鳜鱼基因组(AC)n微卫星富集文库的构建与鉴定

鳜鱼基因组DNA经MseI酶切后,与MseI接头连接,用链霉素和素磁珠亲和捕捉与生物素标记的微卫星寡核苷酸探针(CA)8杂交,杂交复合物通过变性洗脱获得单链目的片段,经PCR扩增形成双链,然后克隆到pGEM-T 载体上,转化至大肠杆菌DH5α中,首次成功构建鳜鱼(Siniperca chuatsi)基因组(AC)n重复类型的微卫星富集文库.测序结果表明,阳性克隆率为60%,说明构建的鳜鱼基因组微卫星富集文库是一个高质量的文库.鳜鱼富集微卫星文库的建立将为下一步进行鳜鱼微卫星标记的筛选提供了有效的工具.     

匍枝根霉内切葡聚糖酶基因在毕赤酵母中的克隆及表达

从匍枝根霉TP-02的cDNA文库中克隆得到其内切葡聚糖酶基因,并在毕赤酵母中进行表达.该内切葡聚糖酶基因大小为954bp,将其与pPIC9K质粒经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切后,利用T4连接酶进行连接.将线性化后的重组质粒转化毕赤酵母GS115,并利用MD平板和刚果红平板进行筛选.阳性克隆经甲醇诱导培养84h后,产生的内切葡聚糖酶酶活力达到峰值为1.754IU/mL.     

鹅源腺病毒全基因组DNA酶切片段的克隆

利用1株鹅源腺病Y81G4株,经鹅胚增殖后收获尿囊液,用差速离心法纯化病毒子并提取病毒基因组DNA,病毒DNA经Hind Ⅲ酶切后共产生10个片段,分别回收各酶切片段,与经Hind Ⅲ单酶切的pUC18连续,获得8个不同的重组质粒。对于未克隆到的两末端片段,经碱处理去除末端蛋白后,以平端和HindⅢ粘端与经SmaⅠ和 HindⅢ双酶切的pUC18连接,获得了重组质粒pGAHC和pGAHI。克隆的各酶切片段,通过酶切电泳和Southern blotting结果鉴定,证明已分别克隆到该病毒基因组DNA HindⅢ酶切片段,且各酶切片段大小之和约为32．9kb.     

β-1,4-内切葡聚糖酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

运用选择性培养基LBCMC从环境土样中分离得到一株能利用羧甲基纤维素的芽孢杆菌Bacillus sp．NW-2004a，并运用“鸟枪”克隆法构建了其基因组文库，且从此基因组文库中筛选得到两个阳性克隆．对其中一阳性克隆中插入的DNA片段（命名为GLUD）进行序列测定，发现了一长度为2502bp的开放阅读框（ORF），可编码834个氨基酸．BLAST分析结果表明，该基因与Bacillus sp．KSM-S237来源的纤维素酶基因AB018420具86％相似性，所编码的多肽与Bacillus sp．KSM-64来源的β—1，4-内切葡聚糖酶具89％的相似性，故该基因是一新发现的β—1，4-内切葡聚糖酶基因．该序列已收录于Genebank，登录号AY663839．另外，以cpoI and NotI限制性内切酶双酶切衍生于质粒pGEX的大肠杆菌表达载体pHBM625，然后将经T4 DNA polymerase处理后的β-1，4-内切葡聚糖酶基因克隆至载体pHBM625中得到重组质粒pHBM625Glu，最后通过平板检测及SDS—PAGE凝胶电泳，均检测到该基因在大肠杆菌XL10-Glod中的表达．     

堆形艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA文库的构建及鉴定

构建堆形艾美耳球虫(Eimeria acervulina)孢子化卵囊cDNA表达文库,以筛选其功能性基因.用TRI-ZOL Reagent试剂提取堆形艾美耳球虫总RNA,再用Oligo(dT)12-纤维素柱从总RNA中分离mRNA,以mRNA为模板,RT-PCR法反转录合成cDNA第一链,用LD-PCR法扩增合成双链cDNA,经蛋白酶K消化、SfiⅠ酶切、CHROMA SPIN-400柱分离去除小于400 bp的片段后,将cDNA与已经SfiⅠ酶切的λTriplEx2载体按一定比例连接,经体外包装,建立堆形艾美耳球虫孢子化卵囊的噬菌体表达文库.随后测定文库容量为4.6×106pfu/mL,扩增文库的滴度为4.4×1010pfu/mL,重组率达到98%,插入片段大小为750~1 000 bp,并从扩增文库中扩增出了堆形艾美耳球虫巨噬细胞游走抑制因子基因片段.     

