不同血清型腺相关病毒在大鼠 DRG神经元转染效果的比较

摘要:目的 比较不同血清型腺相关病毒( AAV5、AAV6、AAV8 和 AAV9) 对背根神经节( DRG) 初级感觉神经元的转导效能。 方法 将 24 只雄性 SD 大鼠随机分为 8 组,分别通过 DRG 直接注射不同血清型腺相关病毒( AAV5、AAV6、AAV8 和 AAV9)载体,各组大鼠分别在转染后第 3 周和第 4 周取材,并在共聚焦显微镜下观测对大鼠 DRG初级感觉神经元的转染效果。 结果 组织切片的荧光结果显示,腺相关病毒各亚型的转染效果如下:转染 3 周,AAV9> AAV6> AAV8 > AAV5;转染 4 周,AAV9> AAV6> AAV8> AAV5。 其中,AAV9 载体对大鼠 DRG 神经元的转导效果较好。 结论 DRG 注射不同血清型腺相关病毒( AAV5、AAV6、AAV8 和 AAV9) 载体,AAV9 对 DRG 神经元的转导效能最佳。     

腺病毒相关病毒载体及基因治疗的研究进展

<正>自1990年首例ADA缺乏症患者施行基因治疗成功以来,该领域的基础和临床实验研究发展十分迅速。基因治疗的主要目的是将外源基因有效地导入宿主细胞内,并使之稳定表达,以达到治疗人类疾病的目的。 为了方便和有效地将此项技术应用于临床治疗,动物病毒载体介导外源基因的转移是目前应用的主要技术。早期研究和使用较多的是逆转录病毒载体。目前由于其存在着只能感染分裂复制期靶细胞;病毒滴度相对较低以及可能因同源重组产生野生型病毒而引起靶细胞恶性转化的潜在性等缺点,其应用相对受到限制。近年来,应用腺病毒(AV)或腺病毒相关病毒(AAV)作为载体的研究不断增加,尤其是     

光控超小型CRISPR/Cas经AAV载体递送实现对人基因组的高效编辑

CRISRP/Cas系统是目前广为使用的基因编辑工具，而腺相关病毒(AAV)也是目前最安全有效的基因治疗递送载体。为了实现AAV载体介导的CRISRP/Cas基因编辑，各种可装载于AAV载体的基因编辑工具也先后被报道。尽管如此，AAV载体介导的时空特异性基因编辑仍较难实现。为此我们结合光遗传学，将蓝光诱导表达系统、超小型CRISPR/Un1Cas12f1基因编辑系统以及AAV载体递送系统进行有机整合，开发出光控诱导表达的超小型基因编辑系统(AAV-PA-Cas12f1),并将其通过AAV递送至人源细胞HEK293T中。在无光条件下其表达背景极低，而经过蓝光诱导实现了对人基因组的高效基因编辑：以Intergene2为例，利用PCR产物-TA克隆结合单克隆测序分析得到该系统的实际编辑效率高达56%,编辑类型为碱基缺失或兼具碱基缺失与插入。此工具的开发为实现体内精准基因编辑奠定了基础，为解析更多生物学机制及探索疾病治疗策略提供了技术平台。     

绿脓杆菌外毒素A与Ⅱ型单纯疱疹病毒糖蛋白嵌合表达质粒的构建及其免疫原性的研究

构建外毒素结构域Ⅰ a基因(EPA103)与Ⅱ型单纯疱疹病毒糖蛋白(HSV-2-gD)嵌合蛋白表达载体(pET-EgD),得到嵌合表达蛋白.利用外毒素结构域Ⅰ a基因表达蛋白的佐剂效应,以pET-EgD表达嵌合蛋白免疫Balb/c小鼠.结果显示:嵌合表达蛋白(pET-EgD)免疫小鼠,可在小鼠体内诱导产生抗HSV-2特异性抗体.嵌合表达蛋白(pET-EgD)具有较强的免疫原性,为开发研究Ⅱ型单纯疱疹核酸疫苗奠定了基础.     

汉滩病毒嵌合基因G2S0.7重组腺病毒免疫学特性研究

对汉滩病毒糖蛋白 (GP)和核蛋白 (NP)的嵌合基因G2S0 .7重组腺病毒的免疫学特性进行研究。将汉滩病毒含有G2S0 .7嵌合基因的重组腺病毒直接免疫Balb/c小鼠 ,用ELISA、微量细胞培养中和实验及淋巴细胞增殖实验检测免疫应答效果 ,以研究嵌合基因的免疫效果。结果用该重组腺病毒免疫的小鼠 ,可诱导产生抗汉滩病毒NP及GP特异性的抗体 ,抗体效价分别为 1 :1 6 0及 1 :2 0。同时重组腺病毒还可刺激机体产生低水平的中和抗体和明确的淋巴细胞增殖反应。说明汉滩病毒嵌合基因G2S0 .7重组腺病毒 ,既可刺激机体产生特异性的抗汉滩病毒体液免疫应答 ,也可刺激机体产生特异性的细胞免疫应答 ,本研究为汉滩病毒基因工程疫苗的研究奠定了实验基础     

