僧帽牡蛎EGFR基因的克隆及早期发育阶段的表达

僧帽牡蛎(Crassostrea angulata)也称葡萄牙牡蛎,是我国广泛分布的一种传统大宗养殖贝类.本研究利用消减杂交文库结合RACE技术,从僧帽牡蛎中克隆获得了表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor,EGFR)的cD-NA全长序列.EGFR基因cDNA序列1 608 bp,编码298个氨基酸,预测存在1个跨膜结构域和5个酪蛋白激酶II磷酸化位点.构建了该基因的UPGMA进化树,比对发现其氨基酸序列与高等动物的差异较大.给出了该基因的标准曲线,利用RT-PCR技术检测了该基因在僧帽牡蛎胚胎发育早期阶段的表达量变化.该基因从僧帽牡蛎发育的卵到D型幼虫期间均有表达.其中早期的卵母细胞和后期的担轮幼虫,D型幼虫阶段表达量较高,表明该基因在牡蛎幼体胚胎发育早期具有阶段性调控的作用.     

番茄抗白粉病必需基因ShGSTU1原核表达条件优化

采用RT-PCR技术从番茄中扩增谷光甘肽转移酶基因ShGSTU1,构建该基因的原核表达载体pET28aShGSTU1和pET32a-ShGSTU1,并对重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中表达条件进行优化,主要对诱导温度、诱导时间及诱导剂浓度进行分析.结果表明:重组蛋白在表达载体pET28a中的最佳表达条件为1mmol/L IPTG,37℃诱导4h;在表达载体pET32a中的最佳表达条件为1mmol/L IPTG,30℃诱导5h.     

海洋底栖动物浮游幼体附着和变态的研究

海洋底栖动物浮游幼体附着和变态的研究具重要的理论和应用价值.我校海洋系在国内较早开展该领域的研究,近10年来,取得了系列研究成果,促进了我国在海洋底栖动物幼体附着和变态研究领域的发展.所研究的海洋底栖动物有翡翠贻贝(Perna viridis)、僧帽牡蛎(Saccostrea cucullata)、盘鲍(Haliotis discus discus)、杂色鲍(Haliotis diversicolor)、华贵栉孔扇贝(Chlamys nobilis)、台湾东风螺(Babylonia formosae)、方斑东风螺(B.areolata)、冠瘤海鞘(Styela canopus)和白脊藤壶(Balanus albicostatas).研究内容包括幼体附着和变态过程中的幼体行为学和形态学观察、幼体附着和变态的影响因子、机制及应用研究.     

拟穴青蟹凝集素基因Splec1的克隆及原核表达载体的构建

为获得高表达拟穴青蟹(Scyiia paramamosain)凝集素(Lectin) Splec1的工程菌,本实验根据GenBank中凝集素的基因序列,设计合成1对扩增Splec1基因完整ORF的特异性引物,采用RT-PCR技术从拟穴青蟹血液中分离扩增了Splec1的eDNA序列(495 bp),将该基因重组到原核表达载体pET32a(+)中,酶切和测序分析表明,重组质粒pET32a(+)-Splec1结构正确.     

日本血吸虫卵壳蛋白编码基因的扩增及克隆

目的:扩增和克隆日本血吸虫卵壳蛋白编码基因(SjESG),以研究其作为候选疫苗分子和药物靶点的可能性.方法:合成引物,以日本血吸虫雌、雄虫cDNA第一链为模板,RT-PCR扩增日本血吸虫卵壳蛋白编码基因,与带有硫氧还蛋白(Trx)基因的高效原核表达质粒pET32a(+)定向重组,构建原核表达重组质粒,并经限制性核酸内切酶酶切分析和PCR鉴定.结果:从雌虫cDNA中扩增出624bp SjESG基因,原核表达重组质粒pET32a(+)-SiESG经限制性核酸内切酶酶切和PCR均获得624bp的DNA片段.结论:成功构建原核表达重组质#ipET32a(+)-SjESG.     

Abd-Bcr/Abl原核表达载体的构建和表达

构建Bcr/Abl-Abd原核表达载体,并表达、观察对白血病细胞K562的影响.以慢性白血病PGD210质粒为模板,应用聚合酶链反应(PCR)扩增出Abd编码区序列,克隆入pMD18t载体,经酶切测序鉴定正确.再通过酶切重组克隆入原核表达载体pET32a,构建pET32a-Abd重组表达质粒,经酶切、测序鉴定,序列、读码框均正确.通过转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达,纯化.结果PCR扩增出特异性的501bp的目的片断,以此构建的重组质粒pET32a-Abd能够在上清中表达约36.6 kd的目的蛋白,Westem blot鉴定为特异表达.证明成功构建了原核表达载体pE732a-Abd,并表达在上清中,表达蛋白约占菌体总蛋白的6%,纯化后达到74.3%,Westem blot检测为特异性表达,为进一步研究该蛋白对慢性白血病细胞的作用奠定了分子基础.     

