汉滩病毒嵌合基因 G150.7 重组腺病毒免疫学特性研究

对本室已构建的汉滩病毒糖蛋白(GP)和核蛋白(NP)的嵌合基因GlS0.7重组腺病毒的免疫学特性进行研究.将汉滩病毒含有G1S0.7嵌合基因的重组腺病毒直接免疫Balb/c小鼠,用ELISA、微量细胞培养中和实验及淋巴细胞增殖实验检测小鼠的免疫应答效果.用该重组腺病毒免疫的小鼠,可诱导产生抗汉滩病毒NP及GP特异性的抗体,抗体效价分别为1:320及1:40.同时重组腺病毒还可刺激机体产生低水平的中和抗体和明确的淋巴细胞增殖反应.说明所构建的汉滩病毒嵌合基因G150.7重组腺病毒,可同时刺激机体产生特异性的抗汉滩病毒体液免疫应答及细胞免疫应答.     

汉滩病毒G1重组腺病毒的表达及其免疫学特性研究

将汉滩病毒(HTNV)囊膜糖蛋白G1重组腺病毒(Adeno-G1)感染VeroE6细胞,用IFA法检测其表达产物;并进一步将其免疫Balb/c小鼠。结果可检测到HTNV糖蛋白G1在VeroE6细胞中表达;用该重组腺病毒免疫小鼠,结果表明免疫小鼠体内可诱导产生抗汉滩病毒G1特异性抗体,同时微量细胞培养中和实验结果表明重组腺病毒还可刺激机体产生低水平的中和抗体,但淋巴细胞增殖反应不明显。说明Adeno-G1免疫小鼠后,主要刺激机体产生特异性的抗HTNV体液免疫应答,但刺激机体产生特异性的细胞免疫应答不明显,为HTNV基因工程疫苗的研究提供了实验基础。     

汉坦病毒CTL多表位重组腺病毒的构建及免疫学分析

目的：构建含汉坦病毒M基因（编码糖蛋白G1）和部分S基因（编码核蛋白主要抗原区段）以及S基因的多个 CTL表位的多种重组腺病毒表达载体,并对这些重组腺病毒的免疫学特性进行研究。方法：构建含目的基因的重组腺病毒载体,并对其表达产物进行鉴定。利用纯化后的重组腺病毒免疫BALB/C小鼠,通过多种免疫学方法检测其免疫反应。结果：成功表达出可被汉坦病毒核蛋白特异性单抗(mAb)及糖蛋白G1 的特异性单抗所识别的融合蛋白;重组的腺病毒可以有效刺激针对汉坦病毒NP及GP的免疫应答;同时结果表明在CTL多表位间加入间隔序列AAY的重组腺病毒免疫小鼠能产生更高的细胞免疫应答。结论： 构建的含CTL多表位的重组腺病毒可以有效的提高嵌合基因刺激细胞免疫应答的能力。间隔序列AAY对于各CTL表位的分隔有效地提高了重组腺病毒的免疫效果。     

汉滩病毒M,S基因不同拼接方式原核表达效果比较研究

为了比较汉滩病毒囊膜糖蛋白G1与核蛋白(NP)主要抗原位点片段不同拼接方式的原核表达效果，将汉滩病毒76—118株M基因编码G1的片段与S基因编码区5’端约O．7kb的片段连接，克隆入pGEX一4T2，构建嵌合基因原核表达栽体pGEX-4T2-G1S0．7，pGEX-4T2-S0．7G1，在大肠杆菌XLl一Blue中诱导表达GST—G1S0．7或GST—S0．7G1融合蛋白。经IPTG诱导后，ELISA活性测定结果表明，两种融合蛋白均可与抗汉坦病毒NP的mAb特异性结合，融合蛋白GST—G1S0．7还可与抗汉滩病毒糖蛋白的mAb特异性结合。Western blot结果显示，诱导出G1S0．7或S0．7G1与GST的融合蛋白，其中G1S0．7嵌合基因的表达产物降解较少。研究证明：两种拼接方式的嵌合基因均可在大肠杆菌中表达出有生物学活性的融合蛋白，但表达效果不同，为汉滩病毒基因工程疫苗的研究奠定了基础。     

大肠杆菌中融合表达汉滩病毒S,M基因片段的研究

为在大肠杆菌中融合表达汉滩病毒囊膜糖蛋白G1与NP含主要抗原位点的片段 .将汉滩病毒 76 118株S基因编码区 5′端约 0 .7kb的片段与M基因编码G1的片段连接 ,克隆入 pGEX 4T2 ,构建嵌合基因原核表达载体 pGEX 4T2 S 0 .7G1,在大肠杆菌XL1 Blue中诱导GST S0 .7G1融合蛋白的表达 .表达产物用ELISA和Westernblot进行鉴定 .限制性内切酶酶切鉴定证明 ,成功构建了嵌合原核表达载体 pGEX 4T2 S0 .7G1.经IPTG诱导后 ,ELISA活性测定结果表明 ,该融合蛋白可与抗汉坦病毒NPmAb特异性结合 .Westernblot结果显示 ,诱导出相对分子质量 (Mr)大于 1× 10 5的S0 .7G1与GST的融合蛋白 ,并有一系列大小不等的可与抗汉坦病毒NPmAb特异性结合的蛋白带 .获得具有特异性结合活性的融合蛋白GST S0 .7G1,为汉滩病毒基因工程疫苗的研制奠定了基础     