酵母双杂交筛选血液中与PERIOD1相互作用的新蛋白

采用酵母双杂交方法,以人PER1的PAS结构域为诱饵,在人血液cDNA文库中筛选能与之相互作用的蛋白.经酶切和核苷酸序列测定,证实重组诱饵载体hper1PAS/pGBKT7构建成功.血cDNA文库转化效率为1.4×106/3μg pGADT7-Rec.酵母双杂交文库营养缺陷筛选得到114个阳性克隆,β-半乳糖苷酶检测报告基因获得46个蓝色克隆.     

棉花腺体形成时均一化cDNA文库的构建

为克隆筛选棉花腺体形成相关的基因，运用SMART技术构建cDNA文库.首先抽提棉花腺体形成时期的mRNA，mRNA逆转录后合成cDNA，经均一化处理后，SfiⅠ酶切，连接质粒载体，电转化，成功构建了棉花腺体形成时期的cDNA文库.经鉴定原始文库滴度为5.8×105 cfu/mL，其重组率高达94%，插入片段的平均长度约为1.4 kb.     

产酸克雷伯氏菌基因组文库的构建及鉴定

为了给基因功能研究提供基础,以pWEB~(TM)质粒构建产酸克雷伯氏菌KO108基因组文库,克隆数目为1 329个。通过EcoRⅠ酶切分析随机挑取的20个文库克隆的重组质粒,结果显示所有质粒均有8.2kb载体条带同时含有外源DNA,且外源DNA的带型并不相同,这表明所构建的KO108基因组文库中插入的外源DNA随机性较好。分析外源DNA电泳条带的大小,结果显示克隆的外源DNA片段最小约为25kb,最大约为50kb,平均大小估算为40kb,文库克隆容量约52Mb,证明该基因组文库包含基因组任意一个基因的概率为99.8%,是KO108基因组覆盖率的5倍。该文库的构建为产酸克雷伯氏菌功能基因克隆和比较基因组学研究奠定了基础。     

肝片吸虫抗原基因的克隆与筛选

提取肝片吸虫总RNA,经oligo(dT)-纤维素柱分离得到mRNA,反转录合成cDNA后,连接Eco RI人工合成接头,酶切后克隆到表达型质粒载体pGEX-1λT,转化大肠杆菌JM107菌株构建肝片吸虫cDNA文库(文库大小约为2.1×105)．用免疫印迹筛选出5个阳性克隆,分别命名为pFH2,pFH4,pFH16,pFH21和pFH29．其中pFH21印迹信号最强．Eco RI酶切pFH21显示插入片段大小约为1.0kb.重组子pFH21经SDS-PAGE电泳显示表达有一个重组蛋白,分子量约为48kD.     

致弱Ⅰ型MDV pp38基因同源物的克隆和序列分析

将致弱Ⅰ型马立克氏病病毒(MDV)感染的细胞基因组DNA的EcoRⅠ酶切产物建于Puc18质粒载体文库中,以digoxingenin标记的含有强毒GA株MDV pp38基因克隆片段作为探针,进行原位杂交反应,初步筛选出阳性重组质粒,进一步用EcoRⅠ酶切分析筛选到含pp38基因同源物的重组Puc18质粒. 序列分析表明该pp38基因同源物与pp38基因有极高的同源性,仅有1个碱基突变并导致1个氨基酸的替换.     

银杏、板栗不同组织DNA的提取

利用CTAB方法提取银杏、板栗的冬芽、嫩叶、半木质化韧皮部、老枝韧皮部和成熟叶子的DNA。结果表明,除成熟叶子外,其它4种组织的DN较容易提取,且DNA的纯度较高,A260/A280值都在1.8以上,每100mg材料的产量为22～50μg。清晰明亮的PCR产物也表明所提取的DNA可满足DNA分子标记的要求。     

非伤害性取样方法获取的拟穴青蟹DNA质量研究

选取5只采自广西北海的野生拟穴青蟹(Scylla paramamosain),分别采用非伤害性(血淋巴)和伤害性(肌肉组织)取样方法提取基因组DNA进行COI扩增和ISSR扩增,检测DNA质量。结果表明,非伤害性(血淋巴)和伤害性(肌肉组织)取样方法获得的拟穴青蟹全基因组DNA的OD260/OD280分别为1.75~2.01和1.81~1.94,全基因组DNA纯度均较高,质量不相上下。同时,两种取样方法获取的DNA扩增片段大小均在600bp左右,同一个体扩增带型也是一致的。非伤害性(血淋巴)取样方法提取的基因组DNA,在质量上可以媲美伤害性取样(肌肉组织)提取的DNA,可以用于其它分子生物学实验研究。     