幽门螺杆菌hpaA基因克隆及其蛋白的表达纯化

目的克隆幽门螺杆菌hpaA基因,构建hpaA-pET-32a重组质粒,并对其重组蛋白进行表达纯化,为其进一步的免疫研究提供实验基础.方法采用PCR方法,从幽门螺杆菌临床分离菌株中扩增hpaA基因,T-A克隆后测定核苷酸序列,通过表达载体pET-32a构建的hpaA的重组质粒,在E.coliBL21(DE3)宿主菌中用不同浓度的IPTG诱导表达,最后对重组蛋白进行纯化.结果重组质粒hpaA-pET-32a经双酶切、PCR及测序证明构建成功,经诱导重组蛋白成功表达,以包涵体蛋白的形式存在,对其纯化后获得了高纯度的重组蛋白.结论成功构建幽门螺杆菌hpaA的原核表达系统,并对其重组蛋白进行了表达纯化.     

杂色鲍后消化道生长相关基因HdEGF1的研究

附着变态是许多海洋无脊椎动物幼体生长发育的一个必经过程,是幼体性状消失而成体性状展开的关键阶段.报道了与附着变态密切相关的杂色鲍HdEGF1基因的克隆、序列分析及其时空表达模式.运用cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆了HdEGF1基因全长cDNA序列.该基因全长1 239bp,含1个343个氨基酸残基的开放阅读框(ORF),推测的蛋白序列包含3个Ca2+结合类表皮生长因子(EGF-CA)结构域和1个血管性血友病因子(vWFA)结构域.通过序列相似性比较,确定其为新型表皮生长因子1(EGF1)相关蛋白.荧光定量PCR(qPCR)结果显示HdEGF1基因在幼体附着后的表达量比附着前任一时期均高19倍以上;全胚原位杂交(WMISH)结果显示HdEGF1基因集中表达在变态后幼体后消化道的表皮细胞.HdEGF1基因的这种时空表达模式表明HdEGF1受严格的时空调控,直接参与了附着后杂色鲍幼体后消化道的生长和细胞分化.推测HdEGF1蛋白与某未知的vWFA-结合蛋白一道调控着杂色鲍幼体后消化道的空间走向.因此,HdEGF1蛋白很可能在后肠的形态建成中起着非常核心的作用.本研究为贝类肠道形态建成机制的深入研究提供了切入点,HdEGF1基因可以作为重要的标志分子,用于深入研究肠道形态建成过程中的信号通路、细胞分化和细胞迁移.     

粉尘螨Der f15的基因克隆与其表达载体的构建

先挑取纯培养的粉尘螨,提取总的RNA,后采用RT-PCR方法进行反转录出cDNA.由cDNA提取出目的基因进行片段扩增,产物连接入T载体(pMD18-T).经扩增后,用EcoR I和Xho I双酶切,将目的基因分别连接到pET28和pET32的表达载体上,得到重组质粒pET28和pET32,即粉尘螨的基因克隆与 表达载体构建成功.     

鲍幼虫变态分子机制的研究进展

综述了鲍幼虫变态及其分子机制的研究进展.鲍因其幼虫营卵黄营养,且同昆虫和蛙类相比,鲍幼虫变态速度快、存在提早发育(‘anticipatory’developmental program)现象,是研究贝类乃至海洋无脊椎动物变态现象的理想模式.早期研究采用药理学和电生理学方法发现了GABA等能够诱导鲍变态的物质,并且提出了变态过程信号通路,但调节幼虫变态的分子机制仍然所知甚少.研究人员采用差异显示PCR和基因芯片等手段获得了一些变态前后差异表达的基因.但是变态是由众多的基因和信号分子共同决定和影响的.传统获得差异基因的方法效率低、获得基因数量少、受公布的EST(表达序列标签)限制大,所以调控变态的分子网络和机制还尚未建立,缺乏对调控这一细胞过程的整体认识.转录组学分析获得大量变态差异基因,并且有助于建立差异基因相互作用网络,是研究变态分子机制的新方向.此外,变态差异基因的功能验证和注释是鲍变态分子机制研究的另一问题,基因干扰可能是解决方向之一.     

