功获得了纯化的HBX蛋白,为进一步研究HBX蛋白与宿主蛋白之间的相互作用奠定基础。