细胞膜渗透性实验的改进及鸡血液DNA的提取

以成年鸡血为材料,分析了不同浓度NaCl、NH4Ac、乙醇、葡萄糖条件下鸡红细胞的渗透性;采用盐析法和碘化钾（KI）法提取鸡血细胞DNA,用二苯胺法和紫外分光法鉴定DNA提取效果。结果表明,在低渗、等渗、高渗溶质中,乙醇渗入细胞的速度都是最快的;用二苯胺法检测从鸡血液中提取的DNA,发现盐析法提取的DNA颜色反应较碘化钾法深;盐析法和碘化钾法提取DNA的光吸收值比率分别为1.6～2.0和1.8～2.0,产量分别为0.7×10-6～0.9×10-6 g/L和0.4×10-6～0.6×10-6 g/L。     

石蒜单染色体的显微分离及体外扩增

建立了石蒜单染色体的分离及体外扩增的方法。石蒜根尖经卡诺固定液固定后，再用果胶酶和纤维素酶酶解处理，制得标本，在倒置显微镜下，用自制的毛细管针挑取目的的染色体。将分离的石蒜染色体放入0．2mLEppedorf管中，经蛋白酶K处理后，进行DOP－PCR扩增，获得DNA片段。琼脂糖凝胶电泳显示扩增产物的长度大约为100－5000bp。此法为构建石蒜单染色体基因组库和筛选其特异性探针奠定了基础。     

我国部分家鸭和野鸭遗传多样性及亲缘关系的AFLP分析

利用AFLP技术分析我国8种常见家鸭和2种野鸭基因组DNA的多态性，在选取的17对引物中，有9对能得到重复性好的多态性扩增条带．每对引物扩增带数在44-83之间．共得到513个标记位点，其中498个为多态位点，多态位点比率达97．1％；根据AFLP图谱计算了不同样品间的遗传距离（D）和相似性系数（GS）．家鸭品种间的遗传距离在0．331～0．589范围内，绿头鸭、斑嘴鸭与家鸭品种（系）间的遗传距离分别在0．298～0．520和0．316～0．522之间．方差分析表明两组数据不存在显著差异（p〉0．05），由此得知绿头鸭和斑嘴鸭在家鸭品种的形成过程中都作出了贡献．并根据D值绘制了它们的聚类图谱．     

盐酸安非他酮的合成工艺研究

盐酸安非他酮为一种抗抑郁药物.以间氯苯甲酰氯为原料,经酰化、格氏反应、溴化和N-烃基化反应得盐酸安非他酮.并运用元素分析、UV、IR、HNMR和MS进行结构确证.改进后的工艺总收率达50.8%(以间氯苯甲酰氯计).结果表明操作方法简便,总收率较高.     

克隆植物珠芽蓼基因组DNA的提取及RAPD鉴定

高原植物体内所含有的酚类、多糖、色素等次生代谢物质严重影响提取其基因组DNA的得率和纯度,是导致后续分子操作失败的主要原因.运用一种新改进的CTAB法对变色硅胶保存的高原植物珠芽蓼(Polygonumviviparum)叶片进行基因组DNA的提取,采取常温下沉淀DNA,增加洗涤沉淀的体积分数为70%乙醇用量和洗涤时间等措施,有效地去除了酚类、多糖、色素等物质的干扰,减少了褐化现象的发生.样品检测所得DNA片段均在48 kb左右,电泳谱带呈线状,无拖尾现象;紫外分光光度计检测,A260nm/A280nm值在1.7~1.9之间.RAPD扩增结果表明,此方法提取的DNA无论在质量和纯度上都较理想.     

稻蝗属基因组DNA提取方法

运用一种改进的方法对稻蝗属新鲜标本、酒精浸泡标本及干标本进行基因组 Ｄ Ｎ Ａ 提取．样品经检测,谱带基本呈线形,无拖尾, Ｏ Ｄ（２６０／２８０ ｎｍ ）值６６７％ 在１６～１８ 之间．     

杂交法检测重组乙型肝炎疫苗（汉逊酵母）发酵产物HBsAg外源基因拷贝数

以汉逊酵母宿主基因组DNA和发酵产物基因组DNA的相同MOX启动子的片断为特异性探针,用地高辛标记后,与固定在杂交膜上的宿主基因组DNA和发酵产物基因组DNA进行杂交并显色,根据显色深度来判定发酵产物中外源基因拷贝数的大小。结果表明,发酵产物中HBsAg外源基因拷贝数不小于30个。该方法检测灵敏度较好,特异性较强,操作较安全,可用于重组汉逊酵母发酵产物中HBsAg外源基因拷贝数定性检测。     

葛属植物基因组DNA的提取和纯化

采用SDS裂解法提取了葛属植物成熟叶片的基因组DNA,并利用凝胶纯化试剂盒进行了纯化。结果表明,该纯化方法有效,所获得的DNA可用于PCR反应。