His-猪生长激素融合基因在Bm-N细胞和蚕体内的表达与纯化

用构建的带有His—Tag pgh融合基因的重组杆状病毒Bm—BacPAK6—pgh研究了Bm—BacPAK6—pgh在家蚕细胞(Bm—N)和蚕体内的表达，并对蚕体表达产物进行了纯化．SDS—PAGE电泳分析显示，重组病毒Bin—BacPAK6—pgh在Bin—N细胞、蚕体中得到了融合表达，Western blot分析表明，Bm—N细胞、蚕体中表达的融合蛋白与大肠杆菌表达的猪生长激素具有相同的抗原性．Bm-BacPAK6-pgh在Bin—N细胞内的表达始于24h，而蚕体中的表达始于72h，二者的表达峰分别在96h和120h．经40％饱和度硫酸铵盐析和Ni—NTA Agarose亲和柱二步纯化可获得SDS—PA(正电泳纯的具有抗原性的重组猪生长激素融合蛋白。     

兔脑组织因子基因在大肠杆菌中的克隆与表达

重组组织因子(recombinant tissue factor,rTF)是新一代凝血酶原时间检测(PT)试剂的主要成分.从新鲜兔脑组织提取总RNA,通过RT-PCR得到TF全长编码基因,并克隆到pMD19-T载体.以测序验证正确的重组子为模板,扩增TF基因并构建成融合表达质粒pMAL-c2X-TF,并将其转化到DH5α中.SDS-PAGE和Western blotting证明,菌体诱导后形成可溶性的融合表达产物,该融合蛋白通过亲和层析纯化和凝血因子X a水解成为游离的TF蛋白,该蛋白通过脂化,制备成重组PT试剂.凝血试验表明,该试剂对血浆有明显的促凝活性.     

Cloning, Characterization, and Expression Analysis of Calreticulin from Pearl Oyster Pinctada fucata

Calreticulin is a unique calcium-binding protein with multiple functions mostly located in the sarcoplasmic/endoplasmic reticulum. A large amount of calcium is absorbed from the medium and transported to mineralization sites during biomineralization in pearl oyster. This paper describes the cloning of the full-length cDNA of calreticulin from Pinctada fucata, namely PCRT. PCRT encodes a deduced 414-amino acid protein, which includes a predicted 17- amino acid signal peptide and an endoplasmic reticulum retrieval sequence HDEL. The protein shows 63%-76% sequence identity and shares some common characteristics with calreticulins from other species. Semi-quantitative RT-PCR indicates that PCRT is ubiquitously expressed in all tissues tested with the highest expression in the hemolymph and the mantle. In situ hybridization analysis of PCRT in the mantle showed strong signals in the inner fold, the inner side of middle fold, and the inner side of outer fold of the mantle epithelium, All these results suggest PCRT might be involved in Ca^2＋ transport and storage during oyster biomineralization.     

人PSF真核表达载体构建及其在CHO细胞中的表达

目的是构建人PSF基因真核表达载体pEGFP-N1-PSF,并在检测其在CHO细胞株中的表达情况。应用DNA重组技术和PCR方法从人宫颈癌Hela细胞中扩增PSF基因,插入pEGFP-N1真核表达载体,构建重组质粒pEGFP-N1-PSF并测序鉴定。将pEGFP-N1-PSF瞬时转染CHO细胞,通过Western blot和RT-PCR方法检测PSF的表达,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达。结果 CHO细胞转染pEGFP-N1-PSF真核表达载体后,RT-PCR和Western blot实验发现,在RNA和蛋白水平有PSF的表达,在荧光显微镜下可以观察到融合蛋白EGFP/PSF的表达。成功构建pEGFP-N1-PSF真核表达载体,证实其在CHO细胞中可以表达。     

西瓜花叶病毒外壳蛋白基因的克隆与原核表达

利用RT-PCR方法获得了西瓜花叶病毒(WMV)陕西分离物外壳蛋白(CP)基因,大小为843 bp.将CP基因克隆到pMD18-T Simple Vector,测序分析发现与各个国家CP核苷酸和氨基酸同源性分别为93.0%~95.0%和96.5%~98.6%.将CP基因定向插入EcoR I/SalI切开的pET30a中,构建了原核表达载体pET30-WCP,转化大肠杆菌BL21.经IPTG诱导2~8 h后,成功表达了分子量约为37 kD的CP蛋白.通过不同时间诱导发现,加入IPTG 4 h后蛋白开始表达,8 h后表达量比较大.以诱导的蛋白为抗原免疫家兔,制备了WMV CP抗血清,ELISA法测其效价为1/6 400,Western blot分析能与CP发生血清学反应.     