腺病毒介导的wtp53基因对五种癌细胞系的生长抑制作用

构建重组腺病毒载体 Ad CMVp53 ,将 wtp53分别导入 PG(人肺巨细胞瘤细胞 )、CAE(人结肠癌细胞 )、HCT(人结肠癌细胞 )、He La(人宫颈癌细胞 )及 BEL74 0 2 (人肝癌细胞 )五种癌细胞中 ,测定 Ad CMVp53对癌细胞的半抑制浓度 ( IC5 0 )和细胞生长曲线 ,分析不同组织癌细胞对 Ad CMVp53的敏感程度 .结果表明 ,Ad CMVp53对癌细胞具有与病毒剂量相关的明显致死作用 ,但不同细胞对腺病毒剂量的敏感程度有差异 ,PG、CAE和BEL74 0 2三个细胞系较为敏感 ,其 IC5 0 低于 1 5MOI(重复感染率 ,multipicity of infection) ;而 He La和 HCT细胞需要较高的病毒剂量 ,IC5 0 分别为 1 0 0 MOI和 80 0 MOI.     

利用昆虫病毒系统生产表达胰岛素的腺相关病毒

腺相关病毒(Adeno-associated virus-2,AAV-2)用于构建基因治疗病毒载体,在基因治疗领域受到了普遍重视和关注,而rAAV在应用过程中一个很重要的限制因素就是缺乏简单有效的大规模制备方法.运用昆虫细胞表达系统来提高AAV-2的产量,分别采用绿色荧光蛋白(GFP)和胰岛素(Insulin)基因替代AAV-2的结构基因后,与其他重组病毒共转染293t细胞,3 d后即可检测到高效表达的GFP和Insulin.结果表明,该方法能够比较理想地提高AAV的产量,为临床使用奠定了基础.     

结核分枝杆菌新型亚单位疫苗的初步研究

为了研发结核新型亚单位疫苗,以纳米颗粒为载体展示结核分枝杆菌主要抗原ESAT6.将ESAT6基因片段克隆到位于pGEX-4T-1载体上的诺如病毒P结构域的Loop2中,转入大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,用GST亲和柱纯化,并通过FPLC分析嵌合纳米颗粒的形成效率,最后免疫BALB/c小鼠进行免疫原性的评价.结果表明:研究成功地将ESAT6基因克隆至诺如病毒P结构域的Loop2中,且空间结构模拟提示ESAT6能展示在P纳米颗粒的表面. FPLC分析表明,表达的嵌合蛋白可以高效地自我组装成纳米颗粒.用该嵌合颗粒免疫小鼠后,能诱导产生针对ESAT6重组嵌合颗粒的特异性抗体.进一步分析发现,诱导的抗体主要针对ESAT6的51～70肽段,而不是1～20肽段.综上,研究通过诺如病毒P颗粒成功地展示了结核分枝杆菌主要抗原ESAT6,为进一步研发结核新型亚单位疫苗奠定了基础.     

腺病毒介导的RNA干扰降低VEGF受体FLT-1,KDR转录抑制血管形成

本研究用细菌内同源重组的方法构建了针对VEGF受体FLT-1,KDR的siRNA表达重组腺病毒Ad H1-siRNA/FLT-1和Ad H1-siRNA/KDR,感染HUVEC细胞,观察两种病毒对HUVEC细胞体外增殖和形成微血管的干扰作用.通过RT-PCR实验表明,Ad H1-siRNA/FLT-1和Ad H1-siRNA/KDR均可特异性地下调血管内皮细胞(HUVEC)中的FLT-1mRNA和KDR mRNA水平.与对照组相比,FLT-1的mRNA水平下降为40%,KDR的mRNA水平下降为52%.Ad H1-siRNA/FLT-1和Ad H1-siRNA/KDR对HUVEC细胞增殖均有干扰作用,加入病毒9 d后,对照组的细胞平均计数为31.5×104/μL,Ad H1-siRNA/FLT-1干扰病毒对照组为28×104/μL,Ad H1-siRNA/KDR干扰组为21.5×104/μL.Ad H1-siRNA/FLT-1和Ad H1-siRNA/KDR对HUVEC细胞在Matrigel上形成微血管均有干扰作用,对照组每HPF形成微血管数量为10.75条,Ad H1-siRNA/FLT-1干扰病毒对照组为10.25条,实验组Ad H1-siRNA/KDR每HPF形成微血管数量为7条.证明Ad H1-siRNA/FLT-1,Ad H1-siRNA/KDR均可干扰血管形成.     