汉滩病毒囊膜糖蛋白g2基因重组腺病毒的构建与表达

获得汉滩病毒G2 基因 ,构建其重组腺病毒并在HEK2 93细胞中包装表达 ,为研究汉滩病毒基因疫苗提供了实验基础。设计引物采用PCR从含汉滩病毒 \|76 1 1 8株M基因的M5 6质粒扩增出糖蛋白G2 基因片段 ,并将其克隆入腺病毒载体Adeno XviralDNA ,筛选获得重组腺病毒DNA ,转染HEK2 93细胞 ,包装、扩增后得到汉滩病毒G2 基因重组腺病毒原种 ;并在感染细胞内初步表达 ,用ELISA检测表达产物。得到了含汉滩病毒G2 基因的重组腺病毒 ,其滴度约为 1 0 10 pfu/mL ,同时在感染的HEK2 93细胞中检测到汉滩病毒糖蛋白G2 的表达。含汉滩病毒糖蛋白G2 基因重组腺病毒的成功构建 ,为研究汉滩病毒基因疫苗提供了实验基础     

汉坦病毒G1S0.7嵌合基因真核载体的构建及表达

构建含汉坦病毒嵌合基因G1S0.7的真核重组质粒,并在真核细胞中有效表达.从本室前期构建并经测序的重组质粒pShuttle-G1S0.7上双酶切回收得到片段G1S0.7后,克隆入真核表达载体pVAX,并将其通过脂质体介导转染HEK293细胞,表达产物用ELISA和Western-blot进行鉴定.酶切鉴定结果表明,成功构建了含汉坦病毒嵌合基因G1S0.7的重组质粒pVAX-G1S0.7; ELISA检测结果和Western-blot结果显示,汉坦病毒G1S0.7嵌合基因在HEK293细胞中得到了表达,所表达的融合蛋白分子量约90kD,与预期大小一致,并且表达产物可与抗汉坦病毒NP mAb特异性结合.说明所构建的表达载体可在真核细胞中表达出与汉坦病毒抗体有特异性结合活性的融合蛋白,为下一步基因免疫及进一步筛选HFRS基因疫苗候选组分提供实验依据.     

以减毒猪霍乱沙门菌为载体的抗O型口蹄疫病毒重组活菌苗在家兔体内免疫应答的初步研究

将含有口蹄疫病毒疫苗基因的真核表达质粒pBO1经过中间宿主鼠伤寒沙门菌LB5010修饰后,电转化到减毒的猪霍乱沙门菌C500中,构建成抗O型口蹄疫病毒的重组活菌苗pBO1／S．cho．血清凝集实验验证,筛选到的转化菌仍然具有猪霍乱沙门菌的血清学特性,即具有免疫原性．采用口服方式免疫家兔,检测重组菌在家兔体内诱导的免疫应答．家兔免疫后8周,分离脾脏T细胞,检测T细胞增殖情况．结果显示,口服DBO1／S．fho的家兔T细胞在FMDV特异性抗原的刺激下有明显的增殖反应,刺激指数SI〉11;免疫后2周和8周分别取家兔静脉血,用液相阻断ELISA法检测血清中针对FMDV的特异性抗体,pBO1／S．cho组家兔产生的抗体效价为1／32。     

绿脓杆菌外毒素A与Ⅱ型单纯疱疹病毒糖蛋白嵌合表达质粒的构建及其免疫原性的研究

构建外毒素结构域Ⅰ a基因(EPA103)与Ⅱ型单纯疱疹病毒糖蛋白(HSV-2-gD)嵌合蛋白表达载体(pET-EgD),得到嵌合表达蛋白.利用外毒素结构域Ⅰ a基因表达蛋白的佐剂效应,以pET-EgD表达嵌合蛋白免疫Balb/c小鼠.结果显示:嵌合表达蛋白(pET-EgD)免疫小鼠,可在小鼠体内诱导产生抗HSV-2特异性抗体.嵌合表达蛋白(pET-EgD)具有较强的免疫原性,为开发研究Ⅱ型单纯疱疹核酸疫苗奠定了基础.     

淋巴囊肿病病毒主要衣壳蛋白1.3kb基因真核载体的构建及初步免疫

从LCDV1．3kb／pGEX-4T1质粒酶切获得LCDV1．3kb基因片段，构建重组真核表达质粒LCDV1．3kb/pcDNA3．1（＋）；并将其免疫BALB／c小鼠，用ELISA法检测免疫小鼠血清中抗LCDV抗体和IFN-γ。结果发现免疫小鼠可产生特异性抗LCDV抗体，平均效价为1：40，最高效价达1：320，但小鼠血清IFN-γ平均含量在30pg／mL左右，与阴性对照组无明显差异。结果表明，所构建的重组表达质粒LCDV1．3kb/pcDNA3．1（＋）免疫小鼠后可成功诱导其特异性体液免疫应答，但细胞免疫应答不明显，可能与所选载体、免疫动物种类及免疫方法有关，其具体原因有待于进一步探索。此研究为LCDV基因工程疫苗的研制提供了实验资料。