Cloning, Characterization, and Expression Analysis of Calreticulin from Pearl Oyster Pinctada fucata

Calreticulin is a unique calcium-binding protein with multiple functions mostly located in the sar-coplasmic/endoplasmic reticulum.A large amount of calcium is absorbed from the medium and transported to mineralization sites during biomineralization in pead oyster.This paper describes the cloning of the full-length cDNA of calreticulin from Pinctada fucata,namely PCRT.PCRT encodes a deduced 414-amino acid protein,which includes a predicted 17- amino acid signal peptide and an endoplasmic reticulum retrieval sequence HDEL.The protein shows 63%-76% sequence identity and shares some common characteristics with calreticulins from other species.Semi-quantitative RT-PCR indicates that PCRT is ubiquitously ex-pressed in all tissues tested with the highest expression in the hemolymph and the mantle.In situ hybridiza-tion analysis of PCRT in the mantle showed strong signals in the inner fold,the inner side of middle fold,and the inner side of outer fold of the mantle epithelium.All these results suggest PCRT might be involved in Ca2+ transport and storage during oyster biomineralization.     

细胞毒性T细胞抗原4胞外结构域的高效表达与纯化

目的:获得细胞毒性T淋巴细胞相关分子4胞外结构域(exCTLA4)在大肠杆菌中高效表达的条件,并纯化获得高纯度的重组蛋白.方法:构建原核表达质粒pET28a-exCTLA4并转入大肠杆菌Transetta(DE3)中,通过改变诱导物IPTG浓度、细菌培养温度和时间,获得了exCTLA4的最佳表达条件.收集最佳诱导条件下表达exCTLA4的菌体,将菌体超声破碎后,离心分离exCTLA4包涵体,用低浓度尿素(2mol·L~(-1))洗去大部分背景蛋白后,再用高浓度尿素(8mol·L~(-1))溶解包涵体,进一步用镍离子亲和层析方法得到高纯度exCTLA4.结果:构建了表达载体pET28a-exCTLA4,获得了exCTLA4在Transetta(DE3)中的最佳诱导条件,即在1mmol·L~(-1) IPTG、25℃下,诱导6h能得到最佳表达,但重组蛋白以包涵体形式存在.通过纯化exCTLA4包涵体及进一步的镍离子亲和层析获得了高纯度的目的蛋白,Western blot鉴定为CTLA4.结论:获得了exCTLA4重组蛋白在大肠杆菌中的最佳表达条件和纯化方法及步骤,为该蛋白的应用奠定了基础.     

德国小蠊Bla g 2的原核表达及其多克隆抗体的制备

利用RT-PCR技术扩增德国小蠊Blag2基因,将其克隆进pET-41b载体.在大肠杆菌中经IPTG诱导表达获得GST-Blag2蛋白,SDS-PAGE分析表达产物,得到相对分子量约74kDa的融合蛋白.通过亲和层析法纯化表达的GST-Blag2蛋白,并以此表达产物制成油乳剂疫苗免疫新西兰白兔,制备多克隆抗体.间接ELISA法测得抗体效价达到1∶300000.Western印迹表明抗体有较高的特异性,可分别与GST-Blag2融合蛋白和德国小蠊变应原浸提液反应.Blag2在大肠杆菌中的成功表达及其多克隆抗体的制备,为德国小蠊过敏患者的诊断和治疗提供了帮助.     

Construction of transposon-mediated baculovirus vector and expression of green fluorescent protein in insect cells and larvae

A transposon-shuttle vector Hanpvid was constructed by using wild-type genomic DNA fromHeliothis armigera nuclear polyhedrosis virus (HaNPV). It could replicate inE. coli cells as a large plasmid and remain infectious when being induced into insect cells. Hanpvid comprises HaNPV DNA and a transposon cassette which includes a miniF replicon, a kanamycin resistance gene (kan), lacZa and an attachment site for Tn7 (attTn7). Recombinant virus rHa-FaGP was obtained after transposition of a donor plasmid carrying green fluorescent protein gene (gfp) and polyhedrin gene (ocu) into attTn7. SDS-PAGE analysis shows that both gfp and ocu genes were highly expressed inHeliothis armigera cells. Green Hemolymphocytes can be seen under a fluorescent microscope 4 d after recombinant virus rHa-FaGP infected the third-instar larvae. The infected larvae show strong green fluorescence 6 d post infection.