汉滩病毒嵌合基因 G150.7 重组腺病毒免疫学特性研究

对本室已构建的汉滩病毒糖蛋白(GP)和核蛋白(NP)的嵌合基因GlS0.7重组腺病毒的免疫学特性进行研究.将汉滩病毒含有G1S0.7嵌合基因的重组腺病毒直接免疫Balb/c小鼠,用ELISA、微量细胞培养中和实验及淋巴细胞增殖实验检测小鼠的免疫应答效果.用该重组腺病毒免疫的小鼠,可诱导产生抗汉滩病毒NP及GP特异性的抗体,抗体效价分别为1:320及1:40.同时重组腺病毒还可刺激机体产生低水平的中和抗体和明确的淋巴细胞增殖反应.说明所构建的汉滩病毒嵌合基因G150.7重组腺病毒,可同时刺激机体产生特异性的抗汉滩病毒体液免疫应答及细胞免疫应答.     

关于农业区划地图集中的统一协调问题

图集的统一协调,对图集质量有很大影响。本文是作者在编制北京市农业区划地图集的实践基础上,根据地图信息传输论的观点,对农业区划地图集的统一协调的内容及方法进行了探讨。试图总结编制这类图集的统一协调模式,以供读者编图时参考。     

民间法正义观的转型

研究了国家法的抽象正义观与民间法的情理正义观,认为西方国家法的抽象正义观与东方民间法的情理正义观存在实质的不同,原因在于思维方式、超验与经验传统、政治结构的差别。在现代法治理念下,传统民间法所代表的正义观将向混合正义观转型,西方法治所代表的国家法抽象正义观是其骨架。     

“真空的真空”的存在性问题

许多科学家包括诺贝尔奖获得者李政道教授都预言,真空是未来物理学的一个重要研究对象.十七世纪的伽利略时代人们曾讨论过"真空"是否存在的问题.当时的学术界分成两派,一派以帕斯卡为代表,认为真空存在,另一派以笛卡尔为代表,认为真空不存在,最后实验证明"真空存在派"正确.现代研究表明,真空并非一无所有,这样就产生了一个新的问题"排除了真空物质后的空间",即"真空的真空"是否存在.本文探讨了与"真真空"有关的问题,提出了一些观测实验方法,这些方法可以帮助我们最终解答"真真空"的存在性问题.     

关于一维非自治时滞系统点态退化一例

给出了一维非自治时滞系统点态退化的一个例子,拓宽了该领域的研究。     

人-自观念演进的否定之否定

在人与自然界的关系的演进过程中,形成了与不同文明时期相适应的人-自观念。从＂天人合一＂到＂人定胜天＂再到＂和谐共生＂,这是人-自观念演进的肯定、否定、否定之否定的辩证发展过程,也是一个合乎规律的过程,它们都是时代的产物,都包含着不同程度的合理的因素,我们必须对它们进行具体的辩证的分析。     

行政机关违法设定许可的法律责任探析

对于行政许可违法的法律责任问题，人们往往是从行政许可实施违法的角度进行研究，而对于设定违法及其责任追究的探讨却相对薄弱。然而。行政许可设定一旦违法，其对相对人和社会公共利益的损害将会更大，因此，对许可设定的违法及其责任问题进行研究，以避免违法行政行为的发生，促进政府依法行政，不仅必要而且是非常有意义的。     

曲面"侧"概念的"参照物"理解法

曲面“侧”是一个重要而难以理解的概念,本文对曲面“侧”概念的讲授方法进行了探讨,给出了曲面“侧”概念的“参照物”理解法,通过实践证明,效果良好。     

老年人生活空间移动性影响要素研究进展

 老年人生活空间移动性是老年人在日常生活中能动生活状态的重要表征。在梳理老年人生活空间移动性相关概念、测度方法基础上,分析了物质环境要素和非物质环境要素对老年人生活空间移动性的影响;提炼出有效支持老年人生活空间移动性的中观环境规划、微观环境设计和政策文化扶助层面的策略;指出了老年人生活空间移动性的研究建议和发展方向。     

十二烷基苯硝化选择性的测定

利用对位异构体的对称性由核磁共振氢谱测定了工业十二烷基苯在硝硫混酸中的硝化选择性，发现一硝化产物中对位异构体的比例为７５％￣８０％。以月桂酸和苯为原料，经氯化、酰化和还原合成了正十二烷基苯。在同样条件下研究了正十二烷基苯的硝化，由核磁共振氢谱和气相色谱分析，发现一硝化产物中对位异构体的比例仅为６０％。根据空间位阻效应，对结果进行了讨论，并与甲苯，乙苯，异丙苯等短链烷基苯的硝化结果进行了比较。